Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) es un método altamente sensible, confiable y fácil de realizar para detectar la modificación reversible de los residuos de cisteína (S-acylation) en una variedad de muestras biológicas.
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Artículo de método
Detección de proteína S-Acylation utilizando la captura asistida de acilo-resina
* These authors contributed equally
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Resumen
Resumen
La proteína S-acylation, también conocida como S-palmitoylation, es una modificación post-traduccional reversible de residuos de cisteína con ácidos grasos de cadena larga a través de un enlace labile tioester. La acilación S, que está emergiendo como un mecanismo regulador generalizado, puede modular casi todos los aspectos de la actividad biológica de las proteínas, desde la formación compleja hasta el tráfico de proteínas y la estabilidad de las proteínas. Los recientes avances en la comprensión de la función biológica de la proteína S-acylation se lograron en gran medida debido al desarrollo de nuevas herramientas bioquímicas que permitieron la detección robusta y sensible de la proteína S-acylation en una variedad de muestras biológicas. Aquí, describimos la captura asistida por resina de acilo (Acyl-RAC), un método desarrollado recientemente basado en la captura selectiva de proteínas endógenamente S-aciladas por cuentas de sepharose tiol-reactivas. En comparación con los enfoques existentes, Acyl-RAC requiere menos pasos y puede producir resultados más fiables cuando se combina con espectrometría de masas para la identificación de nuevos objetivos de acilación S. Una limitación importante en esta técnica es la falta de capacidad para discriminar entre especies de ácidos grasos unidos a las cisteínas a través del mismo enlace tioester.
Introducción
La acilación S es una modificación post-traduccional reversible que implica la adición de una cadena de acilo graso a un residuo interno de cisteína en una proteína diana a través de una unión labile tioester1. Primero se informó como una modificación de proteínas con palmitato, un ácido graso saturado de 16 carbonos2,y por lo tanto esta modificación se conoce a menudo como S-palmitoylation. Además del palmitato, las proteínas pueden ser modificadas reversiblemente por una variedad de ácidos grasos saturados más largos y más cortos (miristate y estearato), monoinsaturados (oleato) y poliinsaturados (araquidonato y eicosa....
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Protocolo
Los ratones utilizados en este protocolo fueron eutanasiados de acuerdo con las directrices de NIH. El Comité de Bienestar Animal del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en Houston aprobó todo el trabajo animal.
1. Preparación de los lysaatos celulares
- Prepare el búfer de lisis como se describe en la Tabla 1. A 10 ml de PBS, añadir 0,1 g de detergente n-dodecílo-D-maltoside (DDM) y rotar para disolver. Añadir 100 l de cóctel inhibidor de fosfatasa 2, ML211 (10 m), PMSF (10 mM) y cóctel inhibidor de proteasa (1x) y enfriar el tampón en hielo antes de usarlo.
- Transfiera los medios nec....
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Resultados
Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, primero usamos acyl-RAC para detectar simultáneamente S-acylation de varias proteínas en las células de Jurkat, una línea de células T inmortalizada originalmente derivada de la sangre periférica de un paciente de leucemia de células T27. Las proteínas de células T reguladoras previamente identificadas como S-acylated9,28,29 fueron elegidas para demostrar la .......
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Discusión
Aquí, utilizamos con éxito el ensayo acyl-RAC para detectar La acilación S de proteínas seleccionadas tanto en células humanas cultivadas como en células primarias derivadas del tejido del ratón. Este método es simple, sensible y se puede realizar fácilmente con requisitos mínimos de equipos utilizando técnicas de bioquímica estándar. Se ha demostrado que este método identifica con éxito nuevas proteínas S-aciladas, como la subunidad del sistema de transubicación de proteínas (Sec61b), la proteína ribosomal S11 (Rps11) y.......
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Divulgaciones
No se declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las becas 5R01GM115446 y 1R01GM130840 de los Institutos Nacionales de Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| cOmplete Inhibidor de la proteasa Tabletas de cóctel Sigma | 11836170001 | ||
| Centrífuga Eppendorf 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
| Hidroxilamina (HAM) | Sigma | 159417 | |
| Metanetiosulfonato de metilo (MMTS) | Sigma | 64306 | |
| Mini rotador de tubo | LabForce | ||
| ML211 | Cayman | 17630 | |
| Multi-Therm Cool-Heat-Shake | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| n-Dodecil β-D-maltósido (DDM) | Sigma | D641 | |
| Cóctel de inhibidores de fosfatasa 2 | Sigma | P5726 | |
| Tiopropil-Sepharose 6B (TS) | Sigma | T8387 | |
| Ultrasonidos Quantrex Sonicator | L &; R |
Referencias
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).
- Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4 (5)....
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Reimpresiones y permisos
