플라스미드 DNA로부터의 재조합 로타바이러스 생성은 로타바이러스 복제 및 병인, 및 로타바이러스 발현 벡터 및 백신의 개발을 위한 필수적인 도구를 제공한다. 본 명세서에서, 우리는 형광 리포터 단백질을 발현하는 균주를 포함하는 재조합 로타바이러스를 생성하기 위한 단순화된 역유전학 접근법을 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
Rotaviruses는 인간을 포함하여 많은 포유류 및 조류 호스트 종의 젊은에 있는 가혹한 위장염을 일으키는 원인이 되는 분할된 이중 좌초된 RNA 바이러스의 크고 진화하는 인구입니다. 로타바이러스 역유전학 시스템의 최근 출현으로, 로타바이러스 생물학을 탐구하고, 기존 로타바이러스 백신을 수정 및 최적화하고, 로타바이러스 다표적 백신 벡터를 개발하기 위해 지시된 돌연변이 발생을 사용할 수 있게 되었다. 이 보고서에서는 재조합 로타바이러스의 효율적이고 신뢰할 수 있는 복구를 허용하는 단순화된 역유전학 시스템을 설명합니다. 이 시스템은 전신 로타바이러스(+)RNAs를 발현하는 T7 전사 벡터의 공동 형질감염과 BHK 세포에 RNA 캡핑 효소를 코딩하는 CMV 벡터를 구성하여 T7 RNA 폴리머라제(BHK-T7)를 생성한다. 재조합 로타바이러스는 바이러스 성장을 위해 매우 허용되는 원숭이 신장 세포주인 MA104 세포로 형질감염된 BHK-T7 세포를 감독함으로써 증폭된다. 본 보고서에서, 우리는 또한 게놈 세그먼트 7(NSP3)으로 2A 번역 정지 재시작 원소의 도입을 통해 별도의 형광 리포터 단백질을 발현하는 재조합 로타바이러스를 생성하기 위한 접근법을 설명한다. 이 접근법은 바이러스 성 개방 판독 프레임 중 어느 것을 삭제하거나 수정하는 것을 방지하여 형광 단백질을 발현하면서 완전한 기능의 바이러스 성 단백질을 유지하는 재조합 로타바이러스의 생산을 허용합니다.
서론
로타 바이러스는 유아와 어린 아이들에 있는 가혹한 위장염의 중요한 원인, 뿐만 아니라 많은 그밖 포유류 및 조류 종의 젊은1. Reoviridae 가족의 일원으로서, 로타바이러스는 분할된 이중 가닥 RNA (dsRNA) 게놈이 있습니다. 게놈 세그먼트는 단백질2의3개의 동심 층에서 형성된 비 봉투에 싸인 icosahedral virion 안에 포함됩니다. 게놈 세그먼트의 시퀀싱 및 계통유전학 적 분석에 기초하여, 9종의 로타바이러스(A−D, F−J)가3가지로정의되었다. 로타바이러스 종 A를 포함하는 이들 균주는 대부분의 인간 질환에 대한 책임이 있다4. 지난 10 년 에서 시작 된 어린 시절 예방 접종 프로그램에 로타 바이러스 백신의 도입은 로타 바이러스 사망률과 이환율의 상당한 감소와 상관 관계가 있습니다. 가장 주목할 만한, 로타 바이러스 관련 어린 시절 죽음의 수는 2000년에 대략 528,000에서 2016년에 128,500에4,,5로감소했습니다. 로타바이러스 백신은 생후 6개월까지 어린이에게 2....
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프로토콜
1. 배지 준비 및 세포 배양 유지 보수
- T7 RNA 폴리머라제(BHK-T7) 및 아프리카 녹색 원숭이 신장 MA104 세포를 구성하는 아기 햄스터 신장 세포를 구한다.
참고: BHK-T7 (또는 BSR-T7) 세포는 상업적으로 유효하지 않습니다, 그러나 RNA 바이러스 생물학을 공부하기 위하여 역유전학을 사용하여 실험실의 일반적인 세포주입니다. 본 프로토콜에 사용된 BHK-T7 세포주박사는 T7 RNA 폴리머라제29를발현하는 본래 BHK 세포주의 공동 개발사인 우르술라 J. Buchholz 박사(미국 국립보건원, 베데스다, MD, 미국)로부터 수득되었다. MA104 세포는 인증된 세포 배양(ECACC)의 유럽 컬렉션과 미국 유형 배양 컬렉션(ATCC)에서 구할 수 있습니다. - 멸균 환경에서 다음 배양 배지를 제조하는 것은 바람직하게는 Class II 생물학적 안전 캐비닛이다. 사용 직전에 4°C에서 어두운 장소에서 37°C로 따뜻하게 매체를 저장합니다.
참고: 미디어 구성 요소의 소스는 재료 표에제공됩니다.- DMEM 불완전한 배지를 준비하려면, 4.5 g/L 글루코스와 1% 글루타민을 함유한 덜베코의 수정된 이글의 최소 필수 배지(MEM) 500 mL와 100....
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결과
이 문서에서 기술된 역유전학 프로토콜은 여러 가지 뚜렷한 단계를 통해 진행됩니다: (1) 로타바이러스 pT7 전사 벡터와 pCMV/NP868R 발현 플라스미드를 가진 BHK-T7 세포의 공동 형질전환, (2) MA104 세포를 이용한 형질감염된 BHK-T7 세포의 감독, (3) MA104 세포를 사용하여 BHK-T7/MA104 세포에 존재하는 재조합 바이러스의 증폭, (4) MA104 세포를 이용한 재조합 바이러스의 플라크분리(그림 2). 우리의 손에, 프로토콜은 효율적입니다, BHK-T7 / MA104 세포에서 재조합 야생형 SA11 바이러스 (rSA11 / wt)의 타이터를 산출 ~ 104 PFU / mL의 및 증폭 MA104 세포 용해 >1 x 107 PFU / mL. FPs를 발현하는 변형된 pT7/NSP3SA11 플라스미드를 사용하여 역유전학에 의해 생성된 SA11 재조합 바이러스(예를 들어, rSA11/NSP3-2A-3x.......
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토론
우리의 실험실에서, 우리는 재조합 SA11 로타바이러스를 생성하기 위하여 본원에 기술된 역유전학 프로토콜에 일상적으로 의존한다. 이 접근으로, 분자 생물학 기술에 있는 작은 경험이 있는 개별 또는 rotaviruses로 일하는 것은 그들의 첫번째 시도조차 재조합 바이러스를 복구합니다. 우리는 이 프로토콜에 따라 거의 100개의 재조합 바이러스를 생성했는데, 여기에는 외래 단백질(예를 들어, FPs)을 발현하기 위해 재설계되고 서열 추가, 삭제 및 점 돌연변이를 포함하는 게놈이 있는 바이러스가 있습니다.
이 프로토콜에 주어진 조건 및 배양 시간은 재조합 바이러스의 잘 성장하는 균주의 회복에 적용된다. 유전자 변형으로 인해 제대로 성장할 것으로 예상될 수 있는 SA11 바이러스를 복구하려고 시도하는 경우 조정을 고려해야 합니다. 특히, 형질감염된 BHK-T7/MA014 세포에서 이러한 바이러스의 역가가 낮을 수 있기 때문에, 우리는 전형적으로 후속 증폭 단계에서 접종으로 사용되는 용.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 NIH 보조금 R03 AI131072 및 R21 AI144881, 인디애나 대학 창업 자금, 로렌스 M. 블랫 인다우먼트에 의해 지원되었다. 우리는 IU 로타후시에 실험실의 구성원, 울리히 Desselberger, 및 귀도 파파 역 유전학 프로토콜을 개발에 그들의 많은 기여와 제안에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아기 햄스터 신장 - T7 RdRP (BHK-T7) 세포 | 접촉: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| 유능한 대장균 DH5alpha 박테리아 | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease 억제제 | Pierce | A32965 | |
| 일회용 전사 피펫, 초미세 확장 팁 | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| 독수리의 최소 필수 매체, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| 에탄올, 절대 (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| 에티듐 브로마이드 용액 (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| 소 태아 혈청 (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| 소 태아 혈청 (FBS), 열 비활성화 | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 항체, 마우스 단클론 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | 낮은 배경 포함 DMEM 형광 |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| 말 항기니피그 IgG, 양고추냉이 과산화효소(HRP) 공액 | KPL | 5220-0366 | |
| 말 항-마우스 IgG, 양고추냉이 에록시다제(HRP) 접합 | 세포 신호 전달 기술 | 7076S | |
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| SA11 pT7 / NSP3 전사 벡터 형광 단백질 | 발현 연락처 : jtpatton@iu.edu | ||
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| Tris-Glycine-SDS 겔 러닝 버퍼(10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA 추출 시약 | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| 트립신(0.05%)-EDTA(0.1%) 세포 해리 용액 | 품질 생물학 | 118-087-721 | |
| 트립토스 인산염 육수 | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF 솔벤트 | Zoro | G0707178 | |
| Zoe 형광 라이브 셀 이미저 | Bio-Rad |
참고문헌
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- Intern....
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