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Developmental Biology

Traduzindo a Purificação da Afinidade ribossófica (TRAP) para investigar o desenvolvimento raiz arabidopsis thaliana em uma escala específica de tipo de célula

Published: May 14, 2020 doi: 10.3791/60919
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Plant and Microbial Biology, University of Zurich, 2Biophore - UNIL, 3Laboratory of Cell and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Neuchâtel

Summary

Traduzir purificação de afinidade costela (TRAP) oferece a possibilidade de dissecar programas de desenvolvimento com processamento mínimo de órgãos e tecidos. O protocolo produz RNA de alta qualidade a partir de células direcionadas com uma subunidade ribossômica rotulada como proteína fluorescente verde (GFP). Ferramentas de análise a jusante, como qRT-PCR ou RNA-seq, revelam perfis de expressão específicos de tecido e célula.

Abstract

Neste artigo, damos instruções práticos para obter dados translatome de diferentes tipos de células radiculares Arabidopsis thaliana através do método de purificação de afinidade costelado (TRAP) traduzindo e preparação consecutiva de biblioteca otimizada otimizada.

Como material inicial, empregamos linhas de plantas que expressam a proteína ribossômica RPL18 com gfp de forma específica do tipo celular, utilizando promotores adequados. Antes da imunopurificação e extração de RNA, o tecido é congelado, o que preserva a integridade do tecido e permite simultaneamente a execução de estudos de séries temporais com alta resolução temporal. Notavelmente, as estruturas de parede celular permanecem intactas, o que é uma grande desvantagem em procedimentos alternativos, como abordagens baseadas em triagem celular ativadas por fluorescência que dependem de protoplasting tecidual para isolar populações celulares distintas. Além disso, nenhuma fixação tecidual é necessária como em técnicas baseadas em microdissecção de captura a laser, o que permite obter RNA de alta qualidade.

No entanto, a amostragem de subpopulações de células e apenas o RNA associado ao polisome severamente limita severamente os rendimentos de RNA. É, portanto, necessário aplicar métodos suficientemente sensíveis de preparação de bibliotecas para a aquisição bem-sucedida de dados pelo RNA-seq.

O TRAP oferece uma ferramenta ideal para a pesquisa de plantas, pois muitos processos de desenvolvimento envolvem vias de sinalização mecânica e relacionadas à parede celular. O uso de promotores para atingir populações celulares específicas está fazendo a ponte entre o nível de órgãos e células únicas que, por sua vez, sofrem de pouca resolução ou custos muito altos. Aqui, aplicamos TRAP para estudar a comunicação celular-célula na formação de raízes laterais.

Introduction

Impulsionada pela crescente aplicação de técnicas de sequenciamento de última geração, a resolução espacial na biologia do desenvolvimento poderia ser aumentada. Estudos contemporâneos visam dissecar tecidos para tipos de células especializadas, se não o nível de célulaúnica11,2,,3,4. Para isso, uma infinidade de métodos diferentes foi concebida ao longo dos últimos cinquenta anos (ver Figura 1A)5,6,,7,,688,99,10,,11,,12,,13,,14,15.

Muitas ferramentas em ciência vegetal têm sido adaptações de técnicas que foram pioneiras na pesquisa animal. Este não é o caso para o método que estamos introduzindo em detalhes aqui. Em 2005, equipado com uma forte formação em tradução de proteínas, o Laboratório Bailey-Serres começou a projetar proteínas ribossômicas para posterior purificação de afinidade16. Assim, poderiam evitar o demorado e intensivo em perfil de polisério, que se baseia na ultracentrifugação com um gradiente de sacarose e foi utilizado para avaliar ribossomos traduzidos desde a década de 196017,18. Desde então, o método foi referido como purificação de afinidade de ribossomos traláricos (TRAP)16. Após estudos bem-sucedidos de translatome em plantas, Heiman et al. adaptaram TRAP para animais19 e outros estenderam sua aplicação para leveduras20, Drosophila21, Xenopus22 e zebrafish23,24.

Embora a modificação genética do sistema modelo seja um pré-requisito para trap, que limita sua aplicação a espécies passíveis de transformação genética, pode-se simultaneamente aproveitar essa objeção para atingir subconjuntos de células que são de interesse especial e de outra forma extremamente difíceis de isolar do tecido/órgão intacto25 (por exemplo, células dendríticas altamente ramificadas em um cérebro de camundongos ou hifas fúngicas em tecido vegetal infectado). Nas plantas, todas as células são mantidas no lugar através de paredes celulares que formam a base do esqueleto hidrostático26. Para libertar uma célula vegetal dessa matriz, os cientistas cortaram fisicamente a célula de seu tecido circundante através da microdissecção de captura a laser (LCM)27 ou realizaram digestão enzimática das paredes celulares28. Entre as últimas células, os chamados protoplastos, a população de interesse é fluorescentemente rotulada e pode ser separada por meio da triagem celular ativada por fluorescência (FACS)7. O LCM geralmente requer uma amostra para ser fixada e embutida em cera, o que acaba por deteriorar a qualidade do seu RNA29. Os métodos baseados em FACS produzem RNA de alta qualidade, mas o processo de protoplasting em si introduz diferenças na expressão genética30 e tecidos com paredes de células secundárias modificadas e grossas são notoriamente difíceis de tratar. Além disso, muitos processos de desenvolvimento nas plantas são assumidos para contar com sinais mecanicamente transmitidos e, portanto, a integridade da parede celular é de suma importância31. Dois métodos, que utilizam um atalho para contornar o isolamento celular operando no nível de núcleos, são a triagem nuclear ativada por fluorescência (FANS) e o isolamento de núcleos marcados em tipos de células específicas (INTACT). Como no TRAP, eles usam promotores específicos do tipo celular para marcar núcleos, que posteriormente são enriquecidos através da classificação ou puxar para baixo, respectivamente8,15. Um grande desafio para todas essas abordagens é obter material de RNA suficiente de subconjuntos de células em um tecido. Como o TRAP captura apenas uma fração dos RNAs celulares, a coleta de amostras é um gargalo considerável. Portanto, protocolos especialmente sensíveis de preparação de bibliotecas são necessários para produzir dados de alta qualidade a partir de baixas quantidades de entrada.

Desde a sua criação, o TRAP tem sido usado em combinação com micromatrizes de DNA ou, como os custos de sequenciamento caíram significativamente nos últimos anos, RNA-seq10,32,33. Uma infinidade de questões de pesquisa já foi elucidada como revisada em Sablok et al.34. Estamos convencidos de que mais relatórios serão seguidos nos próximos anos, pois a técnica é muito versátil ao combinar diferentes promotores para atingir tipos específicos de células. Eventualmente, isso será feito mesmo de forma indutível, e pode ser combinado com a sondagem da reação da planta a muitos fatores de estresse bióticos e abióticos. Além disso, quando linhas transgênicas estáveis não estão disponíveis, sistemas de expressão raiz peluda também têm sido usados com sucesso para realizar TRAP em tomate e medicago35,36.

Figure 1
Figura 1: Traduzir purificação de afinidade de ribossomos (TRAP) complementa o portfólio de análise "ômica". A. O aumento dos níveis de precisão analítica, até a resolução unicelular ou mesmo subcelular, pode ser alcançado por uma infinidade de métodos ou combinações. O esquema dá uma visão geral das ferramentas disponíveis atualmente no campo vegetal e animal. A coleta de tecidos na resolução celular pode ser alcançada por protocolos como LCM ou FACS, que são então acoplados à transcrição padrão ou análise de perfil/tradução polisome. TRAP e INTACT integram tanto a captura de tecido quanto o isolamento do RNA, pois são baseados na marcação de epítopos. No entanto, intacto amostra apenas núcleos celulares e constitui, portanto, um caso especial de análise de transcriptome. Um pequeno ícone de coelho marca métodos recém-desenvolvidos no campo animal: Enquanto SLAM-ITseq e Flura-seq dependem da segmentação metabólica de RNAs nascentes com bases uracil modificadas em células que expressam a enzima permissiva, Slide-seq faz uso de um slide de vidro revestido com códigos de barras de DNA que fornecem informações posicionais na faixa celular. Uma abordagem de rotulagem de proximidade é seguida em APEX-seq para amostrar RNAs em compartimentos subcelulares específicos. Notavelmente, o aumento da resolução muitas vezes requer a geração de material transgênico (asteriscos) e esses métodos são, portanto, predominantemente utilizados para espécies modelo. Trap é especialmente adequado para estudos de ciência vegetal envolvendo parede celular (CW) ou sinalização mecânica, bem como espécies celulares que são difíceis de liberar de sua matriz CW. B. Etapas detalhadas do laboratório molhado do procedimento TRAP: As mudas que expressam proteína ribossômica marcada por GFP em tipos de células distintas (por exemplo, endoderme raiz) são cultivadas em placas de Petri por sete dias e o material raiz colhido pelo congelamento instantâneo. Uma amostra total de controle de RNA é coletada do extrato bruto homogeneizado antes de pelleting os detritos via centrifugação. Contas anti-GFP magnéticas são adicionadas ao extrato limpo para realizar a imunoprecipitação. Após a incubação e três etapas de lavagem, o RNA associado ao pórnio (Trap/Polysome RNA) é obtido diretamente através da extração de fenol-clorofórmio. LCM: microdissecção de captura a laser, FACS/FANS: célula ativada por fluorescência/classificação nuclear, APEX-seq: método baseado na engenharia de ascorbate peroxidase, INTACT: isolamento de núcleos marcados em tipos de células específicas, SLAM-ITseq: alquilação vinculada ao thiol(SH) para o sequenciamento metabólico de RNA no tecido, Flura-seq: sequenciamento de RNA com rótulo fluorouracil (Criado com Biorender.com) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O objetivo deste artigo é fornecer uma descrição detalhada do método TRAP, destacar passos críticos e fornecer orientação para um possível método de preparação da biblioteca.

Um experimento trap genérico consistirá essencialmente nas seguintes etapas (ver também Figura 1B): (1) Preparação de material vegetal incluindo clonagem de construção de marcação de ribossomos, produção e seleção de linhas transgênicas, crescimento e acúmulo de sementes, esterilização e revestimento, e aplicação/tratamento de estresse (opcional) e colheita de tecidos; (2) imunopurificação, incluindo homogeneização tecidual e limpeza do extrato bruto, lavagem de abelhas e imunopurificação, e etapas de lavagem; (3) Extração de RNA e avaliação da qualidade; e (4) preparação da biblioteca.

A raiz arabidopsis tem sido um sistema modelo para estudar o desenvolvimento de plantas desde sua introdução como uma planta modelo37,38. Aqui, a aplicação do TRAP é apresentada no contexto do desenvolvimento da raiz lateral vegetal. Nas plantas, o acúmulo de todo o sistema radicular depende da execução deste programa e, portanto, é muito importante para a sobrevivência do organismo39. Em Arabidopsis,as raízes laterais originam-se do tecido periciclo que reside ao lado dos vasos xilem e, portanto, é denominado periciclo do pólo xilem (XPP; ver Figura 2C)40. Algumas células XPP, que estão localizadas no interior da raiz, adquirem uma identidade celular fundadora e, sobre um gatilho hormonal local, começam a se proliferar por inchaço e divisão anticlinalmente41. No entanto, devido à presença de uma matriz de parede celular rígida, este processo exerce estresse mecânico nos tecidos circundantes. Em particular, a endoderme sobreposta é afetada, pois está no caminho do eixo de crescimento da raiz lateral42,43,44. De fato, o primordium recém-formado terá que crescer através da célula endoderme sobreposta (Figura 2C2), enquanto as células córtex e epiderme são apenas deixadas de lado para que o primordium finalmente emerja45,46. Trabalhos recentes em nosso laboratório mostraram que a endoderme está contribuindo ativamente para acomodar a proliferação no periciclo. O bloqueio direcionado da sinalização hormonal endodérmica é suficiente para inibir até mesmo a primeira divisão nas células XPP47. Assim, a comunicação periciclo-endoderme constitui um ponto de verificação muito cedo para o desenvolvimento da raiz lateral na Arabidopsis. No entanto, não se sabe como esse crosstalk é realizado. Para desvendar esse mistério, escolhemos a abordagem TRAP-seq para atingir células XPP e endodérmicas. Para enriquecer para as células no programa raiz lateral, imitamos o gatilho hormonal aplicando exogenously um análogo auxina (1-ácido naftalinacático, NAA)48, que ao mesmo tempo permitiu resolver temporalmente a fase inicial da formação da raiz lateral.

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Protocol

1. Clonagem de transgene, produção e seleção de linhas transgênicas

  1. Clone o promotor de escolha no vetor de entrada apropriado. Use um método de clonagem baseado em recombinação(Tabela de Materiais)e recombine os promotores em pDONRP4-P1r. Clone RPL18 (com etiqueta de afinidade ou proteína fluorescente de escolha) usando clonagem baseada em recombinação em pDONRP1-P249.
  2. Combine o vetor de entrada contendo RPL18 com o vetor de entrada contendo promotor em uma reação de recombinação de dois fragmentos no vetor de destino apropriado com o de seleção fast-red50 para facilitar a seleção direta de sementes transgênicas.
  3. Verifique o vetor recombinado sequenciando e transforme-o em agrobactérias adequadas e competentes. Molho de flores Plantas arabidopsis e após 3-4 semanas de colheita e selecione sementes T151.
  4. Use microscopia para identificar linhas bem expressas e verificar padrões de expressão de acordo com a atividade do promotor relatado em várias linhas independentes. Selecione linhas mostrando um padrão de expressão representativo com uma única inserção de T-DNA. Isso pode ajudar a minimizar o silenciamento e será vantajoso para as cruzes genéticas.
  5. Selecione a prole T3 que é homozigosa para o gene marcador.

2. Propagação e esterilização

  1. O TRAP específico do tipo de célula isola o RNA de um número limitado de células-alvo por raiz. Para gerar o material inicial necessário, propague linhas homozigosas. Para isso, utilize condições padrão de crescimento com foco especial no controle do crescimento fúngico.
    NOTA: Se as linhas de inserção únicas não puderem ser obtidas, cresça lotes em grandes populações ao longo de poucas gerações para evitar o silenciamento transgeracional induzido pelo T-DNA.
  2. Esterilizar grandes quantidades de sementes de Arabidopsis com uma rodada de gás cloro e uma rodada de 70% de EtOH.
    1. Espalhe as sementes uniformemente em placas de Petri quadradas de 12 cm x 12 cm (menos de 0,3 mL de sementes/placa) e empilhe-as em um dessecador ou outro recipiente adequado. Evite a formação de aglomerados ou pilhas, pois as sementes precisam ser acessíveis ao gás. Realizar esterilização a gás durante a noite com alvejante e volumes de HCl como relatado52: 100 mL de alvejante (13%) com 6 mL de conc. HCl em um dessecador de 60 L. Defumigate por pelo menos 1 h antes de coletar as sementes em um recipiente estéril.
      ATENÇÃO: 37% o HCl é altamente corrosivo e requer um manuseio cuidadoso. Gás cloro é tóxico, use uma capa de fumaça.
    2. Tome 0,1 mL de sementes secas e esterilizadas a gás por placa e misture-as com solução de esterilização (70% EtOH, 0,01% Tween) à temperatura ambiente. Incubar por 20 min, decante EtOH e lave as sementes 3-4 vezes com H2O estéril.
    3. Transfira as sementes encharcadas em tubos de 50 mL e diluir com ágar estéril de 0,1% para obter 1 mL de pasta de sementes absorvidas por placa (0,1 mL de semente/1 mL).
      NOTA: Devido a eventos de integração transgênica, as linhas das plantas podem ser suscetíveis a diferentes técnicas de esterilização; especialmente o tempo de incubação do EtOH foi considerado crítico. Em nossas mãos, as etapas duplas de esterilização foram necessárias para evitar a contaminação fúngica durante os experimentos. Isso é especialmente importante ao realizar séries temporsemifinaiss, pois a contaminação de um único ponto de tempo dificulta todo o experimento. Pode muito bem ser que a esterilização dupla nem sempre é necessária, dependendo das condições locais de crescimento.

3. Chapeamento

  1. Prepare essas etapas com antecedência. Despeje 1/2 placas de MS (pH 5.8) com 1% de ágar nas quantidades necessárias para o experimento (20-30 por amostra/ponto de tempo). Corte 1 pontas de pipeta de 1 mL para aumentar o diâmetro da ponta para cerca de 3-4 mm com uma lâmina de barbear. Autoclave as pontas. Crie um suporte de modelo para emplacar três linhas de sementes por placa com tampas quadradas da placa de Petri. Prepare uma capa de fluxo laminar para fornecer um ambiente de trabalho estéril e rotular as placas a serem processadas.
    NOTA: Se muitas placas forem processadas ao mesmo tempo, as etiquetas coloridas podem acelerar a rotulagem.
  2. Coloque as placas de ágar vazias no suporte do modelo e distribua 1 mL de sementes embebedantes uniformemente em três linhas. Coloque as placas processadas em pilhas no fluxo laminar até que as sementes estejam secas (ou seja, grude na superfície do ágar). Não deixe as placas por mais tempo, pois o ágar secará também.
  3. Uma vez que as sementes estejam suficientemente secas, feche as tampas e sele cada placa com fita microporosa. Estrate as sementes por dois dias a 4 °C no escuro e depois coloque-as em uma câmara de crescimento.

4. Tratamento tecidual (opcional)

NOTA: Neste protocolo, delineamos o tratamento exógeno das raízes arabidopsis com a variante auxin sintética NAA. Dependendo da questão experimental em questão, esta parte precisa ser ajustada ou pode ser totalmente omitida.

  1. Preparar tiras de papel de tecido de 1,5 - 2 cm de altura e 10 cm de comprimento. Tempos de incubação prolongados exigem que o tecido seja autoclavdo antes do uso.
  2. Remova a fita de microporos de todas as placas que têm que passar pelo tratamento hormonal. Diluir 1 mL de 10 mM NAA (dissolvido em DMSO) em 1 L de solução líquida, autoclaved 1/2 MS (pH 5.8) e absorver o papel de tecido na solução (10 μM NAA).
  3. Use uma pinça para aplicar uma tira de papel de tecido em cada linha de raízes. Use suavemente os dedos para remover bolhas de ar. Esvazie o excesso de líquido da placa, feche a tampa e rotule a placa com o tempo. Para tempos de incubação prolongados, coloque as placas de volta na câmara de crescimento.

5. Colheita

  1. Recupere as placas para cada réplica biológica/ponto de tempo/tratamento. Coletar nitrogênio líquido em um vaso Dewar limpo e tubos de etiqueta (15 ou 50 mL) para as diferentes amostras de tecido. Prepare um suporte de isopor.
    ATENÇÃO: Familiarize-se com os procedimentos de manuseio de nitrogênio líquido (aeração, queimaduras de gelo, tubos potencialmente explosivos).
  2. Abra a placa e remova o papel de tecido com fórceps, tomando cuidado para não separar as raízes da superfície do ágar. Com uma lâmina cirúrgica, corte uma vez por fileira ao longo da junção de raiz de tiro em um único e determinado golpe. Limpe as lâminas entre as amostras e troque com freqüência para garantir a nitidez.
  3. Com pinças, deslize ao longo das raízes de cada linha para recolhê-las em três pacotes. Pegue as raízes e esvazie-as em um tubo de 50 mL cheio de nitrogênio líquido para quebrar o congelamento.
    NOTA: Não tente montar raízes em estruturas densas (como bolas), pois são difíceis de moer na próxima etapa.
  4. Proceda com todas as placas que constituem uma amostra (na ordem dos tempos de incubação) e despeje o excesso de nitrogênio líquido. Use a tampa do tubo para evitar que as raízes derramem. Em seguida, feche a tampa e colete todos os tubos no navio Dewar. Armazene o tecido radicular a -80 °C.

6. Imunopurificação

NOTA: Esta etapa visa obter RNA TRAP/polisome de alta qualidade. Portanto, siga rigorosamente os conselhos de boas práticas para o manuseio de RNA. Realize todas as etapas desta seção em um banco estéril e limpe todos os equipamentos e labware com uma solução de remoção de RNase (Tabela de Materiais). Use luvas e troque-as imediatamente quando contaminadas com amostra, gelo ou outras fontes que não tenham sido limpas. Por se trata de um aspecto muito crucial, está incluída uma seção sobre o reaproveitamento de equipamentos, juntamente com a orientação sobre o descarte de resíduos.

  1. Preparação de buffer
    1. Preparar soluções de estoque de acordo com a Tabela 1 e autoclave (A) ou esterilização do filtro ().) Salvo especificação em contrário, o solvente é água livre de RNase.
    2. Dissolver e alíquotadititol (DTT), fluoreto de fenilmetilesulfonnil (PMSF), cicloheximida (CHX) e cloro-esfenicol (CAM) em seus respectivos solventes conforme indicado na Tabela 1 e armazená-los a -20 °C. Todos os outros estoques podem permanecer à temperatura ambiente.
    3. Pré-misture os estoques - com os ingredientes 1-4 para tampão de lavagem (WB) e 1-6 para tampão de extração de pórtico (PEB) - para evitar a mistura de tampão demorada antes de cada extração. Assim, adicione apenas água e os ingredientes congelados (7-10) no dia da extração. Mantenha os estoques pré-misturados e a água sem RNase a 4 °C.
      NOTA: A concentração de DTT é de 1/5 da concentração relatada de Zanetti et al. 2005, pois a interação de nanobody com o GFP é sensível a altas concentrações de DTT.
Ingredientes Concentração de estoque Adicionar volume em mL para 50 mL de WB* Adicionar volume em mL para 50 mL de PEB*
1 Tris, pH 9 Um 2 M 5 5
2 Kcl Um 2 M 5 5
3 EGTA Um 0,5 M 2.5 2.5
4 MGCl2 Um 1 M 1.75 1.75
5 Pte Um 20% (v/v) 0 2.5
6 mistura de detergente Um 0 2.5
Tween 20 20% (v/v)
Triton-X 100 20% (v/v)
Brij-35 20% (c/v)
Igepal 20% (v/v)
7 Tdt ₳ 0,5 M 0.1 0.1
8 PMSF ₳ 0,1 M (isopropanol) 0.5 0.5
9 Cicloheximida ₳ 25 mg/mL (EtOH) 0.1 0.1
10 Cloranfenicol ₳ 50 mg/mL (EtOH) 0.05 0.05

Tabela 1: Composição de buffer e conselhos de mistura. Ingredientes com as concentrações de estoque dadas misturadas nos valores dado rendem 50 mL de WB ou PEB. Tris: tris-(hydroxymethyl)-aminometano, EGTA: etileno glicol-bis(β-aminoethyl éter)-N,N,N',N'-tetra-acético ácido, PTE: Polioxietileno-(10)-tridecil éter, A: autoclave, *encha até 50 mL com água sem RNase.

  1. Homogeneização/moagem de tecidos
    1. Esfrie a centrífuga e coloque homogeneizadores e tubos de centrífuga no gelo. Descongele as alíquotas de DTT, PMSF, CHX e CAM. Misture PEB e WB das soluções de estoque em tubos de 50 mL de acordo com as exigências do dia (# de amostras) e esfrie no gelo.
      NOTA: Adicione PMSF pouco antes do uso, pois a meia-vida do PMSF na água é de apenas 30 min.
    2. Prepare bastante nitrogênio líquido em um vaso Dewar e recupere amostras de tecido de -80 °C de armazenamento. Use luvas de algodão sob as luvas de laboratório padrão para evitar queimaduras de morteiros frios. Despeje nitrogênio líquido em argamassas e pilões até que estejam frios o suficiente para permitir a moagem. Recomenda-se criar um sistema para distinguir argamassas (etiqueta ou manter em uma determinada ordem).
    3. Amostra de tecido vazio em uma argamassa e moer cuidadosamente até que todo o material seja um pó branco. Se necessário, adicione nitrogênio líquido para manter o tecido congelado ou para facilitar a melhor moagem.
    4. Adicione 5 mL de PEB à amostra e misture rapidamente com o pó antes que o tampão congele. Enquanto esta amostra descongela (misture-se de tempos em tempos) processa outra amostra.
    5. Assim que a mistura puder ser transferida, esvazie o chorume em um homogeneizador de vidro e mantenha no gelo. Com um adicional de 2 mL de PEB, enxágue a argamassa e o pilão e adicione-o à amostra no homogeneizador.
      NOTA: Evite uma amostra completamente líquida, pois isso permite a degradação do RNA.
    6. Triture o chorume manualmente até que o extrato seja homogêneo. Recomendamos um mínimo de 4 a 5 mergulhos.
      NOTA: Pode exigir algum tempo adicional de espera para permitir que o chorume descongele ainda mais. O manuseio de homogeneizadores requer alguma diligência. Não aplique força bruta e cuidado com as forças de sucção. Se não for levado em conta, isso levará ao derramamento, contaminação ou destruição do homogeneizador.
    7. Despeje o extrato de raiz bruta em um tubo de centrífuga de 50 mL (mantenha no gelo).
      NOTA: Normalmente, várias amostras podem ser moídas antes da transferência. É necessária a manipulação paralela da moagem, transferência e homogeneização. Tente trabalhar rapidamente, mas não se apresse; Fique calmo. Mantenha sempre amostras homogeneizadas no gelo.
  2. Coleta total de amostras de RNA
    1. Transfira as alíquotas de 200 μL de cada amostra bruta para um tubo de microcentrífuga limpo (rotulado e resfriado no gelo de antemão).
    2. Proceda com a extração de RNA conforme detalhado para amostras TRAP nos pontos 7.1 e 7.2. Faça essas etapas enquanto as amostras estão limpando na centrífuga.
    3. Realizar um tratamento de DNase com o RNA total resuspenso para eliminar a contaminação do DNA e limpar a reação usando um kit comercial (Table of Materials).
      NOTA: Extrações totais de RNA geralmente produzem altas concentrações e as amostras precisam ser diluídas consideravelmente. Recomendamos medir a concentração após a diluição pelo protocolo sensível do Qubit.
  3. Limpando o extrato bruto
    1. Pegue o balde de gelo com amostras de 6.2.7 e centrifuga-as por 15 min a 16.000 x g e 4 °C.
      NOTA: Para equilibrar a centrífuga, pareie as amostras em conformidade. Caso isso não seja inteiramente possível, ajuste uma amostra adicionando PEB.
    2. Despeje o sobrenadante em um tubo de centrífuga fresco (resfriado no gelo antes) e repita a centrifugação (15 min a 16.000 x g e 4 °C). Esta transferência pode ser realizada rapidamente ao lado da centrífuga.
    3. Enquanto o extrato bruto estiver limpando, inicie a lavagem das contas gfp para a etapa 6.6.
      NOTA: Mantenha este balde de gelo para balançar no agitador, mas não coloque de volta no banco estéril, pois pode estar contaminado.
  4. Lavagem de abelhas
    1. Alíquota magnética GFP-beads (#samples x 60 μL, Tabela de Materiais)em um tubo de 1,5 mL. Coloque no suporte magnético. Uma vez que as contas tenham coletado, remova o sobrenadante.
    2. Adicione 1 mL de WB frio, resuspenda as contas e colete-as novamente. Descarte o tampão de lavagem e repita mais uma vez com 1 mL de WB.
    3. Em última análise, resuspenda as contas em WB para o volume inicial usado na etapa 6.5.1.
  5. Imunopurificação (IP)
    1. Imediatamente após a centrifugação, despeje o sobrenadante limpo em tubos rotulados de 15 mL e adicione 60 μL de contas lavadas por amostra.
    2. Coloque todas as amostras horizontalmente no balde de gelo e coloque-as em um shaker. Deixe a mistura incubar por 2 h para ligar os pórissomos rotulados gfp às contas.
    3. Coletar as contas no suporte magnético para tubos de 15 mL (no gelo) e adicionar PMSF ao PEB restante. Descarte o sobrenadante. Despeje aproximadamente 5 mL de PEB nas contas e resuspenda-as inclinando-as. Agite as amostras por 15 min na mesma configuração da seção 6.6.2.
    4. Repita as lavadas com WB para um total de 3 lavadas (1 x PEB, 2 x WB). Antes de cada troca de buffer, adicione PMSF.
    5. Coletar as contas em 1 mL de WB e transferi-las para um tubo de 1,5 mL. Por fim, colete as contas mais uma vez no suporte magnético e remova todo o líquido. Feche o tubo e mantenha no gelo até que todas as amostras sejam processadas.
    6. Transporte as amostras para uma capa de fumaça para extração de RNA.
  6. Descarte de resíduos e recondicionamento de materiais de laboratório.
    1. Se realizado de acordo com a boa prática laboratorial (ver seção 2.2.1), o procedimento de esterilização produz uma solução NaCl aquosa. Deixe o gás cloro, bem como o HCl residual e alvejante, para defumigar na capa de fumaça.
    2. Disposição PEB e WB: À medida que o CHX se decompõe em pH alto, colete todos os líquidos e leve para pH>9. Descarte os resíduos líquidos nos resíduos químicos halogenados. Todos os sólidos (tecidos, pipetas sorológicas, luvas, etc.) devem ser descartados como resíduos químicos.
    3. Coletar líquidos contendo fenol separadamente, bem como material contaminado com fenol (pontas, tubos e luvas).
    4. Lave à mão argamassas, pestes e homogeneizadores (esponjas e escovas) com sabão e enxágue bem. Posteriormente, asse o material a >220 °C durante a noite. Enrole em papel alumínio antes do tratamento ou coloque em um recipiente coberto à prova de calor.
    5. Escove tubos de centrífuga limpos com detergente e, em seguida, dietilpyrocarbonato (DEPC) -tratar na capa de fumaça. Para isso, adicione o LÍQUIDO DEPC à água desionizada (1 mL de DEPC a 1 L de H2O) e misture via agitação. Coloque os tubos de centrífuga em uma bandeja autoclavável que captura água DEPC derramada. Despeje a suspensão nos tubos e deixe por 3 h ou durante a noite. O DEPC se decompõe no processo de autoclação subsequente.
      ATENÇÃO: O DEPC é altamente tóxico.

7. Extração de RNA e QC

  1. Extração de RNA
    1. Esfrie a centrífuga da mesa até 4 °C.
    2. Adicione 1 mL de reagente à base de ácido-guanidínio-fenol(Tabela de Materiais)a cada amostra, inverta-se para resuspender as contas ou o chorume total de RNA e incubar por 5 min no gelo. Não vórtice!
    3. Adicione 200 μL de clorofórmio e incubar por 3 min no gelo. Em seguida, completamente vórtice as amostras.
    4. Para ajudar na separação de fase, centrífuga no máximo. velocidade para 10-15 min, 4 °C.
    5. Rotular tubos de baixa retenção de 1,5 mL(Tabela de Materiais)e alíquota 650 μL de isopropanol em cada um.
    6. Pegue cuidadosamente a fase aquosa superior (ca. 650 μL) e transfira para os tubos preparados com isopropanol. Evite tocar na fase orgânica rosa.
    7. Precipitar RNA durante a noite a -20 °C.
      NOTA: Recomenda-se armazenar as amostras em isopropanol a -20 °C ou -80 °C e apenas solubilizar em água quando necessário. O RNA aquoso degrada-se mesmo a -80 °C quando armazenado por semanas/meses.
  2. Precipitação de RNA
    1. Esfrie a centrífuga da mesa até 4 °C.
    2. Prepare 80% de EtOH fresco com água sem RNase e esfrie a -20 °C (5 min a -80 °C ajuda a acelerar o processo).
    3. Centrifugar as amostras em velocidade máxima (cerca de 13.000 x g) por 30 min e descartar o sobrenadante. A pelota não será visível, tão cuidadosamente pipeta como se estivesse lá. Adicione 1 mL de frio 80% EtOH e inverta o tubo uma ou duas vezes.
    4. Centrifugar novamente por 30 min em velocidade máxima e repetir a lavagem para um total de duas lavos.
    5. Gire para baixo por 2 min e remova todos os EtOH residuais com uma ponta de 10 μL. Deixe a pelota secar por 3-5 min (não mais) à temperatura ambiente e resuspenda em água livre de RNase de 20 μL.
    6. Mantenha as amostras no gelo e realize o controle de qualidade o mais rápido possível. Proceda para armazenar as amostras a -80 °C. Evite ciclos de congelamento.
  3. Controle de qualidade utilizando equipamento dedicado (Tabela de Materiais) de acordo com as recomendações do fabricante.

8. Preparação da biblioteca

  1. síntese de cDNA e amplificação com o Kit De RNA de Entrada Ultra Baixa SMARTer v4
    1. Calcule a diluição de cada amostra para ter 1,5 ng de TRAP-RNA ou RNA total em um volume de 4,75 μL. Realize todas as reações em tubos de PCR e diluir amostras com alíquotas frescas de água livre de RNase.
    2. Realize todas as etapas de acordo com as recomendações do fabricante com 1/2 dos volumes de reação. Amplie o cDNA com ciclos PCR de 12 a 13.
    3. Limpe o PCR adicionando 0,5 μL de tampão de lyse de 10x e 25 μL de contas SPRI(Tabela de Materiais). Se muitas amostras forem processadas, o tampão de lyse e as contas podem ser pré-misturadas. Certifique-se de que as contas estão uniformemente dispersas antes de pipetting.
    4. Proceda com o protocolo em volumes de reação completos (17 μL de tampão de elução). Não deixe as contas secarem por mais de 3 minutos. Amostras sobresecas podem ser potencialmente resgatadas por tempos prolongados de incubação.
    5. Meça as concentrações da amostra com o kit de DNA Qubit HS.
      NOTA: O kit SMARTer v4 pode tolerar até 200 pg de entrada. Obtivemos bibliotecas nos casos em que os valores de Qubit não puderam ser determinados (abaixo de 250 pg, limite de detecção) com um PCR de 16 ciclos. No entanto, o material de entrada limitado também pode render bibliotecas menos complexas.
  2. Fragmentação e ligadura do adaptador PCR com o Kit de Preparação da Biblioteca de DNA Nextera XT
    1. Diluir o cDNA com água livre de RNase para obter uma concentração de 200 pg/μl e pipeta de 1,25 μL em um tubo PCR.
    2. Realize todas as etapas de acordo com o fabricante com 1/4 dos volumes de reação. Amplie o cDNA com 12 ciclos PCR e adaptadores compatíveis para as amostras que pertencem a um pool de sequenciamento. Com os Kits de Índice de Illumina A e D até 384 amostras podem ser multiplexadas.
    3. Para a limpeza do PCR adicione 12,5 μL de tampão de resuspensão e 22,5 μL de contas SPRI (razão de 0,9x). Eluir a amostra com 22 μL de tampão de elução.
      NOTA: O QC e o agrupamento foram realizados pela empresa de sequenciamento (Tabela de Materiais) e, portanto, não foi necessária a normalização baseada em bead. A reação de fragmentação enzimática (tagmentation) é muito sensível à entrada material, pois toda enzima corta apenas uma vez. Portanto, não exceda a recomendação de concentração.

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Representative Results

Para avaliação da qualidade, o procedimento acima mencionado deve ser sondado em várias etapas intermediárias: validação de padrão de expressão na planta, controle de qualidade do RNA polissômal oimosois isolado, bem como das bibliotecas finais. qRT-PCR usando genes marcadores conhecidos pode, além disso, ser realizado para confirmar a resposta à condição de tratamento ou para ajustar as condições experimentais.

Análise confocal da distribuição de sinal GFP
Para verificar os padrões de expressão endodérmico e XPP, analisamos linhas homozigosas de pELTP::GFP-RPL18 e pXPP::GFP-RPL18 por microscopia confocal. As figuras 2A e Figura 2B mostram plantas representativas com sinais GFP (verdes) que foram contrariadas com iodeto de propidium (magenta) para delinear paredes celulares. A seção transversal na Figura 2A1 mostra um anel concêntrico na terceira camada celular do lado de fora, que corresponde à endoderme. O sinal endodérmico de GFP inicia-se pouco acima da zona meristemática (Figura 2A2) e aparece tanto no citosol quanto ao redor dos núcleos das células, o que corresponde aos ribossomos. Em contraste, a linha XPP exibe dois pólos distintos, que correspondem ao XPP (Figura 2B1). Aproximadamente três células em cada pólo começam acima da zona meristemática para exibir um sinal GFP. Assim, ambas as linhas estão em conformidade com o padrão de localização da endoderme e xpp, respectivamente (Figura 2C)53.

Validação de RNA polisome
Para determinar a qualidade do RNA polisome obtido realizamos medições de controle de qualidade, utilizando dois sistemas automatizados de eletroforese (Tabela de Materiais) que trabalham com quantidades de entrada μL e também calculam um número de integridade de RNA (RIN)54. O algoritmo proprietário atribui um valor de RIN entre 1 e 10 a cada eletroferograma e é uma medida robusta e reprodutível para a qualidade do RNA (ou seja, degradação) - quanto menor o valor mais degradado é a amostra. A Figura 3 mostra exemplos das medidas que obtivemos do RNA polisome. A maioria das amostras apresenta quase nenhuma degradação aparente com valores de RIN variando de 9 a 10, o que está de acordo com os relatórios anteriores55,56. Qualquer manuseio inadequado, especialmente períodos de temperaturas elevadas prolongadas (por exemplo, temperatura ambiente) ou contaminação por RNase, seria evidente nesta fase. Ambos os instrumentos também calculam as concentrações amostrais de seus eletroferogramas(Figura 3A). Estes podem variar substancialmente e estão principalmente no limite de detecção mais baixo. Por isso, aconselhamos o uso de medidas fluorométricas para quantificar com precisão as concentrações.

Biblioteca QC
Como a maioria dos laboratórios não realiza o sequenciamento de RNA em casa, os controles de qualidade são frequentemente executados em instalações especializadas com dispositivos de alta qualidade(Tabela de Materiais). Eles avaliam rotineiramente a qualidade e quantificam as concentrações por ensaios qPCR e fluorométricos (Tabela de Materiais),pois medidas precisas são pré-requisitos para agrupamento de bibliotecas. No entanto, se a preparação da biblioteca não for terceirizada, pode-se amostrar o resultado com equipamentos especializados (Tabela de Materiais). A Figura 4 mostra traços de bibliotecas preparadas com sucesso com nosso protocolo recomendado (A) e destaca a robustez do procedimento apesar dos volumes de reação escalonados (B). A parte C ilustra amostras abaixo do padrão que podem resultar de super-/subfragmentação, perda de material durante a limpeza ou remoção mal sucedida do adaptador. Neste último caso, outra limpeza com uma proporção de amostras mais rigorosa pode ajudar a eliminar a contaminação. Amostras completamente falhadas eram extremamente raras em nossas mãos e poderiam se originar em vários pontos (por exemplo, entrada muito alta para a reação de tagmentação estoquiométrica).

O desempenho de bibliotecas sequenciadas é exemplificado na Figura 4DD para amostras da endoderme em nosso passado mutante. Bibliotecas de WT e/ou periciclo têm desempenho semelhante ou até melhor. As leituras ribossômicas foram, em média, em torno de 2% com poucas amostras acima de 3%. As leituras com pontuação média de qualidade acima de 30 foram consistentemente acima de 90% já antes da filtragem. A capacidade de mapeamento das leituras seqüenciadas foi igualmente alta, variando em média em 85%. Para determinar a correlação entre réplicas biológicas, os coeficientes de Spearman foram calculados para cada ponto de tempo. Todos os testes resultaram em altos valores de coeficiente.

Análise de resposta e enriquecimento do tratamento
Antes de produzir um conjunto de dados de abrangência de genomas, o TRAP RNA de um experimento piloto pode ser sondado por qRT-PCR para validar o sucesso do tratamento e/ou condições experimentais. Realizou-se este tipo de análise para avaliar as respostas auxinapós 2h de tratamento nas amostras de XPP (Figura 5A). Três diferentes genes auxin-responsivos (GH3.3, LBD29 e GATA23) foram testados através do método57. Indução muito forte foi observada em todos os três casos após o período de incubação, o que sugere que a aplicação exógena naa foi bem sucedida.

Se os promotores recém-desenvolvidos forem utilizados, deve-se, neste momento, também realizar análises de enriquecimento com qRT-PCR. Para isso, um gene marcador conhecido (ou seja, o gene impulsionado pelo promotor usado) é amplificado no TRAP e nos níveis totais de amostra e expressão de RNA normalizados ao nível total de RNA. Se o isolamento do Trap RNA do tecido específico foi bem sucedido, um aumento significativo da mudança de dobra deve ser obtido. Alternativamente, informações equivalentes podem ser recuperadas a partir dos dados de seqüenciamento (ver Figura 5B). A expressão de dois genes relacionados à suberina, GPAT5 e HORST, está presente em todas as amostras de endoderme e notavelmente ausente dos tecidos XPP. Pelo contrário, os genes expressos em periciclo (PHO1 e SKOR) são apenas muito humildemente expressos na endoderme e enriquecidos nas sondas XPP com uma regulação de down induzida por auxinil durante o período de tempo examinado.

Figure 2
Figura 2: Expressão específica do tipo celular de GFP-RPL18 na raiz arabidopsis. A-B. Imagens de microscopia confocal de pELTP::GFP-RPL18 (A) e pXPP::GFP-RPL18 (B) expressando raízes em seis dias após a germinação. Os contornos da parede celular foram obtidos através da coloração com iodeto de propidium (magenta). As seções transversais A1 e B1 são das posições denotadas com linhas tracejadas em A2 e B2, respectivamente. As últimas imagens mostram projeções máximas (MAX) das pilhas z registradas. C. Representação esquemática dos tipos de tecidos que compõem a raiz arabidopsis em longitudinal (C1) e transversal (C3), bem como em um primordium raiz lateral (C2). A imagem foi modificada com permissão de F. Bouché. Barras de escala: 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Avaliação da qualidade do RNA TRAP/polisome. A. Tapestation - O representante resulta de 14 amostras medidas na representação de imagem em gel com seus respectivos valores de RINe (canto superior esquerdo). A representação do eletroferograma é mostrada para a amostra A1 (destacada em azul). A tabela à direita informa sobre as concentrações da amostra. B. Traços semelhantes como em A são obtidos com o Bioanalyzer. Os painéis à direita mostram amostras com níveis crescentes de degradação, o que reflete em seus valores de RIN decrescentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Perfis de biblioteca de amostras TRAP/polisome. A. Duas amostras TRAP representativas (à esquerda) correspondem muito bem aos traços para bibliotecas bem sucedidas recomendadas pelo guia de usuário Nextera XT. B. Volumes de reação diferentes produzem resultados robustos de preparação da biblioteca. C. Bibliotecas com resultados subótimos: fragmentos muito curtos (canto superior esquerdo), fragmentos extremamente longos (inferior esquerdo), baixa concentração (canto superior direito) ou falha completa (inferior direito). Observe também fragmentos curtos residuais (elipse azul), que devem ser removidos antes do sequenciamento. Bioanalisador: traços vermelhos, LabChip: traços azuis. D. Medidas de qualidade selecionadas para amostras TRAP seqüenciadas (endoderme de nosso mutante lateral livre de raízes) em diferentes pontos de tempo e distribuição de coeficientes de correlação de Spearman calculados entre comparações parwise de todas as amostras dentro de um ponto de tempo (n=65). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: qRT-PCR e RNA-seq mostram auxin-responsividade e enriquecimento do tipo de tecido, respectivamente. A. Os níveis de expressão de três genes auxin-responsivos conhecidos foram avaliados após 2h de tratamento auxin via qRT-PCR. Foi observada forte indução em todas as amostras. O RT-PCR foi realizado em 3 réplicas biológicas independentes e normalizado às amostras não tratadas com UBC21 como gene de referência interna. As barras de erro representam o SEM. GH3.3: Gretchen Hagen 3.3, LDB29: LATERAL BOUNDARY DOMAIN 29, GATA23: FATOR DE transcrição de ligação gata-motivo 23, UBC21: Enzima CONJUGANTE UBIQUITIN 21 B. Níveis de expressão de quatro genes marcadores do conjunto de dados TRAP-seq. As amostras à esquerda são derivadas da endoderme (tons verdes), enquanto as amostras à direita são derivadas de XPP (tons azuis). Os números representam os intervalos de incubação auxin em horas. Os escores negativos de z refletem baixos níveis de expressão e vice-versa. Os genes dos marcadores endodérmicos(GPAT5, HORST)são expressos diferencialmente com altos níveis em amostras de endoderme. Pelo contrário, os marcadores de periciclo(PHO1, SKOR) têm altos níveis de expressão em células XPP e mostram baixa regulação no tratamento auxina. GPAT5: glicerol-3-fosfato 2-O-aciltransferas (biossintetizase de suberina), HORST: hidroxilase do tecido cenológico radicular, PHO1: fosfato 1, SKOR: stelar K+ retificador externo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Padrões de localização pUBQ10 não constitutivos::GFP-RPL18. Microscopia confocal de mudas de seis dias de idade. Os contornos da parede celular foram obtidos através da coloração com iodeto de propidium (magenta). As seções transversais A2 e C1 são das posições denotadas com linhas tracejadas em A3 e C2, respectivamente. Imagens marcadas max mostram projeções máximas das pilhas z registradas. A1-A3. Padrões de localização uniformes da construção orientada pelo UBQ10. B1-C2. Notável diminuição da força do sinal em camadas de tecido exterior. A, B e C são registrados em três plantas diferentes. Barras de escala: 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Verificação do padrão de localização RPL18
Crucial para evitar má interpretação dos dados de qualquer experimento TRAP é o padrão de expressão adequado da subunidade ribossômica marcada. Portanto, a incorporação do GFP como uma tag epítopoa ao RPL18 de forma muito elegante permite a verificação do padrão de expressão desejado e, consecutivamente, a retração da fração polisome do mesmo tecido. Abordagens mais invasivas para assegurar padrões de promotores adequados são seguidas por Jiao e Mayerowitz 2010, que requer staining GUS e em Tian et al. 2019 que se baseia em imunocoloração com anticorpos anti-FLAG58,59.

Aconselhamos fortemente verificar o padrão de localização em cada geração, pois as linhas transgênicas de T-DNA podem ser propensas a silenciar e, portanto, a força do sinal pode se deteriorar ou a proporção de sementes expressas diminui. Com a tag GFP incorporada no construto, esses controles freqüentes são facilmente realizados através de microscopia.

No entanto, mesmo uma análise confocal minuciosa pode, em alguns casos, levar a falsas conclusões. Gostaríamos de destacar isso com nossa tentativa fracassada de produzir uma linha TRAP de controle. Até agora, a comunidade científica vegetal não foi capaz de criar uma linha de plantas com uma distribuição RPL18 uniforme em todas as camadas celulares. Mesmo o promotor 35S inicialmente empregado foi atribuído a apenas mostrar distribuição "quase constitutiva" com um padrão de localização não uniforme10. Nossa abordagem foi usar o promotor da UBIQUITIN10 (UBQ10) para conduzir a construção GFP-RPL18. A triagem na geração T1 ofereceu localização muito promissora e, assim, foi escolhida para ser propagada (Figura 6A). No entanto, os dados de uma série de sequenciamento de teste não mostraram enriquecimento nas comparações entre linhas orientadas pelo ELTP- e UBQ10para genes específicos de endoderme conhecidos. Após uma inspeção mais minuciosa dessas plantas, de fato encontramos uma diminuição do sinal nas camadas externas dos tecidos, enquanto o tecido estela mostrou forte expressão(Figura 6B). Estudos futuros devem procurar o cenário do promotor em busca de candidatos mais adequados e complementar o método TRAP.

RNA total como amostra de controle
O estabelecimento de uma melhor linha de controle TRAP ainda está pendente e será altamente antecipado pelo campo. Com isso em mente, até agora a única maneira de obter uma distribuição uniforme de mRNAs em todo o tecido é coletar RNA total. Como, neste caso, um transcriptome é amostrado, isso precisa ser contabilizado na análise bioinformática posterior. Notavelmente, tanto as frações totais de RNA quanto de RNA polisome estão agora correlacionadas à medida que se originam da mesma amostra de tecido.

Em busca de um método de preparação da biblioteca TRAP
Como mencionado anteriormente, uma grande desvantagem da abordagem TRAP são os rendimentos variados e principalmente baixos que podem ser alcançados. Com amostras que variam de poucos ng a às vezes até 100 ng uma abordagem padrão com o kit Illumina TruSeq (requisito de entrada de 100 ng) foi julgada como muito insensível para a construção de bibliotecas de qualidade suficiente. Uma pesquisa de mercado revelou vários kits de preparação de bibliotecas disponíveis comercialmente, que foram especificados para trabalhar com material inicial de até 5-10 ng. Não testamos o protocolo utilizado por Reynoso et al. 2019, que trabalha para suas amostras TRAP de tomate, arroz e Medicago e utiliza a abordagem BrAD-seq60.

Todos os nossos testes, no entanto, com sequenciamento de teste subseqüente, produziram resultados insatisfatórios. Apesar do uso de etapas de enriquecimento poliA, as amostras TRAP sofreram de altas contaminações ribossômicas (até 30% das leituras). Além disso, a taxa de sucesso para a preparação da biblioteca foi variável e especialmente baixa para amostras com concentrações criticamente baixas ou valores de RIN relativamente menores. Nossos extensos testes nos levam à conclusão de que a composição específica de RNA de uma amostra TRAP, com conteúdo de rRNA muito alto e, presumivelmente, concentrações de mRNA minuciosas, requer uma abordagem mais sensível para obter bibliotecas confiáveis. Assim, recorreu a soluções de última geração para valores de entrada ultra-baixos: SMARTer v4 e Nextera XT. Reconfortantemente, Song et al. também encontraram esta abordagem de preparação da biblioteca para superar seus concorrentes quando testaram vários métodos e sua produção de sequenciamento no tecido hepático TRAPed61. As métricas de qualidade que apresentamos na Figura 4DD exibem leituras de alta qualidade (Q>30) a baixas taxas de mapeamento de rRNA (<3%) simultaneamente com altas taxas de mapeamento genético. Além disso, coeficientes consistentemente altos de correlação de Spearman mostram que as réplicas têm perfis de expressão muito semelhantes. O uso de ambos os kits foi simples com números de ciclo modestos e produziu resultados robustos e confiáveis. Os dados de sequenciamento foram de alta qualidade com material inicial de 1,5 ng. Com o kit SMARTer tolerando até 200 pg de entrada, a quantidade de material de partida da planta pode ser otimizada. A aplicabilidade para tipos de células mais raras será, em última análise, determinada pela viabilidade de acumular RNA suficiente.

TRAP complementa o kit de ferramentas de ciência vegetal
O método TRAP tornou-se cada vez mais popular entre os cientistas de plantas34 e estamos confiantes de que ele adquirirá o status de uma técnica padrão devido a várias razões.

Nenhuma das etapas do protocolo TRAP precisa de equipamento especializado, como uma máquina de triagem de células ou um microscópio dedicado de captura a laser, o que torna possível que muitos laboratórios realizem os experimentos. Até o momento, os fatores mais caros são a preparação da biblioteca e o sequenciamento a jusante. No entanto, com o avanço dinâmico das técnicas de sequenciamento de próxima geração e a crescente demanda por sequenciamento unicelular, prevemos que os custos diminuam significativamente.

Além disso, o isolamento das RNAs associadas ao polisome significa que as informações são coletadas sobre o status de tradução ativa dessas RNAs (translatome). Portanto, trap captura a saída de todas as etapas regulatórias que são a montante da tradução e representa um proxy mais direto para a composição da proteína celular. É claro que os ribossomos parados e as modificações pós-translacionais ainda permanecem evasivos e precisam ser abordados por outras abordagens (por exemplo, proteômica).

Como dito anteriormente, uma clara vantagem que a TRAP tem em um contexto vegetal é a preservação das estruturas cw e propriedades mecânicas das células. Como só começamos a entender as intrincadas conexões e funções regulatórias que surgem através da sinalização mecânica31,,62,abordagens que preservam essas estruturas se tornarão mais importantes em muitos contextos de desenvolvimento diferentes.

Especialmente para espécies modelo bem estabelecidas, trap pode lucrar com uma riqueza de diferentes promotores, que foram caracterizados. Em Arabidopsis,foi assim possível mapear toda a raiz de forma específica do tipo celular usando 19 diferentes promotores genéticos marcadores30,63. A cada experimento RNA-seq, essas seleções serão melhoradas e novos promotores mais específicos surgirão e refinarão a resolução celular.

O TRAP é adicionalmente aplicável em um uso combinatório com muitos promotores para populações celulares onde ainda não são conhecidos marcadores. É o caso de células especializadas na endoderme raiz. As chamadas células de passagem são caracterizadas pelo absense da camada de suberina que reveste células endodermes maduras53. A combinação de promotores adequados e subsequente na subtração sílica dos distintos perfis de expressão enriquecerá para regiões que abrigam células de passagem. A análise do repórter transcricional ajudará a identificar genes marcadores celulares de passagem. No entanto, resta determinar se o TRAP pode ser usado para analisar a população rara de células nesta base.

Neste artigo, fornecemos uma descrição detalhada do método de purificação de afinidade traduzir-ribossomos, suas vantagens e limitações, e destacamos suas aplicações potenciais. No portfólio de estudos de "omics", ocupa um nicho importante e ajudará a responder muitas questões biológicas.

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Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer a Jean-Claude Walser, do Centro de Diversidade Genética de Zurique, por conselhos cruciais de especialistas na fase inicial deste projeto. O trabalho no laboratório Vermeer foi apoiado por uma bolsa de professor do SNF (PP00P3_157524) e uma bolsa de equipamentos R'EQUIP (316030_164086) da Fundação Nacional de Ciência suíça (SNSF) concedida ao JEMV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterilization
bleach, 13% Sigma 71696
beaker VWR 214-1172/74/75
desiccator with porcelaine plate (DURAN) Sigma/Merck Z317454-1EA/Z317594-1EA
EtOH, p.a. Honeywell 02860-1L
HCl, 37% Roth 4625.1
Tween 20 Sigma P9416
Plate growth + harvesting
MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer Duchefa M0254
agar plant for cell culture Applichem/Panreac A2111.1000
DMSO Sigma D4540
forcepts Rubis Switzerland 5-SA model
KOH Fluka 60370
micropore/surgical tape 3M 1530-0
NAA Duchefa N0903
petri dishes 120x120 mm Greiner bio-one 688102
scalpel VWR/Swann-Morton 233-5454
tissues, neutral, two-layered any supplier of your choice
Immunoprecipitation
GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA Chromotek e.g. gtma-100
Brij-35 Sigma P1254-500G
centrifuge tubes (in accordance with centrifuge) Beckman Coulter 357001
Chloramphenicol Applichem C0378-25G
cotton gloves VWR 113-7355
Cycloheximide, HPLC grade Sigma 01810-1G
DEPC VWR E174 might have long delivery times
DTT Fluka 43815
EGTA Sigma 3054.3
homogenizers DUALL 23 KONTES GLASS CO (via VWR) SCERSP885450-0023 (set) SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times
Igepal CA-360 Sigma I3021-100ml
KCl Sigma 60130
MgCl2 hexahydrat Roth 2189.2
mortar and pestle VWR 470148-960 & 470019-978
PMSF Roche 10 837 091 001
Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE Sigma P2393-500G
RNase-free water Roth T143.3
RNAZap Thermo Fisher AM9780/AM9782 for cleaning surfaces
Tris, >99.3% Roth AE15.3
Triton X-100 Fluka T8787-250ml
Tween 20 Sigma P9416-100ml
RNA extraction
2-Propanol, p.a. Sigma 33539-1L-GL-R
Chloroform, HPLC grade Scharlau CL02181000
EtOH, p.a. Honeywell 02860-1L
low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml Eppendorf/Sigma Z666548-250EA LoBind
RNase-free DNase set Qiagen 79254
RNeasy MiniElute Cleanup Kit Qiagen 74204
TRIzol reagent ThermoFisher/Ambion 15596018
Library preparation
15/50 mL Tube Magnetic Separator Abraxis PN 472250
AMPure beads Beckman Coulter A63881
Index Kit A Illumina FC-131-2001
Index Kit D Illumina FC-131-2004
neodymium magnets Amazon/other 6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)
Nextera XT kit Illumina FC-131-1024/1096 https://emea.support.illumina.com/
PCR strips ThermoScientific AB-0266
SMARTer v4 kit Takara Bioscience 634892 https://www.takarabio.com/
Bioanalyzer Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument specialized equipment for RNA/DNA quality control
Tapestation Agilent 4200 Tapestation Instrument specialized equipment for RNA/DNA quality control
Fragment Analyzer Agilent 5400 Fragment Analyzer System specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
LabChip PerkinElmer LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
Qubit 4 Fluorometer ThermoFisher Q33239 specialized equipment for RNA/DNA concentration determination
qRT-PCR
GATA23 Microsynth fwd: AGTGAGAATGAA
AGAAGAGAAGGG;
rev: GTGGCTGCGAAT
AATATGAATACC
GH3.3 Microsynth fwd: CAAACCAATCCT
CCAAATGAC;
rev: ACTTATCCGCAA
CCCGACT
LBD29 Microsynth fwd: TCTCCAACAACA
GGTTGTGAAT;
rev: AAGGAGCCTTAG
TAGTGTCTCCA
UBC21 Microsynth fwd: TGCGACTCAGGG
AATCTTCT;
rev: TCATCCTTTCTT
AGGCATAGCG
SsoAdvanced Universal SYBR Green Bio-Rad #172-5270
iScript Adv cDNA Kit Bio-Rad #172-5038
miscellaneous
Falcon tubes 15 ml, Cellstar Greiner bio-one 188261
Falcon tubes 50 ml, Cellstar Greiner bio-one 210261
filter tips 1 ml Axygen TF-1000-R-S
filter tips 10 µl Axygen TF-10-R-S
filter tips 100 µl Axygen TF-100-R-S
filter tips 20 µl Axygen TF-20-R-S
filter tips 200 µl Axygen TF-200-R-S
microcentrifuge tubes 1.5 ml SARSTEDT 72.690.001
Propidium iodide Sigma P4170-100MG
sequencing company Novogene en.novogene.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologia do Desenvolvimento Edição 159 Arabidopsis TRAP TRAP-seq translatome perfil RNA-seq específico de célula formação de raiz lateral diferenciação de endoderme
Traduzindo a Purificação da Afinidade ribossófica (TRAP) para investigar o desenvolvimento raiz <em>arabidopsis thaliana</em> em uma escala específica de tipo de célula
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Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale. J. Vis. Exp. (159), e60919, doi:10.3791/60919 (2020).

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