Summary
Aquí se presenta un protocolo para evaluar la eficacia de la inhibición de los compuestos químicos contra el crecimiento intracelular in vitro de Toxoplasma gondii utilizando un ensayo de crecimiento basado en luciferasa. La técnica se utiliza para confirmar la especificidad de la inhibición mediante la eliminación genética del gen diana correspondiente. La inhibición de LHVS contra la proteasa TgCPL se evalúa como ejemplo.
Abstract
El toxoplasma gondii es un patógeno protozoario que afecta ampliamente a la población humana. Los antibióticos actuales utilizados para tratar la toxoplasmosis clínica son limitados. Además, exhiben efectos secundarios adversos en ciertos grupos de personas. Por lo tanto, el descubrimiento de nuevas terapias para la toxoplasmosis clínica es imperativo. El primer paso del desarrollo de antibióticos novedosos es identificar compuestos químicos que muestren una alta eficacia en la inhibición del crecimiento del parásito utilizando una estrategia de cribado de alto rendimiento. Como patógeno intracelular obligatorio, el toxoplasma sólo puede replicarse dentro de las células huésped, lo que prohíbe el uso de mediciones de absorbancia óptica como un indicador rápido de crecimiento. Aquí se presenta un protocolo detallado para un ensayo de crecimiento basado en luciferasa. Como ejemplo, este método se utiliza para calcular el tiempo de duplicación de los parásitos toxoplasma de tipo salvaje y medir la eficacia de morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl (LHVS, un compuesto de cisteína proteasa-targeting) con respecto a la inhibición del crecimiento intracelular del parásito. También se describe un protocolo de eliminación de genes basado en CRISPR-Cas9 en Toxoplasma que utiliza regiones homólogas de 50 bp para la recombinación dependiente de la homología (HDR). Al cuantificar las eficacias de inhibición de LHVS en parásitos de tipo salvaje y TgCPL (Toxoplasma catepsina L-como proteasa) -parásitos deficientes), se muestra que LHVS inhibe el crecimiento de parásitos de tipo salvaje de manera más eficiente que el crecimiento de la écpl, lo que sugiere que TgCPL es un objetivo al que LHVS se une en Toxoplasma. La alta sensibilidad y fácil operación de este ensayo de crecimiento basado en luciferasa lo hacen adecuado para monitorear la proliferación de Toxoplasma y evaluar la eficacia de los fármacos de una manera de alto rendimiento.
Introduction
El toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado de gran éxito que infecta aproximadamente un tercio de la población humana. Su alta tasa de transmisión se debe principalmente a sus diversas vías de transmisión, incluyendo el consumo de carne poco cocida, la exposición a los reservorios de mamíferos y la transmisión congénita durante el nacimiento. T. gondii provoca principalmente infecciones oportunistas que pueden conducir a una morbilidad y mortalidad graves en individuos inmunocomprometidos1,2,3,4,5,6. Los antibióticos utilizados actualmente para el tratamiento de la toxoplasmosis aguda son particularmente ineficientes en el tratamiento de infecciones congénitas y latentes y causan reacciones graves en algunos individuos3,7,8. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de identificar nuevas terapias. Comprender las diferencias en los procesos subcelulares dentro de Toxoplasma y su huésped ayudará a identificar posibles objetivos farmacológicos. Por lo tanto, se requieren técnicas de manipulación del genoma eficientes y convenientes para estudiar las funciones de los genes individuales dentro de Toxoplasma. Además, Toxoplasma pertenece al phylum Apicomplexa, que incluye varios otros patógenos humanos significativos, como Plasmodium spp. y Cryptosporidium spp. Por lo tanto, toxoplasma se puede utilizar como un organismo modelo para ayudar a estudiar la biología básica en otros parásitos apicomplexanos.
Para identificar nuevos antibióticos contra patógenos microbianos, se realiza inicialmente un cribado de alto rendimiento de una biblioteca de compuestos químicos para determinar su eficacia en la represión del crecimiento microbiano. Hasta ahora, se han desarrollado varios ensayos de crecimiento basados en microplacas para medir el crecimiento intracelular de T. gondii (es decir, cuantificación radiactiva basada en la incorporación de 3H-uracil9, detección cuantitativa de parásitos basada en ELISA utilizando anticuerpos específicos de T. gondii10,11, medición basada en proteínas de reportero utilizando cepas de toxoplasma 12,,13y un ensayo de imágenes de alto contenido desarrollado recientemente14).
Todas estas estrategias individuales tienen ventajas únicas; sin embargo, ciertas limitaciones también restringen sus aplicaciones. Por ejemplo, dado que el toxoplasma sólo puede replicarse dentro de células animales nucleadas, la autofluorescencia y la unión no específica de anticuerpos anti-T.gondii a las células huésped causan interferencia en las mediciones basadas en fluorescencia. Además, el uso de isótopos radiactivos requiere un cumplimiento de seguridad especial y posibles problemas de seguridad. Algunos de estos ensayos son más adecuados para evaluar el crecimiento en un solo punto de tiempo en lugar de un monitoreo continuo del crecimiento.
Aquí se presenta un protocolo basado en la luciferasa para la cuantificación del crecimiento intracelular del toxoplasma. En un estudio anterior, el gen NanoLuc luciferase fue clonado bajo el promotor de la tubulina Toxoplasma, y esta construcción de expresión de luciferasa fue transfigurada en parásitos de tipo salvaje (cepa dehúmúxtas RHku80)para crear una cepa deRH-ku80-hxg::NLuc (denominada RHku80::NLuc en adelante)15. Esta cepa sirvió como la cepa parental para la determinación del crecimiento intracelular y la eliminación de genes en este estudio. Usando elRH ku80::Cepa NLuc, el crecimiento del parásito en fibroblastos de prepucio humano (HHF) fue monitoreado durante un período de 96 horas después de la infección para calcular el tiempo de duplicación del parásito.
Además, la eficacia de inhibición de LHVS contra el crecimiento de parásitos se puede determinar trazando las tasas de crecimiento de Toxoplasma contra las concentraciones seriales de LHVS para identificar el valor IC50. La literatura anterior ha informado de que TgCPL es un objetivo importante de LHVS en parásitos y que el tratamiento con LHVS disminuye el desarrollo de infecciones agudas y crónicas por toxoplasma 16,,17,18,19. Además, RHku80::NLuc se utilizó como la cepa parental para la modificación del genoma para generar una cepa deficiente de TgCPL(RHs ku80ácpl::NLuc), y la inhibición de LHVS se midió contra este mutante. Al observar un cambio ascendente de valores IC50 para LHVS en los parásitos con deficiencia de TgCPLen comparación con la cepa WT, se validó que TgCPL está dirigido por LHVS in vivo.
En este protocolo, RHku80::NLuc se utiliza como cepa parental, que carece de una vía de unión final no homóloga eficiente (NHEJ), facilitando así la recombinación dependiente de la homología de doble cruce (HDR)20,21. Además, las regiones homólogas de 50 bp están flanqueadas en ambos extremos de un casete de resistencia a fármacos por PCR. El producto PCR sirve como plantilla de reparación para eliminar todo el origen genético a través de HDR utilizando herramientas de edición del genoma basadas en CRISPR-Cas9. Estas regiones homolometales cortas se pueden incorporar fácilmente en las imprimaciones, proporcionando una estrategia conveniente para la producción de la plantilla de reparación. Este protocolo se puede modificar para realizar la eliminación universal de genes y el etiquetado genético endógeno.
Por ejemplo, en nuestra publicación más reciente, tres genes de proteasa, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma catethepsin A B-like protease), y TgSUB1 (Toxoplasma subtilisina-like protease 1), fueron genéticamente ablados en TgCRT (Toxoplasma chloroquine-resistance transporter) -parásitos deficientes utilizando este método15. Además, TgAMN (a putative aminopeptidase N [TgAMN, TGGT1_221310]) fue etiquetado endógenamente15. El laboratorio de Lourido también informó utilizando regiones homoólogas cortas en el rango de 40-43 bp para la introducción de la mutación genética dirigida por el sitio y el etiquetado genético endógeno en el genoma de Toxoplasma utilizando un método similar22. Estas modificaciones exitosas del genoma sugieren que una región homóloga de 40-50 bp es suficiente para una recombinación eficiente del ADN en la cepa deficiente de TgKU80,lo que simplifica en gran medida la manipulación del genoma en Toxoplasma gondii.
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Protocol
El toxoplasma gondii se clasifica en el Grupo de Riesgo 2 y debe manejarse en un Nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2). El protocolo ha sido revisado y aprobado por el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad de Clemson.
1. Ensayo de crecimiento de Toxoplasma basado en Luciferasa
- Fibroblastos de prepucio humano de semilla (HHF) 1 semana antes de la inoculación del parásito para asegurar que las células huésped sean completamente confluentes. Realice un ensayo simulado en una placa transparente para asegurarse de que los parásitos permanezcan intracelulares durante todo el período de evaluación.
NOTA: Aquí, el ensayo se lleva a cabo en 96 microplacas de pozo. Según las necesidades experimentales, se puede escalar hasta 384 o 1536 microplacas de pozo. - Pasar los parásitos toxoplasma a los FHF confluentes 2 días antes de su uso mediante la transferencia de 0,3 a 0,4 ml de parásitos completamente lisados en un matraz T25. Incubar células huésped infectadas a 37 oC con 5% deCO2 durante 2 días.
- Jeringa de 5 ml de parásitos recién lisados a través de una aguja de seguridad de 21 G 5x para liberar parásitos intracelulares, luego pasa a través de un filtro de 3 m para eliminar los desechos de células huésped. Enjuague los parásitos residuales fuera del matraz usando 7 ml de medio D10 libre de fenol y, a continuación, pase a través del filtro de nuevo.
- Parásitos centrífugos a 1000 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT). Vierta el sobrenadante y resuspenda el pellet en 10 ml de medios D10 libres de fenol.
- Cuente los parásitos usando un hemocaquímetro para determinar la concentración.
- Diluir los parásitos a 1 x 104 parásitos/ml para la cepa de tipo silvestre (WT). Para cepas de parásitos con deficiencia de crecimiento, aumentar la concentración en consecuencia para observar un aumento significativo en las señales de luciferasa.
- Aspirar los medios cuidadosamente de 96 microplacas de pozo pre-sembradas con FFC e inocular 150 ol de resuspensión de parásitos en pozos en un formato de tres columnas y cinco filas, lo que representa tres réplicas técnicas y cinco puntos de tiempo.
- Incubar la microplaca a 37oC y 5%CO2 durante 4 h.
- Aspirar los medios cuidadosamente de los pozos para eliminar los parásitos no invasivos, a continuación, llenar los pozos con RT fenol rojo-libre de medios en cada fila (excepto para la primera fila).
- Mezclar volúmenes iguales de PBS y 2x tampón de ensayo luciferasa y diluir el sustrato de luciferasa a 12,5 m.
- Añadir 100 l de sustrato diluido de luciferasa en cada pocal de la fila superior. Incubar las microplacas a RT durante 10 minutos para permitir que las células se alimenten por completo.
- Mida la actividad de la luciferasa con un lector de microplacas. Los ajustes del lector de placas se enumeran en la Tabla 1. Cada lectura representa el número inicial de parásitos invasores a 4 h después de la infección.
- Repita los pasos 1.9-1.12 para cada fila cada 24 h durante 4 días sin cambiar el medio. Estas lecturas reflejan el número total de parásitos replicados a 24 h, 48 h, 72 h y 96 h después de la infección.
- Calcule las lecturas promedio en cada punto de tiempo y divídalas por las lecturas promedio a 4 h para determinar los cambios de pliegue en el crecimiento del parásito a lo largo del tiempo.
- Trazar los datos utilizando el software de gráficos. En la Figura 1A,Bse muestra una tabla de lectura de crecimiento representativa y parcelas de RHku80:: Los parásitosNLuc.
- Para calcular el tiempo de duplicación, trace los valores log2 de los cambios de pliegue en los puntos de tiempo individuales durante el tiempo de incubación. Utilice una función de regresión lineal para calcular la pendiente, que representa el tiempo de duplicación de cada deformación unitaria(Figura 1A,C).
2. Evaluación de la eficacia de la inhibición de compuestos químicos contra el crecimiento de Toxoplasma
NOTA: Aquí, la evaluación de la inhibición de LHVS en el crecimiento de Toxoplasma se presenta como un ejemplo. Se prueban ocho concentraciones diferentes de LHVS, y se realizan tres réplicas técnicas para cada una de las tres réplicas biológicas tanto para RHku80::NLuc como para RHku80cpl::NLuc strains.
- Antes de la infección por parásitos, semilla SFC a 96 microplacas de pozo en el formato de tres filas y nueve columnas para una réplica biológica por compuesto por cepa. Las células anfitrionas podrán crecer durante al menos 7 días antes de su uso.
- Pasar RHku80::NLuc y RHku80ácpl::NLuc parásitos durante 2 días antes de su uso. Siga los pasos 1.2-1.6 para la purificación y cuantificación de parásitos. Resuspender parásitos en medios libres de rojo fenol a 1 x 104 parásitos/ml.
- Aspirar los medios de una placa que contenga FHF confluentes e inocular cada pozo con 150 l de resuspensión del parásito. Incubar la microplaca a 37oC y 5%CO2 durante 4 h.
- Preparar LHVS a ocho concentraciones diferentes en un depósito de 12 poques por dilución en serie. Generalmente, las concentraciones se reducen por tres veces de forma de dilución en serie.
NOTA: La concentración más baja se reduce en 6.561 veces en comparación con la concentración más alta. El cambio de plegado de la dilución se puede ajustar en consecuencia en función de las diferentes propiedades de los compuestos individuales. - A 4 h después de la infección, aspirar medios para eliminar parásitos no invasivos y llenar cada pozo de las columnas 2-9 con 150 l de medios complementados con LHVS a diferentes concentraciones. Deje la primera columna llena de medio regular para servir como un control no tratado.
- Incubar la microplaca a 37oC y 5%co2 durante 96 h adicionales.
- Realice los pasos 1.9-1.11 y mida la actividad luciferasa de los pozos individuales.
- Promedio de las actividades de luciferasa de tres réplicas técnicas de los pozos de cada concentración individual de LHVS.
- Divida la actividad media de luciferasa para cada concentración de LHVS por la actividad media de luciferasa derivada de parásitos no tratados para calcular la actividad luciferasa normalizada como un porcentaje.
- Trazar las actividades de luciferasa normalizadas contra las concentraciones individuales de LHVS utilizando un software de gráficos(Figura 2). La inhibición de la pirimetamina contra el crecimiento del parásito también se mide como un control. La pirimetamina es un antibiótico clínico utilizado para tratar la toxoplasmosis aguda mediante la inhibición del metabolismo del ácido fólico en toxoplasma.
- Calcule los valores de IC50 para compuestos individuales utilizando el método integrado en el software de gráficos, respuesta normalizada frente a [inhibidor], bajo el programa de regresión "dosis-respuesta-inhibición". El IC50 se calcula utilizando la siguiente fórmula:
Y 100/(1 + X/IC50)
Dónde: Y representa las actividades de luciferasa normalizadas de las células infectadas bajo diferentes concentraciones de inhibidor, y X representa las concentraciones individuales de inhibidor.
3. Deleción de genes basada en CRISPR-Cas9 en parásitos toxoplasma
- Generación de una construcción plásmida que expresa ARN guía (sgRNA) y Cas9 para eliminar un gen de interés
- Vaya a www.ToxoDB.org y recupere toda la secuencia de codificación genética, incluidos los intrones y exons, junto con 1,5 kb 5'-UTRs y 3'-UTRs (regiones no traducidas).
NOTA: Aquí, TgCPL (TGGT1_321530) está dirigido como un ejemplo representativo. - Copie la secuencia TgCPL recuperada en el software de análisis de secuencia (consulte Tabla de materiales para el nombre y la versión) y etiquete las regiones 5'- y 3'-UTR.
- Seleccione el icono Herramientas en la barra de menús superior y, a continuación, seleccione Clonación . Encontrar SITIOS CRISPR.
- Elija 3'(Cas9)' para la ubicación del sitio PAM y seleccione la carpeta que contiene la secuencia del genoma de Toxoplasma en la sección de puntuación de especificidad. Deje el resto de la configuración como valores predeterminados.
- Elija un sgRNA con los siguientes dos criterios: 1) que muestre una puntuación de especificidad alta, generalmente >98%, y 2) que carece de una G después de la NGG, una secuencia de motivos adyacentes protoespaciales (PAM). El sgRNA seleccionado se encuentra generalmente en sitios cercanos al inicio y detención de los codones del gen de interés.
- Copie la secuencia del sgRNA seleccionado y péguelo en la siguiente plantilla de imprimación.
La parte en rojo representa la secuencia de sgRNA TgCPL seleccionada. Se puede reemplazar con diferentes sgRNA para varios genes de interés.
NOTA: Si el sgRNA seleccionado no comienza con G, agregue G al principio del sgRNA para ayudar a mejorar su expresión. - Realizar una reacción de PCR para modificar el plásmido preexistente que expresa el ARNNM (Figura 3A) que se dirige algen Toxoplasma uracilfosiltransferasa (TgUPRT) utilizando una premezcla de PCR con los ajustes proporcionados en el Cuadro 2.
- Ejecute el producto PCR en un gel de agarosa para confirmar la amplificación exitosa. Se espera que se amplíe un producto PCR de 10 kb(Figura 3B).
- Extraiga el producto PCR utilizando un kit de extracción de gel de ADN y orizarlo utilizando un kit de mutagénesis dirigido por el sitio. Consulte la Tabla 3 para ver la receta. Incubar la reacción durante 10-20 min a RT.
- Transforme el producto PCR circularizado en E. coli y elija 10 clones para una mayor verificación de la incorporación de sgRNA diseñado.
- Cultiva dos clones y extrae plásmidos. Corte los plásmidos purificados con BamHI y EcoRV. Los plásmidos candidatos producirán dos bandas a 2,4 kb y 7,2 kb(Figura 3C).
- Envíe los plásmidos para la secuenciación de Sanger utilizando imprimaciones inversas M13 para confirmar el reemplazo exitoso de sgRNA TgUPRT con el sgRNA diseñado(Figura 3D).
- Vaya a www.ToxoDB.org y recupere toda la secuencia de codificación genética, incluidos los intrones y exons, junto con 1,5 kb 5'-UTRs y 3'-UTRs (regiones no traducidas).
- Generación de plantilla de reparación para la eliminación de genes a través del mecanismo HDR
- De acuerdo con los sitios de destino del sgRNA seleccionado, localice 50 bp de 5'-UTRs o 3'-UTRs del gen objetivo para la recombinación dependiente de la homología (HDR, ver sección de discusión). La selección de regiones sigue los criterios enumerados a continuación, dependiendo de la ubicación en la que se dirige el ARNS SgRNA.
- Si el sitio de escote de Cas9 se encuentra aguas arriba desde el codón de inicio, seleccione lo siguiente: una secuencia de ADN de 50 bp aguas arriba del sitio de escisión como la región HDR izquierda y una secuencia de ADN de 50 bp aguas abajo del codón de parada como la región HDR derecha.
- Si el sitio de escote de Cas9 está entre los codones de inicio y parada, seleccione lo siguiente: una secuencia de ADN de 50 bp aguas arriba desde el codón de inicio como la región HDR izquierda y una secuencia de ADN de 50 bp aguas abajo del codón de parada como la región HDR derecha.
- Si el sitio de escote de Cas9 se encuentra aguas abajo del codón de la parada, seleccione lo siguiente: una secuencia de ADN de 50 bp aguas arriba desde el codón de inicio como la región HDR izquierda y una secuencia de ADN de 50 bp aguas abajo del sitio de escisión como la región HDR derecha.
NOTA: Para el gen TgCPL, el sitio de escote se encuentra entre los codones de inicio y parada. Por lo tanto, los siguientes imprimadores están diseñados para amplificar la plantilla de reparación utilizando pMDC64 como plantilla, que codifica un casete de resistencia a la pirimetamina. Las secuencias en negro anneal al plásmido pMDC64 para amplificación de PCR. Las regiones etiquetadas en rojo son secuencias específicas de TgCPLpara la recombinación homóloga.
- Realice el PCR utilizando una premezcla de PCR en las condiciones PCR descritas en el Cuadro 4.
- Ejecute el producto PCR en un gel de agarosa(Figura 3E),seguido de la extracción de gel y los procedimientos estándar de cuantificación de ácido nucleico.
NOTA: Si la banda esperada no se puede amplificar correctamente, optimice las condiciones de PCR y/o cambie los pares de imprimación.
- De acuerdo con los sitios de destino del sgRNA seleccionado, localice 50 bp de 5'-UTRs o 3'-UTRs del gen objetivo para la recombinación dependiente de la homología (HDR, ver sección de discusión). La selección de regiones sigue los criterios enumerados a continuación, dependiendo de la ubicación en la que se dirige el ARNS SgRNA.
- Toxoplasma transfección
- Pase RHku80::Parásitos NLuc durante 2 días en un matraz T25 que contiene HIF confluentes. Un matraz T25 de parásitos completamente lisados es suficiente para dos o tres transfecciones.
- Jeringa y parásitos de purificación de filtros como se describe en el paso 1.2. Resuspenda los parásitos en el tampón de citomezcla y gire hacia abajo a 1.000 x g durante 10 min a RT.
- Lavar los parásitos peletizaron con 10 ml de tampón de citomezcla y espíre los parásitos a 1.000 x g durante 10 min a RT.
- Vierta cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda los parásitos en el mismo tampón a una concentración de 1 x 108 parásitos/ml.
- Mezclar 2 g de ADN de la plantilla de reparación con 20 g de los plásmidos de expresión sgRNA/Cas9 (relación de masa 1:5, equivalente a una relación molar de 1:3). Si el rendimiento de amplificación de la plantilla de reparación es bajo, reduzca la entrada de ambas piezas de ADN en consecuencia. Se puede utilizar un mínimo de 0,5 g de plantilla de reparación.
- Mezclar 400 l de resuspensión de parásitos, ADN y 5 l de 200 mM de glutatión reducido (GSH) en un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Lleve el volumen total a 500 ol con tampón de citomezcla, si es necesario.
- Transfiera la mezcla de parásitos y ADN a una cubeta de electroporación (4 mm de ancho de brecha) y realice la electroporación (voltaje de 2 kV, resistencia de 50o) utilizando un aparato de electroporación.
- Transfiera parásitos electroportados a un matraz T25 que contenga HIF confluentes en medio D10 fresco. Aplicar antibiótico adecuado para la selección de medicamentos después de las 24 h.
- Mantenga la presión selectiva del fármaco hasta que el crecimiento de los parásitos transgénicos sea estable.
- Purificar el ADN genómico de la población eliminatoria y comprobar la integración del casete de resistencia a la pirimetamina en el locus TgCPL por PCR. Después de verificar, proceda a la sección 3.4. Si no es así, realice otra ronda de transfección de parásitos y selección de medicamentos. La incapacidad para detectar la correcta integración del casete de resistencia a los fármacos suele sugerir que el gen objetivo es esencial o que el locus genético no es accesible.
- Clonación de parásitos nocaut
- Semilla dos microplacas de 96 pocillos con células HFF e incubar a 37oC y 5%CO2 durante 1 semana antes de clonar parásitos.
- Pasar 0,3-0,4 ml de la población de parásitos transgénicos en un matraz T25 que contenga FHF confluentes y cultivarlos durante 2 días. Considere la posibilidad de pasar más parásitos si el mutante muestra defectos de crecimiento.
NOTA: Para lograr el mejor rendimiento y viabilidad, las células huésped están fuertemente infectadas por los parásitos, y la mayoría de los parásitos se mantienen en la etapa intracelular. - Células huésped infectadas por jeringas y parásitos recién lisados con filtro como se menciona en el paso 1.3. Resuspende los parásitos en el medio D10 y gíralos a 1.000 x g durante 10 min a RT.
- Resuspender los parásitos peletizares en 10 mL de medio D10.
- Cuente los parásitos usando un hemocitómetro para determinar la concentración del parásito.
- Realizar una dilución en dos pasos para llevar la concentración a 10 parásitos/ml en medio D10 complementado con el antibiótico adecuado. Por lo general, la resuspensión inicial del parásito se diluye por 1.000 veces, seguida de una segunda dilución a 10 parásitos/ml.
- Aspirar medios de microplacas de 96 pozos que contengan FHF confluentes e inocular 150 ol de parásitos diluidos en cada poca.
- Incubar placas a 37oC con 5% deCO2 durante 7 días sin perturbaciones para permitir la formación de placas. El período de incubación puede ser más largo si los parásitos transgénicos presentan defectos de crecimiento.
- Realice una pantalla de las placas con un microscopio de contraste de fase y marque solo los pocillos que contienen una sola placa.
- Realice la PCR de la colonia para identificar los clones correctos.
- Utilice puntas de pipeta para raspar la parte inferior de cada pozo para levantar las monocapas HFF infectadas.
- Pipet 75 l de la resuspensión celular de cada uno marcado bien en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Tubos de centrífuga durante 10 minutos a velocidad máxima a RT. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el pellet en 10,25 l de tampón de lisis que contiene tampón de dilución y aditivo de liberación de ADN proporcionado en el kit(Tabla de materiales).
- Incubar las muestras durante 4 min a RT, luego 2 min a 98oC. Después, las muestras se pueden utilizar para PCR o almacenarse a -20 oC hasta su uso. Se utilizan tres conjuntos de reacciones pcR para comprobar la integración del casete de resistencia a los fármacos y la pérdida del gen de interés(Figura 4A). Refiera al cuadro 5 para la configuración de la reacción PCR y a la tabla 6 para las configuraciones del termociclador.
- Identifique los clones correctos y transfiera cuatro clones a matraces T25 que contengan HIF confluentes.
- Después de que los clones individuales lisen las células huésped, purifique el ADN genómico para una mayor verificación de LA PCR.
- Si hay disponible un anticuerpo que reconoce la proteína de interés, siga un procedimiento de inmunoblotting estándar para verificar la pérdida de la proteína diana en los golpes correctos de Toxoplasma. En la Figura 4B,Cse muestran imágenes representativas para la detección de un mutante de eliminación de TgCPL.
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Representative Results
La Figura 1 representa un ejemplo de una curva de crecimiento para la tensión RHku80::NLuc y el cálculo derivado para su tiempo de duplicación. Generalmente, el ensayo se realiza en tres réplicas técnicas para cada una de las tres réplicas biológicas para tener en cuenta las variaciones de las lecturas de actividad de la luciferasa. Con el fin de calcular el cambio de pliegue normalizado del crecimiento del parásito, cada lectura a 24-96 h post-infección se dividió por la lectura inicial a 4 h post-infección, que refleja la cantidad inicial de parásitos vivos en el ensayo(Figura 1A,B). En términos de determinar el tiempo de duplicación del parásito, los valores log2 de los cambios de pliegue normalizados del crecimiento del parásito se trazaron contra cada punto de tiempo. A continuación, la gráfica se sometió a una función de regresión lineal para obtener la pendiente, que representa el tiempo de duplicación(Figura 1C).
Las eficacias de inhibición de LHVS en cepas de tipo salvaje yde cpl se determinaron trazando actividades de luciferasa contra ocho concentraciones de inhibidores en la Figura 2. Es esencial incluir células infectadas sin tratamiento inhibidor para la normalización de las actividades de luciferasa cruda en el ensayo. Además, se requiere un experimento simulado realizado en una microplaca transparente para que el ensayo garantice que los parásitos todavía están en la etapa intracelular al final del período del ensayo.
En la Figura 3,se muestra n.o de generación y validación de una construcción de expresión sgRNA destinada a TgCPL y la producción de una plantilla de reparación para la eliminación de TgCPL. El sgRNA de 20 bp que coincide con el gen TgUPRT codificado en el plásmido original fue mutado a la secuencia de ADN dirigida al gen TgCPL a través de mutagénesis dirigida por sitio basada en PCR. Para lograr esto, las secuencias de ADN que codifican para los sgRNA que reconocen diferentes genes fueron diseñadas para la imprimación hacia adelante, mientras que la imprimación inversa se mantuvo sin cambios para simplificar el diseño de imprimación.
La Figura 3A muestra una región ampliada de las secuencias de ADN del ARNS SgRNA dirigidas al gen TgUPRT en el plásmido de plantilla original, así como el conjunto de imprimación utilizado para la generación del vector de expresión sgRNA linealizado. La Figura 3B muestra una imagen de gel representativa del plásmido de expresión de sgRNA linealizado TgCPL. La Figura 3C muestra la restricción de la digestión endoucleasa del plásmido de expresión de sgRNA circularizado TgCPL. Se utilizó una imprimación inversa M13 para secuenciar el ARN guía incorporado dentro del vector de expresión sgRNA generado para el gen específico. En la Figura 3D, la región de ADN secuenciada se alineó con la plantilla plásmida para la confirmación de mutagénesis exitosa. La Figura 3E ilustra las regiones inicial y final del casete de resistencia a la pirimetamina, mostrando dónde los imprimadores pueden recocido para la producción de la plantilla de reparación para la eliminación del gen TgCPL. La plantilla de reparación fue PCR-amplified y cargado en un gel de agarosa 1% para la verificación del tamaño y la extracción de gel.
La estrategia general para la generación y cribado de taqueo de TgCPL se muestra en la Figura 4. Se utilizaron tres conjuntos de imprimaciones que se muestran en la Figura 4A para examinar los parásitos TgCPL-eliminación para la correcta integración de 5'- y 3'-ARMs y la eliminación de la secuencia de codificación TgCPL. Como se muestra en la Figura 4B,generalmente, se seleccionan de siete a ocho clones para su detección inicialmente. El cribado generalmente comienza con la comprobación de la eliminación de la secuencia de codificación para el gen de interés. Esto es seguido por la detección de 5' y 3'-ARMs, que ayuda a minimizar el número total de clones que se van a examinar. Se puede completar una verificación adicional mediante inmunoblotting que se muestra en la Figura 4C si hay disponible un anticuerpo que reconozca la proteína diana.
Figura 1: Cuantificación del crecimiento intracelular para parásitos Toxoplasma utilizando un método basado en luciferasa. (A) Lecturas de actividad de luciferasa en bruto en un software de hoja de cálculo. Las lecturas a 24 h, 48 h, 72 h y 96 h después de la infección se normalizaron contra las lecturas iniciales a 4 h después de la infección para calcular los cambios de pliegue en el crecimiento del parásito. (B) Los datos normalizados se promediaron y trazaron. (C) Los valores log2 de los cambios de pliegue también se trazaron y sometieron a regresión lineal para determinar el tiempo de duplicación del parásito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación de la eficacia de la inhibición de LHVS y pirimetamina utilizando el ensayo de crecimiento basado en luciferasa. Los parásitos fueron inoculados en una microplaca de 96 pozos durante 4 horas para permitir la invasión de las células huésped. Los parásitos no invasivos fueron lavados, y la placa se llenó de medios que contenían diferentes concentraciones de LHVS o pirimetamina e incubaron durante 96 horas adicionales antes de la determinación de la actividad luciferasa. Las lecturas de luciferasa medidas para parásitos tratados con concentraciones de inhibidores individuales se normalizaron contra la señal detectada por parásitos no tratados. Los datos se trazaron en un programa de gráficos y se realizó un análisis de regresión para la determinación de IC50. El ensayo se repitió en tres réplicas biológicas con tres réplicas técnicas cada una. Los datos representan la media: SEM, n a 3 réplicas biológicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Generación de la construcción plásmido que expresa sgRNA dirigida a TgCPL y producción de una plantilla de reparación para la eliminación de TgCPL. (A) El plásmido original pSAG1-Cas9-sgRNA-UPRT23 se modificó mediante un kit de mutagénesis dirigido por el sitio para la sustitución del sgRNA dirigido al gen TgUPRT a TgCPL. La región de codificación sgRNA se amplía para mostrar las áreas a las que las imprimaciones se retrasan. Después de la PCR, el plásmido mutado fue linealizado y cargado en un gel de agarosa del 1% para la verificación de la amplificación exitosa, seguido de la extracción de gel. (B) La imagen de gel de la construcción de expresión sgRNA linealizada amplificada por PCR. (C) Después de la extracción en gel, el producto PCR se circularizó y posteriormente se transformó en E. coli. Los clones que contenían los plásmidos esperados fueron examinados por la digestión endonuclea de restricción y la secuenciación del ADN. Los tamaños de las bandas después de la digestión del ADN fueron de 7,2 bp y 2,4 kb. La banda generada por el escote inespecífico de endonucleasas está etiquetada con asterisco. (D) La imprimación inversa M13 etiquetada en la figura se utilizó para secuenciar la región de ARN guía mutada dentro del vector de expresión sgRNA de destino TgCPLgenerado. La región de ADN secuenciada se alineó con la plantilla de plásmido para confirmar la mutagénesis exitosa. (E) En este estudio, las regiones homólogas de 50 bp que coinciden con los 5'- y 3'-UTRs de TgCPL fueron diseñadas en las imprimaciones para la amplificación de la plantilla de reparación y flanqueadas en los extremos 5'- y 3' del casete de resistencia a la pirimetamina por PCR, respectivamente. Se utilizó electroforesis de gel de agarosa para verificar el tamaño correcto del producto PCR antes de la extracción del gel. El tamaño esperado de la plantilla de reparación es de 2,7 kb. Por lo general, se pueden obtener 5-6 g de plantilla de reparación a partir de 200 l de reacción de PCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: PCR y confirmación inmunoblotting de parásitos con deficiencia de TgCPL. (A) Un diagrama esquemático que muestra las estrategias generales de TgCPL-eliminación en toxoplasma y cribado basado en PCR de los clones noqueadores de TgCPL correctos. Las imprimaciones utilizadas para el cribado están etiquetadas. (B) PCR y electroforesis de gel de agarosa se utilizaron para seleccionar clones que contienen la correcta integración del casete de resistencia a la pirimetamina en el locus TgCPL y la pérdida del gen TgCPL. El ADN genómico de la población decpl sirvió como un control positivo para la detección de 5' y 3'-ARM, mientras que el ADN genómico WT se utilizó para la detección del gen TgCPL como un control positivo. Se utilizó agua en lugar de plantilla de ADN en las reacciones de PCR para servir como un control negativo. Las bandas esperadas se indican mediante flechas, mientras que las amplificaciones de PCR no específicas están etiquetadas con asteriscos. (C) El clon 1 identificado por el cribado de PCR se cultivó en el cultivo de tejidos para la preparación de lisato celular y análisis de inmunoblotting adicionales para confirmar la pérdida de expresión de TgCPL en el knockout. TgActin se utilizó como control de carga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Luciferase: | Extremo |
| Tiempo de integración: | 1 s |
| Conjunto de filtros - Emisión: | Luz completa |
| Óptica: | Arriba |
| Ganar: | 135 |
| Velocidad de lectura: | Normal |
| Retraso: | 100 ms |
| Altura de lectura: | 4,5 mm |
Tabla 1: Ajustes del lector de microplacas para la medición de la actividad de la luciferasa durante el ensayo de crecimiento Toxoplasma basado en luciferasa.
| Desnaturalización inicial: | 98 oC durante 5 min |
| 25 ciclos de | |
| Desnaturalización: | 98 oC durante 5 s |
| Recocido: | 60 oC durante 15 s |
| Extensión: | 72 oC durante 1 min |
| Extensión final: | 72 oC durante 10 min |
Tabla 2: Configuración del termociclador para la generación del vector de expresión sgRNA.
| Muestra | Volumen (l) |
| Producto PCR (10-50 ng) | 1 |
| 2X KLD (quinasa, ligasa, DpnI) Búfer de reacción | 5 |
| 10X Mezcla de enzimas KLD | 1 |
| Agua libre de nucleasas | 3 |
| Total | 10 |
Tabla 3: Receta de reacción para la circularización del vector de expresión sgRNA.
| Desnaturalización inicial: | 98 oC durante 5 min |
| 35 ciclos de | |
| Desnaturalización: | 98 oC durante 15 s |
| Recocido: | 58oC durante 15 s |
| Extensión: | 72 oC durante 30 s por kb |
| Extensión final: | 72 oC durante 10 min |
Tabla 4: Configuración de termociclador para la generación de la plantilla de reparación.
| Muestra | Volumen (l) |
| ADN genómico total de Toxoplasma | 1 |
| Imprimación delantera (25 m) | 0.2 |
| Imprimación inversa (25 m) | 0.2 |
| 2x premezcla maestra pcR | 5 |
| Agua libre de nucleasas | 3.6 |
| Total | 10 |
Tabla 5: Receta de reacción de PCR de colonia para la detección de clones de Toxoplasma individuales.
| Desnaturalización inicial: | 98 oC durante 5 min |
| 35 ciclos de | |
| Desnaturalización: | 98 oC durante 5 s |
| Recocido: | 55 - 62 oC durante 5 s |
| Extensión: | 72 oC durante 20 s por kb |
| Extensión final: | 72 oC durante 1 min |
Tabla 6: Ajuste del termociclador para el cribado de clones individuales de Toxoplasma.
| Tampón Cytomix | HEPES de 25 mM, pH 7,6, 120 mM KCl, 10 mM K2HPO4/KH2PO4, 5 mM MgCl2, 0,015 mM CaCl2y 2 mM EGTA. |
| Medio D10 | DMEM 1X (Corning, Cat n.o: 10-013-CV), 10 mM HEPES, 10% (v/v) Cosmic Calf Serum (Hyclone, Cat n.o: SH30087.03), 1 mM de piruvato sódico, 4 mM de L-glutamina, 100 unidades/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomía. |
| Medio libre de rojo fenol | DMEM/ Altamente Modificado (Hyclone, Cat n.o: SH30284.02), 10 mM HEPES, 10% (v/v) Suero de becerro cósmico (Hyclone, Cat: SH30087.03), piruvato sódico de 1 mM, 4 mM de L-glutamina, 100 unidades/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina. |
| 2X NLuc Buffer | 100 mM MES, pH 6.0, 1mM CDTA, 0.5% Tergitol, 0.05% Mazu DF 204, 150 mM KCl, 1 mM DTT, 35 mM Thiourea. |
Tabla suplementaria 1: Recetas para búferes.
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Discussion
++Este protocolo describe un protocolo basado en la luciferasa para evaluar el crecimiento de Toxoplasma intracelular y evaluar la eficacia de inhibición de los compuestos químicos contra el crecimiento del parásito. En comparación con las estrategias existentes disponibles para medir el crecimiento de Toxoplasma intracelular, este método presenta alta sensibilidad y especificidad. Mientras se supervisa el crecimiento del parásito, se recomienda un ensayo simulado en una microplaca transparente de 96 pozos para confirmar que la cepa probada no se paraliza prematuramente las células huésped antes del final del período de evaluación. De lo contrario, las lecturas de luminiscencia no reflejarán con precisión el crecimiento del parásito, ya que Toxoplasma solo se replica dentro de las células huésped.
Se ha observado que el tinte rojo fenol calma rápidamente la actividad luciferasa, lo que puede resultar en diferencias significativas en las lecturas de la luciferasa entre las réplicas técnicas debido a un retraso en las mediciones individuales de pozos por el lector de placas. Por lo tanto, es óptimo preparar HIF en medio libre de fenol antes de la sembración en las microplacas de 96 pozos. También, en el caso de la alta actividad luciferasa, interferencia de pozo cruzado puede conducir a una variación significativa entre los pozos vecinos que exhiben fuerte actividad luciferasa. Por lo tanto, se recomienda colocar una columna vacía entre cada cepa.
Específicamente, para la variedadRH'ku80::NLuc, 1.500 parásitos se inoculan en cada pozo para el ensayo de crecimiento. Dado que el tiempo de duplicación de los parásitos de WT Toxoplasma es de 6-8 h24, se espera que vea un aumento en la actividad de la luciferasa de 8 a 16 veces a 24 h después de la infección. Sin embargo, ciertas cepas con defectos de crecimiento significativos sólo producirán un ligero aumento en la actividad luciferasa. Por lo tanto, si el inóculo del parásito inicial es bajo, la variación inherente en la actividad luciferasa enmascarará la observación de un aumento en la luminiscencia durante el período de crecimiento. Por lo tanto, se recomienda inocular un mayor número de parásitos para lograr un cambio de pliegue preciso para las cepas con deficiencias de crecimiento.
En el protocolo, el diseño del ARN guía sigue las reglas generales utilizadas para la modificación del genoma basado en CRISPR-Cas9 en células de mamíferos25. Actualmente, muchos tipos de software y plataformas en línea proporcionan servicios para el diseño de ARN guía en diversos organismos, como CHOPCHOP26,E-CRISP27y EuPaGDT28. Aquí, el software comercial(Tabla de Materiales)se utiliza para diseñar sgRNA. En comparación con los programas en línea mencionados anteriormente, este software proporciona un entorno local para el diseño de sgRNA. Calcula las puntuaciones de actividad y especificidad para cada sgRNA candidato utilizando un algoritmo publicado previamente25,29.
Técnicamente, cualquier sgRNA ubicado dentro de un gen de interés que contenga una puntuación de alta especificidad puede mediar eficientemente en la escisión del ADN genómico para la recombinación dependiente de la homología aguas abajo. En la práctica, se prefiere el sgRNA dirigido a una región cercana al codón de inicio o parada. Los genes de interés pueden ser endógenamente etiquetados con epítopos utilizando el sgRNA, que genera una brecha de doble cadena al final del gen. El etiquetado endógeno de un gen antes de su deleción ayudará a confirmar la pérdida de genes mediante la detección de inmunoblotting en el caso de que no se disponga de un anticuerpo contra la proteína de interés. El etiquetado de epítopos de un gen también puede ayudar a determinar la ubicación subcelular de la proteína de interés a través de la microscopía de inmunofluorescencia. Además, si el gen objetivo es esencial, el sgRNA que reconoce la región de inicio del gen se puede utilizar para reemplazar su promotor de cognato a un promotor sensible a la tetraciclina para generar un knockout condicional.
Además, el protocolo describe una técnica para la eliminación de genes en Toxoplasma reemplazando el gen TgCPL por un casete de resistencia a la pirimetamina. Mediante el uso de diferentes plantillas de plásmido que codifican otros casetes de resistencia a fármacos, los investigadores pueden modificar secuencias de imprimación para incorporar otros genes de resistencia a antibióticos en la plantilla de reparación a través de PCR. Además, este protocolo se puede modificar para realizar otras modificaciones del genoma, como el etiquetado genético endógeno, el reemplazo del promotor y la mutagénesis dirigida por el sitio. Cabe destacar que las regiones homólogas utilizadas en este protocolo son solamente 50 bp de longitud. Un estudio separado utilizó con éxito secuencias de ADN homólogas de 40-43 bp para introducir mutaciones de un solo nucleótido y etiquetado genético de epítopos en los parásitos Toxoplasma 22. Las secuencias de ADN homólogas en tan corta longitud se pueden incorporar fácilmente en las imprimaciones. Aunque no evaluamos cuantitativamente la eficiencia HDR para esta longitud particular de la región homóloga, parece que una región de 40-50 bp es suficiente para una recombinación eficiente del ADN en la cepa de Toxoplasma deficiente de TgKu80,como lo demuestra la exitosa manipulación genética de varios genes recientementealcanzados 15,,22.
Durante la determinación de la eficacia de los compuestos químicos, si el gen objetivo del fármaco prospectivo es esencial, no es práctica una comparación de los cambios en los valores de IC50 entre las cepas de tipo salvaje y eliminatoria. En este escenario, se requiere un ensayo que mida directamente la capacidad de los compuestos químicos para inhibir la actividad de proteínas recombinantes para evaluar la eficacia y especificidad de los fármacos. La literatura reciente informó de las puntuaciones de aptitud de los genes individuales en Toxoplasma mediante la realización de una pantalla CRISPR30de ancho genoma, que puede servir como guía para ayudar a evaluar la dificultad de generar un mutante noqueador directo para el gen de interés.
En conjunto, el protocolo describe la finalización exitosa de un ensayo de crecimiento de toxoplasma intracelular basado en luciferasa y una estrategia de evaluación de los inhibidores químicos contra el crecimiento del toxoplasma. También se detalla un protocolo de edición del genoma basado en CRISPR-Cas9 para la eliminación de genes en parásitos Toxoplasma, que ha sido ampliamente utilizado en el campo. Los laboratorios individuales pueden modificar el protocolo descrito de acuerdo con las necesidades experimentales, como el etiquetado genético endógeno, el cambio de marcadores de selección de fármacos y la alteración del período de evaluación para el crecimiento intracelular de parásitos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean dar las gracias a los Doctores Sibley y Carruthers por compartir los anticuerpos pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT y anti-TgCPL y TgActin. Este trabajo fue apoyado por el fondo Clemson Startup (a Z.D.), Knights Templar Eye Foundation Pediatric Ophthalmology Career-Starter Research Grant (a Z.D.), una subvención piloto de una subvención NIH COBRE P20GM109094 (a Z.D.), y NIH R01AI143707 (a Z.D.). Los funderos no tenían ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
References
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