肾类器官和类器官型培养的优化：促进血管化、延长发育及改善显微成像

摘要

本研究描述了两种用于研究器官发育的方法：一种是改进的禽类胚胎绒毛尿囊膜（CAM）异种移植体系，可实现培养的胚胎器官和类器官的血管化；另一种是新型的固定z轴方向器官培养方法，通过优化实验条件，可实现高分辨率的共聚焦显微镜延时成像。

摘要

胚胎肾类器官培养，尤其是由多能干细胞衍生的肾类器官，是研究肾脏发育过程和模拟肾脏疾病的理想工具。然而，这些模型受限于缺乏血管化和功能性。为解决这一问题，本研究改进了将细胞和组织异种移植至禽类胚胎绒毛尿囊膜（CAM）以实现血管化并恢复血流的方法。移植组织上覆盖有定制的微型储液装置，可将样本固定在CAM上，并持续提供培养基，防止移植物干燥。改进后的培养方法可使异种移植物存活并生长长达9天。本文还描述了如何利用先前发表的固定Z轴方向（FiZD）方法，为肾类器官和类器官型培养物的长期共聚焦成像提供最佳条件。该方法通过在大量培养基中，将胚胎器官或类器官轻柔地夹在盖玻片与膜之间，从而实现长达12天的高质量成像。上述两种方法结合使用，可实现肾类器官和类器官型肾组织培养的血管化与血流重建，并显著提升共聚焦成像效果。本文所述方法对于体外研究肾脏的基础与应用功能具有重要价值。这两种方法亦可广泛应用于多种类型的组织和类器官。

引言

几十年前，胚胎肾脏的器官型培养已成为研究肾发生的重要模型^1,2,3。肾脏类器官代表了一种先进的模型系统，可用于研究健康和病变肾脏的发育过程⁴。然而，这两种方法的主要缺陷在于均未能重现肾脏的核心功能：血液滤过。在肾脏类器官和器官型培养中，肾单位和肾脏脉管系统的发育过程与体内早期发育阶段相似；然而，体外形成的肾小球仍处于无血管状态⁵。离体胚胎肾脏和肾脏类器官的血管化此前仅在体内条件下通过移植实验得以实现。例如，将人多能干细胞来源的肾脏类器官移植至小鼠肾包膜下，可使其内的肾单位发育至具备功能的阶段⁶。

介于完全体外培养与体内移植方法之间的一种中间策略是将组织移植至禽类胚胎的绒毛尿囊膜（CAM）上。此前已通过该系统证实了完整的小鼠肾原基能够实现血管化^7,8。然而，研究也表明，异种移植后小鼠肾脏中的血管系统来源于宿主内皮，而非移植物本身⁹。这一发现显著限制了嵌合型（禽-哺乳类）胚胎肾脏模型在肾血管....

方案

动物护理和操作程序符合芬兰关于实验动物使用的国家立法、《欧洲实验和其他科学用途脊椎动物保护公约》（ETS 123）以及欧盟指令 86/609/EEC。

1. 在鸡胚尿囊膜上培养小鼠胚胎肾脏和肾类器官的微型储液器制备及异种移植实验的建立

1. 使用专为6孔板或12孔板设计的Transwell细胞培养小室。
   注意：根据具体实验需求，可使用大号或小号微型储液槽。当移植不超过八个胚胎肾脏，或在同一鸡胚（例如，在同一鸡胚CAM上同时放置实验组和对照组样本）上放置多个微型储液槽时，建议使用小号微型储液槽。
2. 使用装有圆锯刀片的旋转多用工具或手锯，将小室侧壁切短，制成一个高2 mm、底部带有可渗透膜的塑料环。
3. 用手术刀或锋利刀片修整这些微型储液槽的边缘，使其光滑。
4. 将微型储液槽置于70%乙醇中灭菌，时间不少于1小时。
5. 用高压灭菌的双蒸水清洗微型储液槽，并在超净工作台中晾干。
6. 用PBS缓冲液和培养基（高糖DMEM/10% FBS/1%青霉素-链霉素）冲洗微型储液槽。
7. 将储液槽置于培养皿中，膜面朝上，放置于一滴培养基（600 µL/400 µL）之上。
8. 借助移液器或玻璃毛细管，将分离好的离体胚胎肾脏或肾类器官均匀地排列在膜上，避免肾脏周围残留过多液体。
9. 将样本在37 °C、5% CO₂....

结果

本研究中展示的鸡胚尿囊膜（CAM）培养方案通过将肾类器官和胚胎肾异种移植到鸡胚CAM上，实现了高效的血管化（图1，视频1）。含有培养基的微型储液装置为供体组织提供营养，并在充分血管化前的阶段防止其干燥。该方法为供体来源的内皮细胞生长提供了适宜条件。因此，移植后肾脏和类器官中的肾血管系统主要（但并非完全）由供体特异性细胞构成（图2B、C、F）。与肾组织培养相比，移植至CAM的肾脏和肾类器官中获得了更为成熟的肾小球血管结构（图2D、E）。

FiZD-方案是一种用于对离体胚胎肾脏和肾类器官进行长期延时成像的方法，适用于高分辨率共聚焦显微镜。在Trowell设计的经典器官型培养方案¹⁴中，样品被放置在由金属网格支撑的多孔滤膜上，并维.......

讨论

本文介绍了两种详细方案，优化了经典的肾脏器官型培养方法，能够实现血管化、延长发育以及对离体胚胎肾脏和类器官进行理想的四维（即三维成像与时间）成像。本节重点阐述了方法中的关键步骤，并讨论了常见问题的解决方案。

其他CAM培养方法与这种改进的鸡胚CAM培养方法之间的显著区别在于，在将胚胎肾脏和肾类器官移植到CAM时，使用了定制的微型储液槽。改良的Transwell小室底部膜将样品紧压在鸡胚CAM上并固定其位置，小室的侧壁则作为培养基的储液槽，防止移植物干燥。强烈推荐将异种移植物接种于体外培养的鸡胚CAM，因为该方法可暴露更大面积的CAM，便于放置微型储液槽，并易于直观地观察血管化过程^12，13。

鸡胚尿囊膜（CAM）培养方法的一个缺点是，进行异种移植的时间窗口仅限于鸡胚尿囊膜发挥功能的第8至9天，之后尿囊膜开始退化。因此，需要更长时间发育的移植物应通过异种移植至其他组织（例如小鼠肾包膜）来实现血管化

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
可调式铲形钻头	Bosch	2609255277	用于钻取直径为 20 mm 的孔
自动鸡蛋翻转器	OLBA B.V., 荷兰	AT-42	用于卵外培养前的鸡蛋孵化
细胞培养箱	松下	13090543	温度设定为 37° C，湿度 90%，5% CO2
细胞培养箱	SANYO	10070347	鸡胚 CAM 培养专用培养箱。温度设定为 37° C，湿度 90%，5% CO2
Cellstar 6 孔板	Greiner	M9062	孔深 16 mm，与插入物匹配
Dremel 旋转工具用圆形锯片	Dremel	SC690
共聚焦显微镜	蔡司	LSM780
Corning Transwell 多孔板，带可渗透聚碳酸酯膜插入物	Corning	10301031	适用于 6 孔板。孔径 40 µm
锪孔钻头	Craftomat, Bauhaus	22377902	用于抛光（20.5 mm，1/4"，高速钢）
一次性玻璃毛细管	Blaubrand	7087 33
一次性手术刀	Swann-Morton	0501
解剖显微镜	奥林巴斯	SZ61
钻孔机	Bosch	GSR 18 V-EC Professional
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Sigma	D777	高糖
紧凑型 S84 鸡蛋孵化箱	Grumbach, 德国	8012	用于卵外培养前的鸡蛋孵化。温度设定为 38° C，相对湿度高于 60%
乙醇（70%）	VWR
受精鸡蛋	Haaviston Siitoskanala, Panelia, 芬兰		Hy-Line White 和 Nick Chick
胎牛血清	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
DUMONT #5 镊子	Dumont	#5SF
玻璃盖玻片	Menzel-Gläser	Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##	22x22 mm
Histoacryl 胶水	贝朗	1050052
Matrigel	Corning	356230
载物台培养箱	Okolab		Boldline，定制
PBS -/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Biowest	X0520-500	用于清洗微型储液槽
青霉素和链霉素	Sigma	P4333
聚苯乙烯微珠	Corpuscular	1000263-10	直径 70 µm
旋转多用途工具系统	Dremel	4000
电烙铁	Weller	TCP S	也可使用加热的玻璃毛细管
Thincert 12 孔细胞培养插入物，带 0.4 µm 孔径聚苯乙烯膜	Greiner Bio-One	665641
Thincert 6 孔细胞培养插入物，带 0.4 µm 孔径聚苯乙烯膜	Greiner Bio-One	657610