We hebben geoptimaliseerd een commercieel beschikbare oestrogeen receptor β reporter test voor het screenen van menselijk en niet-menselijk primaat voedsel voor oestrogene activiteit. We valideerden deze test door aan te tonen dat de bekende oestrogene soja voor menselijke voeding hoog registreert, terwijl andere voedingsmiddelen geen activiteit vertonen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Screening op fyto-oestrogenen met behulp van een celgebaseerde oestrogeenreceptor β Reporter Assay
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Planten zijn een bron van voedsel voor veel dieren en ze kunnen duizenden chemicaliën produceren. Sommige van deze verbindingen beïnvloeden fysiologische processen in de gewervelde dieren die ze consumeren, zoals endocriene functie. Fyto-oestrogenen, de meest bestudeerde endocriene actieve fytochemicaliën, interageren direct met de hypothalamo-hypofyse gonadale as van het gewervelde endocriene systeem. Hier presenteren we het nieuwe gebruik van een celgebaseerde test om plantenextracten te screenen op de aanwezigheid van verbindingen die oestrogene biologische activiteit hebben. Deze test maakt gebruik van zoogdiercellen die zijn ontworpen om oestrogeenreceptor bèta (ERβ) sterk uit te drukken en die zijn getransfecteerd met een luciferase-gen. Blootstelling aan verbindingen met oestrogene activiteit resulteert in de cellen die licht produceren. Deze test is een betrouwbare en eenvoudige manier om te testen op biologische oestrogene activiteit. Het heeft verschillende verbeteringen ten opzichte van voorbijgaande transfectietests, met name het gebruiksgemak, de stabiliteit van de cellen en de gevoeligheid van de test.
Inleiding
Planten zijn een noodzakelijke bron van voedsel voor veel dieren en leveren calorieën en voedingsstoffen die van cruciaal belang zijn voor overleving, voortplanting, groei, ontwikkeling en gedrag1. Planten produceren duizenden chemicaliën, veel als aanpassingen voor hun eigen groei, stomatisch onderhoud en reproductie. Andere verbindingen, beschouwd als secundaire metabolieten (PSM's) van planten, hebben functies die minder duidelijk zijn, hoewel sommige giftig zijn en waarschijnlijk worden gebruikt als verdediging tegen herbivoren en parasitisme (bijv. alkaloïden, tannines)2,3. Sommige....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van plantaardige materialen
- Vries droge plantitems in die vers zijn verzameld met behulp van een lyofiel.
- Om monsters te beschermen tegen licht, dek kamers af met aluminiumfolie tijdens het droogproces.
- Om ervoor te zorgen dat monsters volledig droog zijn, lyophiliseer totdat kamers niet langer koud aanvoelen om aan te raken en plantaardige materialen geen massa meer verliezen wanneer ze worden gewogen.
- Bewaar gedroogde planten in steriele zakken met weinig residu bij afwezigheid van licht tot het malen.
- Slijp monsters fijn met behulp van een slijpmolen met 0,85 mm gaasscherm.
- Bewaar d....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Tweeëntwintig extracten van groenten en fruit die vaak in menselijke diëten worden gevonden, werden gescreend op de aanwezigheid van oestrogene verbindingen. Een verscheidenheid aan voedingsmiddelen werd onderzocht, waaronder peulvruchten, zoals sojabonen, peultjes en snaperwten, omdat de erwtenfamilie een bekende bron is van fyto-oestrogenen16, evenals vijgen, dadels, maïs, wortels, appels, bananen, aardbeien, tomaat, boerenkool en kool. Hormoonontregelende verbindingen worden aangetroffen in gem.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De ERβ-reportertest die is ontwikkeld om farmaceutische agentia individueel te screenen, is ook geschikt voor het screenen van plantaardig voedsel op fyto-oestrogenen die biologisch actief zijn via de ERβ. Belangrijke overwegingen in het protocol zijn onder meer het voorzichtig behandelen van de plantenmonsters: vers plantmateriaal moet snel worden gedroogd om schimmelvorming of andere biologische afbraak te voorkomen, en het moet uit de buurt van licht worden gehouden om fotolyse van de verbindingen te voorkomen
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Auteurs zijn Dale Leitman dankbaar voor de initiële training in het gebruik van voorbijgaande transfectietests om oestrogene activiteit van primatenplantaarde te bepalen. Met dank aan Bradford Westrich en C. Eric Johnson voor het helpen opzetten van laboratoriumapparatuur en het trainen van studenten in extractiemethoden. Tot slot, bedankt aan de Indiana University voor het financieren van dit onderzoek.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1000 µL pipette | |||
| 20 µL pipette | |||
| 200 µL pipette | |||
| 37 ° waterbad | |||
| 37 °, bevochtigde 5% CO2 incubator | |||
| 70% ethanol | |||
| analyseweegschaal | |||
| laminaire werkbank met celkweekcertificering | |||
| dimethylsulfoxide | |||
| steriele wegwerpmediabak | |||
| druppelfiltratiesysteem | |||
| Erlenmeyer kolven | 125 mL en 250 mL | ||
| HPLC-kwaliteit methanol | |||
| Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays | Indigo Biosciences | IB00411 | Assay kit - analyseert 24 monsters plus standaardcurve |
| vriesdroger | |||
| multi-kanaals pipette | |||
| orbitale shaker | |||
| plaat-leesluminometer | ex. Bioteck Synergy HTX | ||
| rotorverdamper | |||
| kolven met ronde bodem | 50 mL en 300 mL | ||
| steriele microcentrifugebuizen of steriele multi-kanaals mediabakjes | |||
| steriele pipetten | 200 µL en 1000 µL | ||
| Whatman grade 1 papier | |||
| whirl-pak tassen | steriele polyethyleen tassen |
Referenties
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior. Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).
- Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
