Summary
本文描述了研究器官发育的两种方法,一种是改善鸟类胚胎中胆囊膜(CAM)的异种移植设置,允许培养胚胎器官和器官的血管化,以及一种新颖的固定z方向器官培养方法具有改进的实验条件,允许高分辨率延时共聚焦成像。
Abstract
胚胎肾器官培养,特别是多能干细胞衍生肾器官,是跟踪发育过程和模拟肾脏疾病的绝佳工具。然而,由于缺乏血管化和功能性,这些模型受到限制。为了解决这个问题,开发了一种改进的方案,用于将细胞和组织移植到鸟类胚胎的胆囊膜(CAM),以获得血管化和恢复血流。嫁接上覆盖着定制的小型储层,将样品固定在CAM上,并为他们提供培养介质,防止移植物干燥。改进的培养方法允许异种移植物生长长达9天。手稿还描述了如何使用先前发布的固定 Z-方向 (FiZD) 方法,为肾器官和器官培养物的长期共聚焦成像提供最佳条件。该方法在大量介质中轻轻压缩玻璃盖玻片和膜之间的胚胎器官或器官,为长达12天的成像提供极好的条件。这些方法加在一起,允许血管化和血液流向肾器官和器官肾脏培养物,改善共聚焦成像。本文描述的方法对研究肾外活体的基本和应用功能非常有益。这两种方法都适用于各种类型的组织和器官。
Introduction
胚胎肾脏的有机体培养在几十年前11、2、32,3成为研究肾病的重要模型。肾器官代表研究健康及患病肾脏发展的高级模型系统4。然而,这两种方法的主要缺点是,这两种方法都没有概括肾脏的主要功能:血液过滤。肾管和肾血管在肾器官和器官培养中发展,类似于体内发育的早期阶段;然而,体外形成的球状物仍然是血管5。前活体胚胎肾脏和肾器官的血管化以前仅在体内条件下的移植实验中被证明。例如,在小鼠肾胶囊下移植人类多能干细胞衍生的肾器官,使器官中的肾素发育到功能阶段6。
纯体外培养体与体内移植方法之间的中间方法是对鸟类胚胎的CAM进行异种移植。血管化完整的小鼠肾原体已被证明以前使用这个系统77,8。8然而,也显示,异种移植的鼠肾中的肾血管质来源于宿主内皮,而不是移植9。这一观察大大降低了胚胎肾脏的嵌合体(鸟-哺乳动物)模型研究肾血管发育的潜力,因为实验条件对于供体源内皮细胞的生存是不许可的。
本议定书第一部分介绍了一种结合组织菌培养和异种移植的微环境条件,在禽蛋CAM上培育小鼠胚胎肾脏的改进方法。对以前方法的主要改进是,植入区域不是将小鼠胚胎肾脏和肾器官直接放在CAM上,而是覆盖着充满培养介质的渗透式小型储液罐,这些培养培养培养物为移植组织提供用营养,防止干燥。实验的成功率显著提高,供体血管发育条件得到改善。该方法在异种移植培养中的应用,导致由供体肾脏的内源内皮细胞组成的球状血管发育。
细胞形态发生的详细分析是肾脏培养模型的另一个重要应用。先前报道的肾脏培养的延时图像采集方法仅可用于分析胚胎肾脏的整体形态和模式,但不足以跟踪单个细胞10。最近,一种新型的固定Z-方向(FiZD)方法,旨在高分辨率共聚焦3D延时成像的肾器官和器官培养物被描述11。在这种方法中,在玻璃盖玻片和可渗透膜之间轻轻压缩器官和胚胎器官,在定制设计的板材中,直到样品厚度达到70μm,为成像提供最佳的光学条件。在方法的第二部分,描述了定制设计的板材的制造以及长期器官成像FiZD实验的设置的详细协议。
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Protocol
动物护理和程序符合芬兰关于使用实验室动物的国家立法、《欧洲保护用于实验和其他科学目的的脊椎动物公约》(ETS 123)和欧盟第86/609/EEC号指令。
1. 在鸡CAM上培养小鼠胚胎肾脏和肾器官的小型储液罐,建立异种移植实验
- 使用为 6 口或 12 孔板设计的跨孔细胞培养刀片。
注:根据特定的实验,可以使用大型或小型小型储层。最好使用小型小型储液罐进行异种移植,最多移植8个胚胎肾脏,或者当几个小型培养液被放置在同一鸡胚胎上时(例如,在同一鸡CAM上进行实验和控制样品)。 - 使用带圆形锯片或手锯的旋转多工具切割刀片的两侧,以创建一个 2 mm 高的塑料环,并连接一个渗透膜。
- 用手术刀或锋利的刀抛光这些小型储液罐的边缘。
- 将小型储液罐消毒为70%乙醇,至少1小时。
- 用自风化的双蒸馏水清洗小型水库,让它们在层压罩中干燥。
- 用PBS和培养介质冲洗小型储液罐(高葡萄糖DMEM/10%FBS/1%青霉素-链霉素)。
- 将储液罐放在培养介质的跌落(600 μL/400 μL)顶部,膜朝上。
- 在移液器或玻璃毛细管的帮助下,将解剖的外活体胚胎肾脏或肾器官均匀地排列在膜上。避免在肾脏周围留下大量的液体。
- 让样品在37°C和5%CO2的细胞培养培养箱中附着在膜上2~242小时。
注:在小刀片上可安排多达8个E11.5胚胎小鼠肾脏或肾器官。如果更大的胚胎组织片用于异种移植,或者用于CAM较大区域的细胞水凝胶混合物,则建议使用大刀片。 - 以8天大的前奥沃培养胚胎鸡,按照先前公布的方法从细胞培养培养培养箱中拿出12、13,13只。
- 将小型储液罐转移到 CAM,以便移植物面向 CAM,膜覆盖它们。将小型储液罐放在 CAM 的外围,使其不覆盖鸡胚胎。
注:当使用由转井插入器制成的 12 个孔板的小型小型储层时,一个 CAM 上最多可放置三个小型储液罐。 - 将 500 μL(6 口井插入)或 300 μL(12 井插入)添加到小型储层中。
- 在鸡CAM上培养样品,最多9天。每天更换小型储层中的培养介质。
注:移植后可尽快观察样品的血管化24~48小时。
2. 制造定制设计的板材和设置 FiZD 培养物
- 在 6 个井板底部钻 20 mm 直径的孔。
注:对于FiZD实验,使用6个井板,井深为16毫米(在材料表中指定)。 - 使用带反水槽钻头、手术刀或锋利刀的电钻对孔的边缘(尤其是上侧)进行抛光。
- 将板材消毒70%乙醇至少1小时。
- 用自风化的双蒸馏水清洗板,使其在无菌条件下干燥。
- 彻底清洗22毫米x22毫米玻璃盖玻片与70%乙醇或清洁他们根据公布的协议由Saarela等人11。
- 使用无毒组织胶水将盖玻片粘附到6个井板的孔的上侧。在孔周围涂上胶水,轻轻放置盖玻片盖住孔。让胶水干。
- 在立体显微镜下检查板,如果需要,从盖玻片表面去除多余的干胶。
注:检查盖玻片上方没有胶水,以确保样品均匀压缩。 - 将聚苯乙烯珠(70 μm 颗粒大小)与同等量的水凝胶混合。每口井的体积为50~100μL就足够了。
注:将水凝胶和聚苯乙烯珠的混合物放在冰上。 - 将转井插入物放在解剖显微镜下,将膜向上放置。
- 将样品(例如,前活体胚胎肾脏或肾器官)均匀地排列在膜上。
- 小心地将水凝胶/聚苯乙烯珠混合物添加到样品旁边,以避免损坏脆弱的组织。
- 翻转转井插入件,使装有样品的膜朝下。
- 轻轻地将插入物放入经过修改的 6 孔板的孔中,轻轻向下压压,以便将样品压缩到珠子的水平。
注:使用显微镜跟踪压缩过程。 - 用一只手将刀片稍微压到井上,并在刀片外围的三点用焊接熨斗熔化塑料,将其固定在板上。
- 当刀片固定在板上时,将2 mL的培养介质(DMEM/10% FBS/1%青霉素链霉素)添加到孔中,并继续以同样的方式组装板中剩余的孔。
- 将成品板转移到倒置显微镜的舞台培养箱,进行延时成像。
- 使用适当的实验设置对样品进行延时成像。
注:在延时实验期间,不需要更换板孔中的培养介质,但可以通过刀片两侧的孔轻松完成。
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Representative Results
此处介绍的CAM培养协议使肾器官和胚胎肾脏的高效血管化,由于鸡CAM的异种移植(图1,电影1)。含有培养基的小型储层向供体组织提供营养,并在适当血管化前的一段时间内保护其不干燥。该方法为供体源性内皮细胞的生长提供了宽松的条件。因此,移植肾脏和器官中的肾血管主要由供体特定细胞(图2B、C、F)代表。"CF在移植到CAM的肾脏和肾器官中,比在肾器官培养物中获得更成熟的球状血管(图2D,E)。E
FiZD-协议是一种使用高分辨率共聚焦显微镜对活体胚胎肾脏和肾器官进行长期延时成像的方法。在Trowell14设计的经典有机培养协议中,试样被放置在多孔过滤器上,由金属网格支撑,并保存在空气-液体界面(图3A)。对于直立式或倒置型显微镜,此方法都不是最佳方法。此处介绍的方法经过专门设计,可采用倒置显微镜进行成像。样品在下面的玻璃盖玻片和透孔插入孔的多孔膜之间固定(见上图3B)。膜和盖玻片之间的最优距离为±70 μm。聚苯乙烯珠用作垫片,将试样厚度设定在此范围内(图3B)。
没有商业上可用的 6 个井板,其中玻璃盖玻片位于井底的上表面。因此,为制造具有此功能的定制设计的板开发了一个协议(图3B)。图4显示了胚胎肾脏培养的代表性形态(图4A、D+F)D和肾F器官(Figure 4A图4B、C)。CMovie 2表示在 FiZD 设置中培养小鼠胚胎肾脏的内皮细胞的高分辨率延时成像结果。Movie 2中的右侧面板演示了可以使用此方法观察单个单元格的分布和迁移。
图1:将胚胎肾异种移植到鸡胚胎CAM中。E11.5胚胎小鼠肾脏异种移植成8天大的外野鸡胚胎;在CAM上培育了7天的鼠胚胎肾。比例尺 = 200 μm。请点击这里查看此图形的较大版本。
电影1:在异种移植到鸡胚胎CAM后,鼠胚胎肾的血流。一只鼠E11.5胚胎肾脏被异种移植到8天大的鸡胚胎的CAM中,培养了7天。这部电影显示鸡血流在异种移植在第7天。请点击此处查看此视频。(右键单击以下载。
图2:鸡胚胎CAM上的毛体胚胎肾异种移植。Murine E11.5 胚胎肾脏(m)被培养为有机培养(即对照)或异种移植到8天大的胚胎鸡CAM(c)(即实验)。经过5天的胚胎肾脏培育,对照和实验样本被固定并染色为内皮标记CD31(红色)(A+E)和核(Hoechst;蓝色)(D,E)。 (C) 鸡和小鼠血管之间的阿纳托莫(箭头)。(D,E)显示了从肾上的中间的单个共聚焦切片。(F) 对鼠 E11.5 胚胎肾脏异种移植到转基因 GFP-鸡 CAM 7 天,染色为 CD-31(红色)。刻度柱 = A=B 100 μm;C-E 20 μm;F 50 μm.请点击这里查看此图的较大版本。
图 3:固定 Z 方向区域性方法。(A) 传统文化方法,即样品生长在电网支持的多孔膜上,并将外植器放在空气-液体界面上。(B) 在新的 FiZD 设置中,样品在玻璃盖玻片和透孔多孔膜之间被轻轻压缩。聚酯珠控制以 z 方向调整的样品的厚度。这个数字是从萨雷拉等人11号修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4:胚胎肾和肾器官发育中采用新的FiZD培养方法。胚胎肾脏 (A, D+F) 和肾脏器官 (B+C) 是使用新的 FiZD 设置培养的.(A) 在FiZD文化的第7天,一个完整的胚胎小鼠肾脏的布莱特菲尔德图像。(B) 在FiZD培养的第7天,一个小鼠肾脏器官的布莱特菲尔德图像。(C) MtmG (红色) 小鼠肾器官被培养 4 天使用新的 FiZD 设置.延时图像堆栈的快照显示正在发育的肾上出现Wnt4Cre激活的 GFP(绿色)表达式。(D) 使用新的 FiZD 设置培育了 7 天的小鼠胚胎肾脏.六二(绿色)和Troma-1(Krt8,红色)染色分别显示肾上腺前体和尿肿芽(UB)分叉。(E) 使用新的 FiZD 设置对小鼠胚胎肾脏进行 12 天的培养。它沾有Troma-1(红色)和肾氨酸(绿色),并分别显示UB分叉和多细胞。(F) 与 (E) 中的相同样本,具有大功率放大 Troma-1+ (红色) UB 和肾氨酸 (绿色) + 多细胞。这个数字是从萨雷拉等人11号修改的。刻度柱 = A-D, F 100 μm;E 1,000 μm.请点击这里查看此图的较大版本。
电影2:标有GFP标签的肾内皮细胞在新的FiZD设置中生长,可以通过高分辨率共聚焦显微镜进行观察。E11.5 mTmG的胚胎肾脏;Tie1Cre小鼠被解剖和生长6天使用新的FiZD设置。影片显示Tie1Cre诱导的GFP表达在内皮细胞。使用 10x/0.45 目标拍摄了 20 个 z 层的堆栈,每 15 分钟获取一次图像。在影片中,五个GFP z层和一个明亮的场焦平面被合并。右边的面板显示了一个正在发育的肾脏的特写镜头。可以看到内皮细胞迁移到S型阶段肾素的血管裂中。在右侧的面板中,GFP z 层和一个亮场焦点平面合并。快速移动的细胞可能是巨噬细胞15。一些血细胞也表达了GFP信号。体素尺寸 0.69 μm x 0.69 μm x 4.13 μm。这部电影是从萨雷拉等人11号修改的。请点击此处查看此视频。(右键单击以下载。
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Discussion
提出了两个详细的方案,完善了经典的肾器官培养方法,使血管化、扩展发育和最佳4D(即3D图像和时间)成像为活体胚胎肾脏和器官。本节重点介绍这些方法的关键步骤,并讨论故障排除。
其他CAM培养方法与这种改良的鸡CAM培养方法之间的显著差异是,在胚胎肾脏和肾器官异种移植中,使用定制的小型储液器。改性转井插入物的膜底将样品压入鸡 CAM 并保持其原位。刀片的侧面作为培养介质的储层,保护移植物不干燥。强烈建议对异种培养胚胎鸡CAM进行异种移植,因为这种方法可以公开更大的CAM区域,其中可以放置小型储液罐,便于视觉上遵循血管化过程12、13。12,
鸡胚胎的CAM培养方法的一个缺点是,执行异种移植的时间窗口仅限于鸡胚胎的CAM在开始降解前发挥作用的8-9天。因此,需要较长时间的移植物应通过异种移植血管移植到不同的组织(如小鼠肾胶囊)6。供体组织的连续异种移植可能是解决这种长期潜伏期问题的一个办法。该方法可适用于移植物血管化和发育的延时成像,但首先必须满足小型储液罐和CAM稳定的长期成像要求。这种改良的肾异种移植方案对鸡CAM的主要优点是,该方法为供体源性内皮细胞的茁壮成长提供了条件。
FiZD-协议描述了一种使用高分辨率共聚焦显微镜对活体胚胎肾脏和肾器官进行长期延时成像的方法。对于设置,井的尺寸和插入的尺寸匹配至关重要。当盖玻片粘附在 6 孔板的底部,并将刀片放在井上时,刀片的膜应触摸玻璃。然后,当培养物被设置时,垫珠将决定膜的位置,从而决定培养器官或器官的厚度。因此,必须去除多余的胶水,并检查没有材料限制刀片接触盖玻璃。使用无毒组织胶水连接盖玻璃也很重要。请注意,胶水不会附着非常强,因此小心处理板至关重要。板可以重复使用,如果盖玻璃在洗涤步骤过程中分离,它可以粘回。
FiZD成像方法允许在单细胞水平上研究肾生成。高分辨率延时图像的高质量允许应用自动细胞分割来研究肾器官和肾脏培养物中的细胞行为。位于6孔板不同井中的几个样品可以在不同的培养条件下同时研究。该技术可以通过改变间隔珠的大小,为不同大小和类型的组织和器官进行轻松修改;这一点用卵巢细胞培养物14来证明。作为该方法的进一步优化,将FiZD设置与最近发布的微流体方法16相结合,对于在肾脏发育后期对细胞形态成形进行高分辨率微观分析可能非常有益。
FiZD 方法的一个优点是,在 1 周的成像过程中,存在大量培养介质,因此无需更改它。不过,如果需要更换介质,则介质可以轻松地从插入器墙上的开口更换。FiZD方法也优于其他器官培养方法,它使样品更接近显微镜目标。在其他广泛使用的培养方法中,有一个膜或滤光片和一个玻璃板底部之间的成像样品和目标,禁止精确的高分辨率成像17。使用 FiZD 方法可以获取活组织的高分辨率图像。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了芬兰科学院(206038、121647、250900、260056)的财政支持;英才中心赠款2012-2017 251314,Munuaissátié - 芬兰肾脏和肝脏协会,西格丽德·尤斯利克森·塞蒂埃,维多利亚斯特夫特森,芬兰瑞典文化基金会, 诺和诺德,Syöpöjöresttét(芬兰癌症协会),欧洲共同体第七框架方案(FP7/2007-2013);授予FP7-HEALTH-F5-2012-2012-INNOVATION-1欧洲匿名组织305608),H2020玛丽·斯克洛多斯卡-库里行动创新培训网络"RENALTRACT"项目ID642937。作者感谢保拉·海普斯、约翰娜·凯科拉蒂-利亚斯和汉内勒·赫尔克曼的技术援助。
图 3、4 和影片 2 在开发许可下重印。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
Ethanol (70%) | VWR | ||
Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 mm |
Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
Matrigel | Corning | 356230 | |
On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
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