يوفر توليد فيروسات الروتا المؤتلفة من الحمض النووي البلازمي أداة أساسية لدراسة تكرار فيروس الروتا ومسببات الأمراض ، وتطوير ناقلات التعبير عن فيروس الروتا واللقاحات. هنا، نحن نصف نهج علم الوراثة العكسي المبسط لتوليد فيروسات الروتا المؤتلفة، بما في ذلك سلالات تعبر عن بروتينات مراسل الفلورسنت.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة مبسطة علم الوراثة العكسي لاسترداد الفيروسات الروتا المؤتلفة التعبير عن البروتينات مراسل
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
فيروسات الروتا هي مجموعة كبيرة ومتطورة من فيروسات الحمض النووي الريبي المجزأة المزدوجة التي تسبب التهاب المعدة والأمعاء الحاد في صغار العديد من الأنواع المضيفة للثدييات والطيور، بما في ذلك البشر. ومع ظهور أنظمة الوراثة العكسية لفيروس الروتا مؤخراً، أصبح من الممكن استخدام الطفرات الموجهة لاستكشاف بيولوجيا فيروس الروتا، وتعديل لقاحات فيروس الروتا الموجودة وتحسينها، وتطوير ناقلات اللقاحات متعددة الأهداف لفيروس الروتا. في هذا التقرير، نحن نصف نظام علم الوراثة العكسي المبسط الذي يسمح بالتعافي الفعال والموثوق به من فيروسات الروتا المؤتلفة. ويستند النظام على التطفل المشترك من ناقلات النسخ T7 التعبير عن كامل طول rotavirus (+) RNAs وناقل CMV ترميز إنزيم غطاء الحمض النووي الريبي في خلايا BHK إنتاج اسيشن ايمرياز T7 الحمض النووي الريبي (BHK-T7). يتم تضخيم فيروسات الروتا المؤتلفة من خلال الإشراف على خلايا BHK-T7 المصابة عبرها مع خلايا MA104 ، وهو خط خلية الكلى القرد الذي هو متساهل للغاية لنمو الفيروس. في هذا التقرير، نحن أيضا ً نصف نهج لتوليد فيروسات الروتا المؤتلفة التي تعبر عن بروتين مراسل فلوري منفصل من خلال إدخال عنصر إيقاف إعادة التشغيل الترجمي 2A في الجزء 7 من الجينوم (NSP3). هذا النهج يتجنب حذف أو تعديل أي من إطارات القراءة المفتوحة الفيروسية، مما يسمح لإنتاج فيروسات الروتا المؤتلفة التي تحتفظ بالبروتينات الفيروسية تعمل بكامل طاقتها مع التعبير عن بروتين الفلورسنت.
المقدمة
فيروسات الروتا هي الأسباب الرئيسية لالتهاب المعدة والأمعاء الحاد في الرضع والأطفال الصغار ، وكذلك الشباب من العديد من الثدييات الأخرى والطيورالأنواع 1. كأعضاء في عائلة Reoviridae، الفيروسات الدوارة لديها تجزئة الحمض النووي الريبي المزدوج تقطعت بهم السبل (dsRNA) الجينوم. وترد شرائح الجينوم داخل فيرجيون icosahedral غير مغلفة تشكلت من ثلاث طبقات متحدة المركز من البروتين2. واستناداً إلى التسلسل والتحليل الجيني لأجزاء الجينوم، تم تحديد تسعة أنواع من فيروس الروتا (A-D, F−J)3. تلك السلالات التي تتألف من أنواع فيروس الروتا A هي المسؤولة عن الغالبية العظمى من الأمراض البشرية4
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد وسائل الإعلام وصيانة ثقافة الخلايا
- الحصول على خلايا الكلى الهامستر الطفل التي تعبر بشكل تأسيسي T7 الحمض النووي الريبي بوليميراز (BHK-T7) والأفريقية الخضراء القرد الكلى MA104 الخلايا.
ملاحظة: خلايا BHK-T7 (أو BSR-T7) ليست متوفرة تجاريًا، ولكنها خط خلية مشترك للمختبرات باستخدام علم الوراثة العكسي لدراسة بيولوجيا فيروس RNA. تم الحصول على خط الخلية BHK-T7 المستخدمة في هذا البروتوكول من الدكتور ة أورسولا ج. بوشهولز (المعاهد الوطنية للصحة، Bethesda، MD، الولايات المتحدة الأمريكية)، وهو مطور مشارك لخط الخلية BHK الأصلي الذي يعبر عن T7 RNA polymerase29. تتوفر خلايا MA104 من المجموعة الأوروبية لثقافات الخلايا الموثقة (ECACC) ومن مج....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بروتوكول علم الوراثة العكسي الموصوف في هذه المقالة ينتقل من خلال خطوات متميزة متعددة: (1) التطفل المشترك لخلايا BHK-T7 مع ناقلات النسخ pT7 فيروس روتا وpCMV/NP868R التعبير plasmid، (2) الإشراف على الخلايا BHK-T7 المصابة بخلايا MA104 ، (3) تضخيم الفيروسات المؤتلفة الموجودة في خلايا BHK-T7/MA104 التي تسيل باستخدام خلايا MA104 ، و (4) عزل البلاك للفيروس المؤتلف باستخدام خلايا MA104(الشكل 2). في أيدينا، البروتوكول هو كفاءة، مما أسفر عن titers من الفيروس SA11 المؤتلف ة البرية (rSA11/wt) في BHK-T7/.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في مختبرنا، ونحن نعتمد بشكل روتيني على بروتوكول علم الوراثة العكسي الموصوف هنا لإنتاج فيروسات روتا SA11 المؤتلفة. مع هذا النهج ، والأفراد مع خبرة ضئيلة في تقنيات البيولوجيا الجزيئية أو العمل مع الفيروسات الروتا استرداد الفيروسات المؤتلفة حتى في محاولتهم الأولى. لقد قمنا بتوليد ما يقرب من 100 فيروس مؤتلف بعد هذا البروتوكول، بما في ذلك الفيروسات ذات الجينوم التي تمت إعادة هندستها للتعبير عن البروتينات الأجنبية (على سبيل المثال، FPs) التي تحتوي على إضافات التسلسل، والحذف، والطفرات النقطية.
تنطبق .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة المنح R03 AI131072 وR21 AI144881، جامعة انديانا تمويل بدء التشغيل، ولورانس M. بلات الوقف. نشكر أعضاء مختبر روتاهوسير، أولريش ديسيلبرغر، وغيدو بابا على مساهماتهم واقتراحاتهم العديدة في تطوير بروتوكول علم الوراثة العكسي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كلى الهامستر للأطفال - T7 RdRP (BHK-T7) الاتصال: | ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16٪ Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 عداد خلايا قابل للتطبيق | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP نظام تصوير هلام | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| ركيزة التلألؤ الكيميائي المعزز من Clarity Western (ECL) | Bio-Rad | 170-5060 | |
| بكتيريا الإشريكية القولونية DH5alpha المختصة | Lucigen | 60602-2 | |
| مثبط البروتياز الكامل | بيرس | A32965 | |
| ماصات النقل القابل للتصرف ، نصائح ممتدة متناهية الصغر | MTC Bio | P4113-11 | |
| النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium ، 2x (2xEMEM) | جودة بيولوجية | 115-073-101 | |
| إيثانول ، مطلق (200 برهان) | كواشف فيشر الحيوية | BP2818-500 | |
| محلول بروميد الإيثيديوم (10 مجم / مل) | إنفيتروجين | 15585-011 | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | كورنينج | 35-010-CV | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، | Corning | 35-011-CV | |
| المعطل بالحرارة ، الفأر أحادي النسيلة | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM بخلفية منخفضة مضان |
| غلاسكو الحد الأدنى من الوسط الأساسي (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| الماعز المضاد للأرانب IgG ، بيروكسيداز الفجل الحار (HRP) | تقنية إشارات الخلية | المترافقة 7074S | |
| خنزير غينيا المضاد ل NSP3 Antiserum | Patton | lab lot 55068 | |
| خنزير غينيا Anti-VP6 Antierum | Patton | lab lot 53963 | |
| الحصان المضاد لخنازير غينيا IgG ، بيروكسيداز الفجل الحار (HRP) المترافق | KPL | 5220-0366 | |
| الحصان المضاد للفأر IgG ، الفجل الحار إيروكسيديز (HRP) | تقنية إشارات الخلايا | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection | JH Science | 25235 | |
| كحول الأيزوبروبيل | ماكرون | 3032-02 | |
| محلول L-glutamine ( 100x) | Gibco | 25030-081 | |
| مسحوق Luria Agar (Miller's LB Agar)منتجات | أبحاث RPI | L24020-2000.0 | |
| متوسط 199 (M199) متوسط ثقافة | Hyclone | Sh30253.01 | |
| الحد الأدنى من الوسط الأساسي - منتدى النسر Joklik (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| خلايا الكلى (MA104) | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | محلول | ||
| (0.33٪) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| محلول الأحماض الأمينية غير الأساسي (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10٪ Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| من درجة البيولوجيا الجزيئية الخالية من النكلياز | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel ومجموعة تنظيف PCR | تاكارا | 740609.25 | |
| Opti-MEM مصل مخفض متوسط | جيبكو | 31985-070 | |
| مدقة بيليه (خالية من RNase ، يمكن التخلص منها) | فيشر | 12-141-368 | |
| محلول البنسلين والستربتومايسين ، (100x penn-strepe) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate محلول ملحي مخزن (PBS) ، 10x | كواشف فيشر الحيوية | BP399-20 | |
| لحم الخنزير التربسين ، النوع IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep | KitQiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 ناقلات النسخ | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7 / NSP3 ناقلات النسخ التي تعبر عن البروتينات | الاتصال: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | للرحلان الكهربائي للهلام |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | لفحص |
| البلاكSuperscript III طقم RT-PCR بخطوة | واحدة Invitrogen | 12574-035 | |
| طقم نقل النيتروسليلوز عبر اللطمة التوربينية | Bio-Rad | 170-4270 | |
| نقل توربو | عبر LLOT Bio-Rad | ||
| كاشف الإرسال | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| تريتون X 100 | فيشر الكواشف الحيوية | BP151-500 | |
| كاشف استخراج الحمض النووي الريبي Trizol | Ambion | 15596026 | |
| تريبان الأزرق | Corning | 25-900-CI | |
| التربسين (0.05٪) -EDTA (0.1٪) محلول تفكك الخلية | الجودة البيولوجية | 118-087-721 | |
| مرق فوسفات التربتوز | جيبكو | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF مذيب | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
المراجع
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- Intern....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
