Summary
En flaskhals i "design-build-test" cykel av mikrobiell teknik är den hastighet med vilken vi kan utföra funktionella skärmar av stammar. Vi beskriver en hög genomströmning metod för stam screening tillämpas på hundratals till tusentals jästceller per experiment som använder droplet-baserade RNA sekvensering.
Abstract
De kraftfulla verktyg som finns tillgängliga för att redigera jäst genom har gjort denna mikrob en värdefull plattform för teknik. Även om det nu är möjligt att konstruera bibliotek av miljontals genetiskt distinkta stammar, screening för en önskad fenotyp är fortfarande ett betydande hinder. Med befintliga screeningtekniker finns det en avvägning mellan informationsutdata och genomströmning, med screening med hög genomströmning som vanligtvis utförs på en produkt av intresse. Därför presenterar vi en metod för att påskynda stam screening genom att anpassa single cell RNA sekvensering till isogenic picoliter kolonier av genetiskt modifierade jäst stammar. För att möta de unika utmaningarna med att utföra RNA-sekvensering på jästceller odlar vi isogena jästkolonier inom hydrogeler och spheroplast innan de utför RNA-sekvensering. RNA-sekvenseringsdata kan användas för att härleda jästfenotyper och reda ut konstruerade vägar. Skalbarheten för vår metod tar upp ett kritiskt hinder i mikrobiell teknik.
Introduction
Ett primärt mål för mikrobiell teknik är att modifiera mikrober för att förmå dem att producera värdefulla föreningar1,2. S. cerevisiae har varit den primära organismen för mikrobiell ingenjörskonst på grund av dess enkel kultur och bredden av verktyg som finns tillgängliga för att konstruera sitt genom3,,4,5. Ett hinder kvarstår dock när det gäller att utföra funktionella skärmar på den modifierade jästen: screeninggenomströmning släpar efter genomteknik genom storleksordningar. Screening innebär vanligtvis isolera stammar i microwell plattor och fenotypning dem genom att mäta produktionen av en viss förening6,7. Genomströmningen av denna process begränsas av de stora mängder reagens som behövs för att analysera enskilda stammar i hundra mikroliterreaktioner. Dropp mikrofluidik ger en attraktiv lösning för att öka genomströmningen av jäst screening genom storleksordningar av nedskalning reaktioner normalt utförs i väl plattor8. Men som med väl plattan skärmar, droplet skärmar upptäcker vanligtvis enskilda produktföreningar, vilket ger begränsad information i den globala funktionen av den konstruerade vägen9,10,11.
RNA-sekvensering (RNA-seq) kan möjliggöra en mer omfattande karakterisering av utbildningsavsnitt genom att tillåta att uttrycksnivåer för alla relevanta gener kan bedömas samtidigt12,13. Dessutom tillåter droppmetoder tusentals celler att profileras per experiment, vilket ger det dataflöde som krävs för att kontrollera bibliotek av konstruerade varianter14,15. RNA-seq-metoder är dock optimerade för däggdjursceller. jäst, som jämförelse, har mindre mRNA per cell och en cellvägg som är svårt att ta bort16, utesluter deras sekvensering med befintliga metoder. Om en droppmetod med hög genomströmning skulle kunna utformas för att möjliggöra jäst RNA-seq, skulle det ge en skalbar, kostnadseffektiv och informationsrik fenotypning plattform för jäst teknik.
Vi presenterar ett detaljerat protokoll av vår nyligen utvecklade metod för sekvensering jästceller med hög genomströmning dropp mikrofluidik17. För att övervinna utmaningen med begränsad RNA kapslar vi in och odlar enda jästceller i picoliterhydrogelsfärer. Kultur duplicerar cellerna, vilket ger hundratals kopior som delar samma konstruerade väg; Detta minskar variationen på grund av encelliga genuttryck samtidigt som mängden RNA som är tillgängligt för sekvensering ökar avsevärt. Efter kultur-baserade förstärkning, vi spheroplast cellerna, ta bort cellväggen via bulk enzymatiska matsmältningen. Cellmembran förblir intakta, så att varje isogen koloni och dess associerade mRNA förblir inkapslade i sina hydrogelsfärer. Detta gör det möjligt för oss att para ihop de enskilda kolonierna med mRNA-fånga reagenser och lysbuffert, och mRNA som ska fångas, streckkoda och sekvenseras efter Drop-Seq-arbetsflödet14. Vår metod tillåter transkriptom-bred screening av tusentals isogenic jäst kolonier per experiment.
Protocol
1. Tillverkning av mikrofluidiska enheter
- SU-8 master tillverkning
- Designa den negativa masken för mikrofluidiska kanaler för enhet A och B(Supplemental File 1 och 2)med hjälp av datorstödd designprogramvara och få dem tryckta på kretskortsfilm med minst 10 μm upplösning.
- Placera en ren 75 mm kiselrån på en spinnkappare och häll ca 1 ml SU-8 i mitten. Slå på vakuumet för att fästa rånet på chucken.
- För enhet A, spinnskikt SU-8 2150 vid 500 varv/min i 30 s, följt av 30 s vid 2 750 varv/min. För enhet B, spin-coat SU-8 2100 vid 500 varv/min i 30 s, följt av 30 s vid 2 500 varv/min. Detta kommer att ge SU-8 lager tjocklek 200 μm respektive 120 μm.
- Ta bort rånet från spindellacken och placera den på en värmeplatta vid 95 °C i 60 min till mjuk baka.
- Ta bort rånet från värmeplattan och låt den svalna till rumstemperatur. Placera masken ovanpå rånet och exponera under en kollimator 190 mW, 365 nm UV LED i 2 min.
- Placera rånet på en värmeplatta inställd på 95 °C i 5 min för läggning av plattan.
- Ta bort rånet och låt den svalna till rumstemperatur. Placera wafer i ett bad av propylenglykol monometyleter acetat (PGMEA) i 20 min.
- Skölj wafer med PGMEA följt av isopropanol. Om ogenomskinliga rester är synliga under denna process, upprepa sköljningen med PGMEA och isopropanol. Lufttorka wafer.
- Placera rånet på en värmeplatta vid 95 °C i 3 min.
- Ta bort och placera wafer i en 90 mm diameter Petriskål.
- Polydimetylsiloxan (PDMS) gjutning på SU-8 master
- Blanda ihop ett 10:1 massförhållande mellan silikonbasen och härdningsmedlet. Degas PDMS efter blandning i ca 30 min.
- Häll avgasade PDMS ovanpå SU-8-mastern tills minst ett 5 mm tjockt lager bildas ovanpå rånet.
- Avgas PDMS på toppen av rånet i ca 30 min.
- Placera wafer i en 65 °C ugn i minst 80 minuter för att härda PDMS.
- Klipp ut den härda PDMS-plattan från rånet.
- Placera PDMS-plattan med de mikrofluidiska funktionerna uppåt och stans inlopps- och utloppshål med en 0,75 mm biopsistans.
- Rengör en 50 mm x 75 mm glasrutschbana med isopropanol och ta bort allt damm från den mikrofluidiska funktionerna på PDMS-plattan med tejp.
- Exponera den rengjorda glasbilden och PDMS-plattan med de mikrofluidiska funktionerna med framsidan upp till 100 Pa (1 mbar O2) plasma i 1 min.
- Placera PDMS-plattan med funktionerna nedåt på glasskivan för att möjliggöra limning. Placera rutschkanan i en 65 °C ugn i minst 30 minuter för fullständig bindning.
- Behandla alla mikrofluidiska kanaler genom att spola med en fluorerad ytbehandlingsvätska. Grädda enheten i en 65 °C ugn i minst 10 min för att avdunsta vätskan.
2. Jäst inkapsling i hydrogeler med hjälp av enhet A
- Ta jäst växer i en suspension kultur och räkna med en hemocytometer.
- Resuspend cellerna i fosfat buffrad saltlösning (PBS) till en koncentration av ca 750 k/mL. Detta säkerställer att 30% av hydrogeler kommer att ha en jästcell i dem. Endast omkring hälften av jästcellerna växer till kolonier, vilket leder till ~ 15% av hydrogeler som innehåller jäst kolonier.
- Blanda ultralow smältpunkt agaros vid 2% w / v i PBS och värme vid 90 °C tills smält. Detta tar ~ 10 min.
- Lasta agarosblandningen i en spruta med ett fäst 0,22 μm filter i en sprutpump framför rumsvärmaren inställd på 80 °C.
- Fyll på en spruta fylld med jästfjädringen och en spruta som innehåller fluorerad olja med 2 % w/v jonisk fluorosurfactant18 i sprutpumpar.
- Ta coflow drop splitter enheten i avsnitt 1 och anslut slangen från sprutorna i enheten. Styr slangen från utloppet till ett koniskt rör på 15 ml i en ishink för droppuppsamling.
- Flöde i de tre lösningarna in i enheten med följande flöden:
- Flöda jästfjädringen med flödeshastigheten 3 ml/h.
- Flöde agarose blandningen vid flödet av 3 ml / h.
- Flöda fluorerade oljan med en flödeshastighet på 15 ml/h.
- Samla ca 1 ml emulsion. Vänta ytterligare 5 minuter så att agarosen är helt inställd.
3. Bryta och tvätta gel för kultur
- Tillsätt en lika stor volym på 20% perfluoroktanol (PFO) i fluorerad olja till emulsionen. Vänd konröret några gånger för att möjliggöra blandning.
- Snurra ner den trasiga emulsionen vid 2000 x g i 2 min. Gelerna kommer att pellet ovanför olja och PFO faser.
- Ta bort oljefasen och tillsätt 2 ml TE-TW-buffert (10 mM Tris pH = 8,0, 1 mM EDTA, 0,01% Tween-20) för att återsuspena gelerna. Överför suspensionen till ett nytt koniskt rör på 15 ml.
- Pellet ner gelerna som i steg 3.2 och tvätta en gång till i TE-TW för totalt två tvättar.
- Ta bort supernatant och resuspend geler i 2 ml media. Överför till ett 5 ml-kulturrör.
- Inkubera vid 30 °C över natten under skakning.
OBS: Efter inkubationen över natten kan jästhydrogeler hållas vid 4 °C i flera dagar.
4. Jästkoloni lysis
- Överför geler till ett koniskt rör på 15 ml och pelletshydrogeler vid 2 000 x g i 2 min.
- Tvätta hydrogeler i PBS 2x.
- Tvätta i 1x spheroplasting buffert 1x.
- Utför en 2–50x utspädning av spheroplastingenzym i spheroplasting buffert och tillsätt 1 ml till hydrogelerna.
- Inkubera vid 37 °C i 1 h. Den behandlade jästen kommer att se mer transparent (figur 3A).
- Ta botten 0,8 ml hydrogelupphängning och överför till en 1 ml utan tak spruta.
- Placera sprutan i den 3D-tryckta spruthållaren(tilläggsfil 3)och snurra på 2 000 x g i 2 min. Detta gör att hydrogelerna stänger förpackningen i spruthuvudet.
5. mRNA fånga från lysed jäst kolonier med hjälp av enhet B
- Ta 240.000 Drop-Seq pärlor och överför till en 15 ml konisk rör.
- Pellet Drop-Seq pärlor genom att snurra ner på 1000 x g i 1 min.
- Ta bort supernatant och resuspend pärlor i 2 ml 0.9x jäst lysis buffert med 500 mM natriumklorid för en pärla suspension koncentration av 120.000 pärlor / ml.
- Överför pärlfjädringen till en 3 ml-spruta med en omrörstång insatt.
- Bered en spruta som innehåller flera milliliter på 2 % w/v perfluoropolyether-polyetylenglykol (PFPE-PEG) ytaktivt i fluorerad olja.
- Evakuera hela sprutans vattenskata huvud med tätt packade hydrogeler och kapa sprutan.
- För in hydrogel-, pärlfjädring och oljesprutor i sprutpumpar och anslut via slangar i inkapslingsanordningen som görs i avsnitt 1.
- Anslut från utloppsslangen till ett koniskt rör på 50 ml på is.
- Flöde i de tre lösningarna in i enheten med följande flöden:
- Flöda hydrogelerna vid 0,4 ml/h.
- Flöda pärlfjädringen vid 0,4 ml/h.
- Flöda fluorerade oljan vid 1,6 ml/h.
- Samla ~ 1 ml emulsion eller kör enheten tills det inte finns några fler hydrogeler kvar.
6. cDNA generation, sekvensering bibliotek förberedelse och sekvensering
- Lägg till 30 ml 6x SSC-buffert och 1 ml PFO till den insamlade emulsionen enligt Drop-Seq-protokollet14.
- Fortsätt att följa Drop-Seq-protokollet för att generera cDNA från mRNA som fångas på pärlor, sekvensering biblioteksförberedelser och sekvenseringsdataanalys.
Representative Results
Vi anpassade det tidigare publicerade Drop-Seq-arbetsflödet14 för isogen kolonisekvensering (ICO-seq) för att utföra genuttrycksprofilering av isogena jästkolonier. Vi isolerade enstaka jästceller och inkapslade dem i agarose microgels (figur 1A). Efter natten inkubation av microgels, dessa inkapslade jästceller växte till isogena kolonier. Innan vi lastade geler i en andra mikrofluidisk anordning för mRNA-avskiljning, smälte vi jästcellväggen för att göra mRNA mer tillgänglig (figur 1B, vänster). Vi close-packade dessa microgels och slog samman mRNA fånga pärlor och lysis buffert. Några droppar innehöll exakt en pärla ihopkopplad med en lysed jäst koloni. Alla pärlor i emulsionen samlades in och cDNA syntetiserades och sekvenserade efter Drop-Seq-protokollet.
Vi genererade isogenjästkolonier genom enstaka jästcell inkapsling inom agarose microgels med hjälp av en coencapsulation mikrofluidisk enhet med en åtta droppe splitter bifogas (Figur 2A). Vi spädde in jäst suspension till en koncentration av ~ 750.000/mL så att ~ 30% av microgels har exakt en jäst i dem. Innan vi satte in den ultralåga smälttemperaturen som agats in i enheten löste vi upp den vid en förhöjd temperatur och behöll sprutan vid denna temperatur för att förhindra för tidig gelering. Vid drop-generation korsningen (figur 2B), jästceller var ursprungligen inkapslade i 160 μm droppar. Efter drop-generation korsningen en åtta gånger splitter delade dessa droppar i åtta 80 μm droppar (figur 2C). Ett sprutfilter fästes på den smälta agarosen för att förhindra att träskor bildas inom kanalerna, vilket kan vara så smalt som 37 μm under droppdelningen. Vi samlade emulsionen på is, som omedelbart började agarose gelation processen. Vi beräknade polydispersity av en typisk emulsion vara ~ 6%(Supplemental Figur 1), men polydispersity värden upp till 10% är acceptabla. När agaros geler set, bröt vi emulsionen och tog bort oljefasen. Gelerna tvättades i vattenbuffert innan nedsänkning i tillväxt media. Inkubation över natten av mikrogelerna resulterade i att isogena kolonier växte inom några av mikrogelerna (figur 2D). Andelen hydrogeler som innehöll kolonier av minst 20 celler berodde på kulturförhållandena, inklusive inkubationstid och mediesammansättning. I vår demonstration med C. albicansbestämde vi att cirka 15% av hydrogeler innehöll en koloni efter 20 h suspension kultur.
En andra coencapsulation enhet extraherade mRNA från isogena kolonier (figur 3A). Innan vi lastade jästmikrogelerna i mikrofluidiska enheten tvättade och sänkte vi gelerna i en lösning för att smälta jästcellväggarna. Korrekt rötning av jästcellerna kontrollerades genom mikroskopi, med behandlad jäst med en mer reflekterande morfologi (figur 3B). Vi close-packade microgels i en spruta och trimmade gelingångflödet så att en gel var i varje droppe. En ström av mRNA-avskiljningspärlor i lysbuffert blandad med den tätt packade gelströmmen före drop-making-korsningen (figur 3C). Vi samlade en resulterande emulsion av 160 μm droppar, och kolonier började lyse och släppa sina cellulära innehåll. Vi laddade pärlor vid en begränsande utspädning för att minimera antalet droppar som innehåller flera pärlor, men nära förpackning av geler under drop-making resulterade i cirka 10% av insamlade droppar som innehåller en pärla med en lysed koloni (figur 3D).
Vi analyserade gen uttryck av C. albicans, en art av jäst som finns i den mänskliga tarmen mikrobiomet, med hjälp av ICO-seq arbetsflödet. C. albicans är känd för sin förmåga att växla mellan två olika celltillstånd, så kallade vita och ogenomskinliga19. Vi använder en konstruerad C albicans stam, stam RZY122, som ersätter en kopia av WH11 genen, endast aktiv i vita celler med YFP20. Vi fick en uppsättning genuttrycksprofiler med hjälp av arbetsflödet och använde dem för analys av kolonier som uttrycker minst 300 unika gener. Som referensdatauppsättning använde vi C. Albicans uttrycksdata från en tidigare publicerad studie17 och filtrerade bort kolonier som uttrycker färre än 600 unika gener. Efter att ha utfört huvudsakliga komponent (PC) analys och en t-stokastiska granne inbäddning (tSNE) dimensionalitet minskning21,fann vi allmän överensstämmelse mellan vårt urval datauppsättning och referens(Figur 4A). PC-analys visade att YFP och WH11 avsevärt bidragit till de två första pc's. TSNE-analysen visade dessutom på tre kluster (figur 4B). Medan kluster 2 huvudsakligen bestod av celler från exempeldatauppsättningen, bestod kluster 0 och 1 av celler från båda exemplen. Genom att överlagra WH11 uttryck på tSNE (Figur 4C, övre panelen), bestämde vi att kluster 1 sannolikt innehöll vita kolonier. Vi fann också att STF2 uttryck ökade i kluster 1 (Figur 4C, nedre panelen), överensstämmer med tidigare erhållna data17. I kluster 0 och 2 var WH11 och STF2 betydligt nedreglerade jämfört med kluster 1 (figur 4D). Gener som var involverade i jäsning, såsom ADH1,var uppreglerade i kluster 0, i enlighet med tidigare studier av ogenomskinliga celler22. Vi fann att kolonier i kluster 2 hade minskat ribosomal RNA jämfört med kolonier i kluster 0 och 1. Även om provet och referensdatauppsättningar erhölls med samma lager av celler, tyder detta resultat på att även subtila skillnader i experimentell hantering kan påverka genuttryck.
Bild 1: Översikt över ICO-seq-arbetsflödet. (A)Jäst som växer i en suspensionskultur späddes ut i buffert och samkapslades med smält agaros i en flödesfokuserad droppgeneratorenhet för att möjliggöra Poisson-belastning av agarosmigeler med enstaka jästceller. Gelerna som när agaros kyls, olja / vatten suspension bröts, och oljan togs bort, vilket ger en suspension av gel pärlor i vatten. Efter natten kultur, jästceller växte till isogena kolonier inom microgels. B)Kolonier utsattes för en buffert för nedbrytning av cellvägg, varefter de var tätt packade och samkapslade med mRNA-avskiljningspärlor i en andra mikrofluidisk anordning. Nära packning av microgels såg varje droppe hade en gel, medan Poisson lastning av pärlorna minskade risken för flera pärlor inom en droppe. Insamlade droppar bearbetades för cDNA-syntes och generering av ett sekvenseringsbibliotek. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Generering av isogena jästkolonier inom agarose microgels med anordning A. (A)Schematisk av mikrofluidisk anordning, som visar var de tre ingångarna och utgångsportarna finns. Drop-making korsningen är markerad i rött. (B)Närbild av drop-making-korsningen under normal användning av enheten. C)Mikrograf av insamlade droppar, med en närbild av en droppe som innehåller en inkapslad cell (infälld). D) Mikrograf av isogen jäst kolonier i agarose microgels efter en 24-timmars inkubation, med en närbild av två kolonier (infälld). Alla skalfält = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Lys- och mRNA-avskiljning från isogena kolonier med anordning B. (A)Schematisk av mikrofluidisk anordning, som visar var de tre ingångarna och utgångsportarna finns. Drop-making korsningen är markerad i rött. ( B)Mikrograf av jäst kolonier efter cellvägg matsmältningen, med en närbild av en koloni (infälld). (C)Närbild av drop-making-korsningen under normal användning av enheten. DD) Mikrograf av insamlade emulsioner efter microgel och pärlparing, med en närbild som visar en droppe med en pärla och en lysed koloni (infälld). Alla skalfält = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Analys av vitogenomskinlig kopplingsrespons i C. albicans. (A)tSNE-område för en exempeldatauppsättning kombinerad med en referensdatauppsättning från Liu17. (B)Klustring av transkriptomer avslöjar tre kluster visualiseras på en tSNE tomt. (C)Viktiga gener som var involverade i vitogenomskinlig växling bidrog till variationen som fastställts genom huvudkomponentanalys. (D) Violin tomter normaliserade uttryck nivåer av YFP och WH11 av kluster markerade på tSNE tomt. **indikerar p <<< 0.05 och * indikerar p << 0.05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tilläggssiffrorna 1 och 2. Klicka här för att ladda ner dessa filgures.
Kompletterande filer 1-3. Klicka här för att ladda ner dessa filer.
Discussion
Vår metod för isogen jäst koloni RNA sekvensering (ICO-seq) anpassar en publicerad enda cell RNA sekvensering plattform, Drop-Seq, för hög genomströmning screening av konstruerade jäst stammar. Jästceller innehåller mindre än 10% av kopiorna av mRNA av en typisk däggdjurscell och har en cellvägg som måste brytas ned före mRNA-fångst16. Dessa två faktorer utesluter direkt applicering av jäst på Drop-Seq eller andra droppbaserade scRNA-seq-plattformar. För att ta itu med dessa frågor kapslar vi in enskilda celler i hydrogeler och odlar dem till kolonier för att ge tillräckligt med inmatningsmaterial för RNA-sekvensering och vi smälter jästcellväggen för att generera spheroplaster före lysning och mRNA-fångst. Dessa ändringar lägger till ytterligare komplexitet i ICO-seq-arbetsflödet jämfört med det ursprungliga Drop-Seq-arbetsflödet och är viktiga steg som användarna måste se till att gå smidigt.
Korrekt drift av anordning A är nödvändig för att kapsla in enstaka jästceller i agarose hydrogeler. Korrekt räkning av ingångsjästupphängningen måste följas för att minimera antalet hydrogeler med mer än en jästcell, samtidigt som man ser till att tillräckligt med hydrogeler innehåller en enda cell för att säkerställa en rimlig cellfångsteffektivitet under mRNA-fångst. Under mikrofluidisk användning måste agarosgelblandningen vara väl upplöst och passera genom ett sprutfilter för att minimera risken för igensättning av enheten. Den agaros gel blandningen är trögflytande och den region där en enda kanal delas upp i åtta är särskilt benägna att igensättning. Genom att centrera en höghastighetskamera för att visualisera enhetens funktion i enhetens region kan användarna övervaka enhetligheten hos droppar som kommer från var och en av de åtta kanalerna och snabbt reagera om enhetligheten ändras på grund av träskor i någon av kanalerna. Inspektion av en liten mängd uppsamlad emulsion under mikroskopet ger en sekundär metod för att bekräfta en högkvalitativ emulsion.
Efter tillväxt av jästkolonier inom hydrogeler är flera försiktighetsåtgärder nödvändiga för att säkerställa kvalitet mRNA utvinning på den enda koloninivå. Det är viktigt att optimera tiden jäst är i hydrogel kultur, för om jästen är kvar i kulturen för länge, många kommer att undkomma gränserna för hydrogeler, vilket leder till en högre bakgrundssignal under RNA sekvensering och lägre känslighet när diskriminerande mellan celltyper. Korrekt generering av spheroplasts med Zymolyase säkerställer att mRNA frigörs efter cellexponering för lysbuffert. Visuell inspektion av jäst kolonier efter Zymolyase bör ge glansigare jästceller. Felaktig cellväggsmätning leder till lägre RNA-avskiljningseffektivitet. Slutligen bör hydrogelerna vara tätt förpackade eftersom de matas in i enhet B. Övervakning av hydrogelingången med en höghastighetskamera gör det möjligt att avsluta emulsionsinsamlingen när hydrogelerna inte längre är tätt packade vid inmatning i enheten, annars kommer infångseffektiviteten att påverkas.
Ett potentiellt problem med vår metod är att microgel kultur jäst kan avsevärt förändra genuttryck. Tidigare arbete med att undersöka jästgenuttryck i microgels och på agar visar skillnader i genuttryck genomsnitt men totalt sett en positiv korrelation17, även om ytterligare undersökning av detta påstående om en mängd olika jäst stammar är försiktig. Metoden har också begränsad cellfångsteffektivitet på grund av stokastisk belastning av mRNA-fånga pärlor efter Poisson statistik14. För närvarande cirka 10% av dropparna innehåller en pärla och en koloni, och graden av dubbla inkapslingar förväntas vara under 1%. Dubbla inkapslingar leder till förvirrande element under RNA-seq dataanalys och deras filtrering är fortfarande utmanande23; en fångsthastighet på 25 % skulle leda till en motsvarande ökning av dubbla inkapslingar till 5 %(tilläggssiffra 2). Även om vi demonstrerar ICO-seq med hjälp av Drop-Seq-plattformen, finns det andra droplet RNA-seq plattformar som introducerar mRNA fånga pärlor deterministiskt snarare än statistiskt, såsom kommersiellt tillgängliga 10x Genomics Krom plattform15,24. Integrationen av dessa plattformar med ICO-seq skulle kunna öka fånga effektivitet utöver vad Poisson statistik tillåter. Slutligen är en grundläggande begränsning av droppen RNA-seq oförmåga att återvinna celler av intresse efter sekvensering. Denna begränsning bör beaktas när man överväger vilka typer av jäst bibliotek att analysera med denna metod.
Cell-till-cell heterogenitet har påvisats på klonnivå för mikrober som E. coli25 och S. cerevisiae26 avslöjar nya cellen påstår att en bulk-nivå analys annars skulle maskera. Bulk RNA-seq analyser som utförs på C. albicans tenderar att antingen titta på populationsomfattande transkriptom förändringar, eller vita och ogenomskinliga celler som två separata populationer27,28. Tillämpningen av ICO-seq kan leda till upptäckten av ytterligare delstater och ge en analytisk ram för att upptäcka nya celltillstånd inom andra jästarter. Emellertid, tillväxten av celler inom hydrogeler är inte begränsad till jäst: andra celltyper, såsom däggdjur, bakteriella, och andra svampceller kan också odlas inom hydrogels29,30. Sekvenseringen av isogen kolonier kontra enskilda celler leder till i genomsnitt av biologiskt buller på grund av cell-till-cell variation, förbättra diskriminering mellan celltyper. Detta kan hjälpa vid analys av celler där genetisk mångfald kretsar kring specifika syntesvägar. De utökade möjligheterna med celltyp ingång till ICO-seq och dess potentiella integration med kommersiellt tillgängliga droplet RNA-seq plattformar positioner ICO-seq som en lovande plattform för dissekering cellulär heterogenitet på genetisk nivå.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta projekt stöddes av National Science Foundation Career Award DBI-1253293, National Institutes of Health New Innovator Award DP2AR068129 och bevilja R01HG008978, National Science Foundation Technology Center grant DBI-1548297, och UCSF Center for Cellular Construction. ARA och ZJG är Chan-Zuckerberg Biohub Utredare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | Used to make TE-TW buffer |
| 0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
| 1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | Used to make TE-TW buffer |
| 27 gauge needles | BD | 305109 | |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| 3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | See Supplemental Files for 3D print file |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | a9414 | |
| Aquapel (hydrophobic glass treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
| Drop-Seq Beads | ChemGenes | MACOSKO-2011-10 | |
| Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) | Corning | 294775X50 | |
| Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref 14. Can substitute with PEG-PFPE surfactant. | ||
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Novec 7500 | 3M | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| PBS | Fisher Scientific | BP243820 | |
| PE-2 polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
| PEG-PFPE surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
| PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | See Supplemental Files for mask designs |
| Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| SSC Buffer | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| SU-8 2100 | MicroChem | Y111075 | |
| SU-8 2150 | MicroChem | Y111077 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Used to make TE-TW buffer |
| YR Digestion buffer | Zymo Research | R1001-1 | Spheroplasting buffer |
| YR Lysis Buffer | Zymo Research | R1001-2 | |
| Zymolyase | Zymo Research | E1005 | Spheroplasting enzyme mixture |
References
- Peralta-Yahya, P. P., Zhang, F., Del Cardayre, S. B., Keasling, J. D. Microbial engineering for the production of advanced biofuels. Nature. 488 (7411), 320-328 (2012).
- Curran, K. A., Alper, H. S. Expanding the chemical palate of cells by combining systems biology and metabolic engineering. Metabolic Engineering. 14 (4), 289-297 (2012).
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Mager, W. H., Winderickx, J. Yeast as a model for medical and medicinal research. Trends in Pharmacological Sciences. 26 (5), 265-273 (2005).
- Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. Opportunities for yeast metabolic engineering: Lessons from synthetic biology. Biotechnology Journal. 6 (3), 262-276 (2011).
- Vanella, R., et al. Yeast-based assays for screening 11β-HSD1 inhibitors. Microbial Cell Factories. 15 (1), (2016).
- Zhuang, X., Chappell, J. Building terpene production platforms in yeast. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1854-1864 (2015).
- Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4004-4009 (2010).
- Wang, G., et al. RNAi expression tuning, microfluidic screening, and genome recombineering for improved protein production in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9324-9332 (2019).
- Beneyton, T., et al. Droplet-based microfluidic high-throughput screening of heterologous enzymes secreted by the yeast Yarrowia lipolytica. Microbial Cell Factories. 16 (1), 18 (2017).
- Sjostrom, S. L., et al. High-throughput screening for industrial enzyme production hosts by droplet microfluidics. Lab on a Chip. 14 (4), 806-813 (2014).
- Nadal-Ribelles, M., et al. Sensitive high-throughput single-cell RNA-seq reveals within-clonal transcript correlations in yeast populations. Nature Microbiology. 4 (4), 683-692 (2019).
- Gasch, A. P., et al. Single-cell RNA sequencing reveals intrinsic and extrinsic regulatory heterogeneity in yeast responding to stress. PLoS Biology. 15 (12), 2004050 (2017).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- von der Haar, T. A quantitative estimation of the global translational activity in logarithmically growing yeast cells. BMC Systems Biology. 2, 87 (2008).
- Liu, L., Dalal, C. K., Heineike, B. M., Abate, A. R. High throughput gene expression profiling of yeast colonies with microgel-culture Drop-seq. Lab on a Chip. 19 (10), 1838-1849 (2019).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
- Berman, J., Sudbery, P. E. Candida albicans: A molecular revolution built on lessons from budding yeast. Nature Reviews Genetics. 3 (12), 918-930 (2002).
- Srikantha, T., Soll, D. R. A white-specific gene in the white-opaque switching system of Candida albicans. Gene. 131 (1), 53-60 (1993).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
- Sun, Y., et al. Deletion of a yci1 domain protein of Candida albicans allows homothallic mating in MTL heterozygous cells. mBio. 7 (2), 00465-00516 (2016).
- McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet Detection in Single-Cell RNA Sequencing Data Using Artificial Nearest Neighbors. Cell Systems. 8 (4), 329-337 (2019).
- Baran-Gale, J., Chandra, T., Kirschner, K. Experimental design for single-cell RNA sequencing. Briefings in Functional Genomics. 17 (4), 233-239 (2018).
- Silander, O. K., et al. A Genome-Wide Analysis of Promoter-Mediated Phenotypic Noise in Escherichia coli. PLoS Genetics. 8 (1), 1002443 (2012).
- Newman, J. R. S., et al. Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature. 441 (7095), 840-846 (2006).
- Tuch, B. B., et al. The Transcriptomes of Two Heritable Cell Types Illuminate the Circuit Governing Their Differentiation. PLoS Genetics. 6 (8), 1001070 (2010).
- Romo, J. A., et al. Global Transcriptomic Analysis of the Candida albicans Response to Treatment with a Novel Inhibitor of Filamentation. mSphere. 4 (5), 00620 (2019).
- Huang, H., et al. Generation and manipulation of hydrogel microcapsules by droplet-based microfluidics for mammalian cell culture. Lab on a Chip. 17 (11), 1913-1932 (2017).
- Lin, X., Nishio, K., Konno, T., Ishihara, K. The effect of the encapsulation of bacteria in redox phospholipid polymer hydrogels on electron transfer efficiency in living cell-based devices. Biomaterials. 33 (33), 8221-8227 (2012).
