Generatie recombinantrotavirussen uit plasmid DNA is een essentieel instrument voor de studie van rotavirusreplicatie en pathogenese, en de ontwikkeling van rotavirusexpressievectoren en vaccins. Hierin beschrijven we een vereenvoudigde omgekeerde genetica benadering voor het genereren van recombinante rotavirussen, met inbegrip van stammen uitdrukken fluorescerende reporter eiwitten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Vereenvoudigde Reverse Genetics Methode om Recombinant Rotavirussen Expressing Reporter Eiwitten terug te vorderen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Rotavirussen zijn een grote en evoluerende populatie van gesegmenteerde dubbelstrengs RNA-virussen die ernstige gastro-enteritis veroorzaken bij de jonge van vele zoogdier- en vogelsoorten, waaronder mensen. Met de recente komst van rotavirus omgekeerde genetica systemen, is het mogelijk geworden om gerichte mutagenese te gebruiken om rotavirus biologie te verkennen, te wijzigen en te optimaliseren bestaande rotavirus vaccins, en rotavirus multitarget vaccin vectoren te ontwikkelen. In dit rapport beschrijven we een vereenvoudigd reverse genetica systeem dat het mogelijk maakt de efficiënte en betrouwbare herstel van recombinante rotavirussen. Het systeem is gebaseerd op co-transfection van T7 transcriptie vectoren uitdrukken full-length rotavirus (+)RNAs en een CMV vector codering van een RNA capping enzym in BHK cellen constitutief produceren T7 RNA polymerase (BHK-T7). Recombinant rotavirussen worden versterkt door het overzien van de getransfecteerde BHK-T7 cellen met MA104 cellen, een aap niercel lijn die zeer tolerant is voor virusgroei. In dit rapport beschrijven we ook een aanpak voor het genereren van recombinante rotavirussen die een apart fluorescerend reporter-eiwit uitdrukken door de introductie van een 2A translationeel stop-herstartelement in genoomsegment 7 (NSP3). Deze aanpak voorkomt het verwijderen of wijzigen van een van de virale open leesframes, waardoor de productie van recombinante rotavirussen die volledig functionele virale eiwitten behouden terwijl het uitdrukken van een fluorescerend eiwit.
Inleiding
Rotavirussen zijn belangrijke oorzaken van ernstige gastro-enteritis bij zuigelingen en jonge kinderen, evenals de jongen van vele andere zoogdier- en vogelsoorten1. Als leden van de Reoviridae familie hebben rotavirussen een gesegmenteerd dubbelstrengs RNA (dsRNA) genoom. De genoomsegmenten bevinden zich in een niet-gehulde icosahedralvirion gevormd uit drie concentrische lagen eiwit2. Op basis van sequencing en fylogenetische analyse van de genoomsegmenten zijn negen soorten rotavirus (A−D, F−J) gedefinieerd3. Deze stammen die rotavirussoort A omvatten, zijn verantwoordelijk voor de ove....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Onderhoud van de mediavoorbereiding en celcultuur
- Verkrijgen baby hamster niercellen constitutief uitdrukken T7 RNA polymerase (BHK-T7) en Afrikaanse groene aap nier MA104 cellen.
OPMERKING: BHK-T7 (of BSR-T7) cellen zijn niet commercieel beschikbaar, maar zijn een gemeenschappelijke cellijn van laboratoria met behulp van omgekeerde genetica om RNA-virusbiologie te bestuderen. De BHK-T7 cellijn die in dit protocol werd gebruikt, werd verkregen van Dr. Ursula J. Buchholz (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), een mede-ontwikkelaar van de originele BHK-cellijn die T7 RNA polymerase29uitdrukt. MA104 cellen zijn verkrij....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het omgekeerde genetica protocol beschreven in dit artikel verloopt door middel van meerdere verschillende stappen: (1) co-transfection van BHK-T7 cellen met rotavirus pT7 transcriptie vectoren en een pCMV/NP868R expressie plasmide, (2) het toezicht op getransfecteerde BHK-T7-cellen met MA104-cellen, (3) versterking van recombinante virussen die aanwezig zijn in BHK-T7/MA104-cellen lysates met MA104-cellen en (4) plaqueisolatie van recombinantvirus met MA104-cellen (Figuur 2). In onze handen.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In ons laboratorium vertrouwen we routinematig op het omgekeerde geneticaprotocol dat hierin wordt beschreven om recombinante SA11-rotavirussen te produceren. Met deze aanpak, individuen met weinig ervaring in moleculaire biologie technieken of het werken met rotavirussen herstellen recombinant virussen, zelfs op hun eerste poging. We hebben bijna 100 recombinante virussen gegenereerd volgens dit protocol, inclusief die met genomen die zijn opnieuw ontworpen om vreemde eiwitten (bijvoorbeeld FP's) uit te drukken en die s.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidies R03 AI131072 en R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding, en de Lawrence M. Blatt Endowment. Wij danken de leden van het IU Rotahoosier laboratorium, Ulrich Desselberger, en Guido Papa voor hun vele bijdragen en suggesties in de ontwikkeling van de omgekeerde genetica protocol.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Baby Hamster Kidney - T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM met lage achtergrondfluorescentie |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | Voor gelelektroforese |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | Voor plaque-assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
Referenties
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- Intern....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
