Abordagem estereotática angular adaptável para técnicas versáteis de neurociência

Resumo

Descrito aqui é um procedimento estereotático que pode atingir regiões cerebrais desafiadoras e de difícil acesso (devido a limitações espaciais) usando uma abordagem coronal angular. Este protocolo é adaptável tanto aos modelos de camundongos quanto a ratos e pode ser aplicado a diversas aplicações neurocientíficas, incluindo implantação de cânulas e microinjeções de construções virais.

Resumo

A cirurgia estereotática é uma ferramenta essencial no laboratório de neurociência moderno. No entanto, a capacidade de atingir com precisão e precisão regiões cerebrais de difícil acesso ainda apresenta um desafio, particularmente quando se mira estruturas cerebrais ao longo da linha média. Esses desafios incluem evitar o seio sagital superior e o terceiro ventrículo e a capacidade de atingir consistentemente núcleos cerebrais seletivos e discretos. Além disso, técnicas de neurociência mais avançadas (por exemplo, optogenética, fotometria de fibras e imagem de dois fótons) dependem da implantação direcionada de hardware significativo para o cérebro, e limitações espaciais são um obstáculo comum. Apresentado aqui é um protocolo modificável para alvo estereotático de estruturas cerebrais de roedores usando uma abordagem coronal angular. Pode ser adaptado para 1) modelos de camundongos ou ratos, 2) várias técnicas de neurociência e 3) múltiplas regiões cerebrais. Como exemplo representativo, inclui o cálculo de coordenadas estereotáticas para direcionamento do núcleo ventromedial hipotalâmico do camundongo (VMN) para um experimento de inibição optogenética. Este procedimento começa com a microinjeção bilateral de um vírus associado ao adeno (AAV) codificando um canal de cloreto sensível à luz (SwiChR++) a um modelo de rato dependente de Cre, seguido pela implantação bilateral em ângulo de cânulas de fibra óptica. Usando essa abordagem, os achados mostram que a ativação de um subconjunto de neurônios VMN é necessária para respostas contra-regulatórias de glicose intactas à hipoglicemia induzida pela insulina.

Introdução

O controle neural do comportamento, da alimentação e do metabolismo envolve a coordenação de neurocircuitos altamente complexos, integrativos e redundantes. Um objetivo do campo da neurociência é dissecar a relação entre estrutura de circuito neuronal e função. Embora as ferramentas clássicas de neurociência (ou seja, lesões, injeções farmacológicas locais e estimulação elétrica) tenham descoberto conhecimentos vitais sobre o papel de regiões cerebrais específicas que controlam o comportamento e o metabolismo, essas ferramentas são limitadas pela falta de especificidade e reversibilidade¹.

Os recentes avanços no camp....

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde, o Guia de Cuidado e Uso de Animais e foram aprovados tanto pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) quanto pela Saúde e Segurança Ambiental da Universidade de Washington.

1. Cálculo de coordenadas angulares

1. Usando um atlas cerebral coronal, marque um triângulo retângulo para que a hipotenusa passe pela região alvo de interesse. No exemplo representativo(Figura 1),o núcleo ventromedial hipotalâmico (VMN) é direcionado a um ângulo de 15° da linha média coronal.
   NOTA: A colocação do eixo de rot....

Resultados

Este protocolo descreve um procedimento cirúrgico para a realização de estudos optogenéticos para interrogar o papel dos neurônios VMN hipotalâmicos no controle glicêmico⁹. A primeira utilização foi uma abordagem estereotática padrão (não angular) para a microinjeção bilateral de um vírus de canalrhodopsina inibitória para o VMN. Embora uma abordagem angular também seja adequada, a abordagem padrão (não angular) foi selecionada porque é suficiente para atingir a região do cérebro de interesse e é .......

Discussão

Os recentes avanços na neurociência têm apoiado a visão avançada e a compreensão sobre a atividade e a função dos neurociruques cerebrais. Isso inclui a aplicação de tecnologias optogenéticas e quimiéticas para ativar ou silenciar populações neuronais discretas e seus locais de projeção in vivo. Mais recentemente, isso incluiu o desenvolvimento de indicadores de cálcio geneticamente codificados (por exemplo, GCaMP, RCaMP) e outros biosensores fluorométricos (por exemplo, dopamina, norepinefrina) para o registro in vivo d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lentes dóricas	cânulas de fibra óptica	MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT	Sistema de
alinhamento estereotáxico Kopf modelo 1900 personalizável Kopf	modelo 1900		Kopf
modelo 1900-51 medidor de altura central	Kopf	modelo 1900-51
Kopf modelo 1905 indicador de alinhamento	Kopf	modelo 1905
modelo 1911 broca estereotáxica	Kopf	Modelo 1911
Kopf Modelo 1915 Escopo de Centralização	Kopf	Modelo 1915
Kopf Modelo 1922 Barras de orelha sem ruptura de 60 graus	Kopf	Modelo 1922
Kopf Modelo 1923-B Suporte de cabeça de anestesia a gás de camundongo	Kopf	Modelo 1923-B
Kopf Modelo 1940 Micro Manipulador	Kopf	Modelo 1940
Micro44 Sistema de Microinjeção	World Precision Instruments	--
Parafusos de osso de rato	Plásticos Um	00-96 X 1/16
Suporte de cânula estereotáxica, ponteira de 1,25 mm	Broca cirúrgica Thor Labs	XCL
Ponto	célula	Micro broca

de Kopf de científica ideal