Summary
تقدم هذه المخطوطة بروتوكولاً للحث على التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي النشط (EAE) في الفئران. كما يتم تقديم طريقة لعزل وتوصيف الخلايا الليمفاوية المتسللة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) لإظهار كيفية مشاركة الخلايا الليمفاوية في تطور مرض المناعة الذاتية للجهاز العصبي المركزي.
Abstract
التصلب المتعدد (MS) هو مرض المناعة الذاتية للجهاز العصبي المركزي (CNS) الناجم عن مزيج من العوامل البيئية والخلفية الوراثية المعرضة للخطر. التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج مرض نموذجي من التصلب المتعدد يستخدم على نطاق واسع للتحقيق في التسبب في الأمراض التي تائية الخلايا الليمفاوية محددة لمستضدات المايلين بدء تفاعل التهابي في الجهاز العصبي المركزي. من المهم جدا لتقييم كيفية الخلايا الليمفاوية في الجهاز العصبي المركزي تنظيم تطور المرض. ومع ذلك ، فإن نهج قياس كمية ونوعية الخلايا الليمفاوية المخترقة في الجهاز العصبي المركزي محدودة للغاية بسبب الصعوبات في عزل واكتشاف الخلايا الليمفاوية المتسللة من الدماغ. تقدم هذه المخطوطة بروتوكولاً يفيد في عزل الخلايا اللمفاوية المخترقة من الجهاز العصبي المركزي وتحديدها وتوصيفها، وستكون مفيدة لفهمنا لكيفية مشاركة الخلايا اللمفاوية في تطوير مرض المناعة الذاتية التابع لل CNS.
Introduction
كما مرض مزمن إزالة الغموض من الجهاز العصبي المركزي, التصلب المتعدد يؤثر على حوالي 2.5 مليون شخص في جميع أنحاء العالم، ويفتقر إلى العلاجات العلاجية1. كما يعتبر مرض المناعة الذاتية, التي مستضد الميالين محددة T اللمفاويات بدء رد فعل التهابي ويؤدي إلى إزالة الغموض وإصابة محورية في الجهاز العصبي المركزي2. وقد استخدمت على نطاق واسع اختبارية المناعة الذاتية التهاب الدماغ (EAE) للتحقيق في الآليات المسببة للأمراض من مرض التصلب العصبي المتعدد كنموذج كلاسيكي لمرض المناعة الذاتية في الجهاز العصبي المركزي3. هناك طريقتان للحث EAE: واحدة هو حث EAE بنشاط عن طريق تحصين الحيوانات مع مكونات الميالين، وآخر هو نقل بالتبني عن طريق نقل الخلايا التائية الدماغية إلى مستقبلات2،4،5. وssceptibilities إلى EAE مختلفة في سلالات الحيوانات المختلفة6. في C57BL/6 الفئران، myelin oligodendrocyte الجليكوبروتين (MOG) 35-55 التحدي يدفع مرض أحادي الطور مع إزالة الغموض واسعة والتهاب في الجهاز العصبي المركزي، والذي يستخدم في كثير من الأحيان في التجارب مع الفئران الجينات المستهدفة7.
مطلوب توليد خلايا T التفاعلية الخاصة بالميلين لحدوث المرض وتطوره في EAE وهو علامة مناعية لكل من EAE وMS. الخلايا الليمفاوية التائية النشطة تلقائيًا عبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) في الجهاز العصبي المركزي الصحي وبدء مرض EAE. عندما واجهت MOG 35-55 Ag, هذه الخلايا الليمفاوية T الحث التهاب وتجنيد الخلايا في الجهاز العصبي المركزي, مما أدى إلى إزالة الغموض وتدمير محور عصبي8,9. في نموذج EAE ، هناك أدلة وافرة على أن الخلايا CD4+ T الخاصة بـ neuroantigen يمكن أن تبدأ وتحافظ على التهاب الأعصاب وعلم الأمراض3،10. اعتمادا على السيتوكينات الرئيسية المنتجة، تم تصنيف CD4+ T الخلايا الليمفاوية في مجموعات فرعية مختلفة: Th1 (تتميز بإنتاج الإنترفيرون-γ)، Th2 (تتميز بإنتاج إنترلوكين 4)، و Th17 (تتميز بإنتاج إنترلوكين 17). ويعتقد أن تفعيل Th1 وTh17 الخلايا تسهم في الاستقراء والصيانة والتنظيم من إزالة الغموض الالتهابي في EAE وMS عن طريق إفراز المنشطات cytokines IFN-γ و IL-17، والتي هي قادرة على تفعيل الضامة وتجنيد العدلات للمواقع الالتهابية لتسريع الآفات11.
لأن الخلايا التائية T عبور BBB في الجهاز العصبي المركزي والحث على تطور المرض في مرض التصلب العصبي المتعدد وEAE، من المهم جدا لتحليل الخلايا التائية في الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك، هناك عدد قليل جدا من البروتوكولات المنشأة لعزل الخلايا الليمفاوية من الجهاز العصبي المركزي12. لذلك، تم تطوير طريقة محسنة لعزل الخلايا أحادية النوى من الدماغ وتحليل الخلايا الليمفاوية T مع علامات CD45، CD11b، CD3، CD4، INF-g، و IL-17 للمعالجة الخلية تدفق. تستخدم هذه الطريقة MOG35-55 adjuvant Mycobacterium Tuberculoss H37 Ra و Pertussis التكسين حل العمل (PTX) للحث على نموذج التمنيع النشط من EAE في الفئران. ثم يتم استخدام طرق الطرد المركزي للانفصال الميكانيكي والكثافة لعزل خلايا النوى الأحادية في الجهاز العصبي المركزي. وأخيراً، يتم استخدام استراتيجية جسور جسور للخلايا تدفق الأمثل لتحديد الخلايا الليمفاوية T و المجموعات الفرعية من الدماغ عن طريق تلطيخ علامات متعددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت لجنة الحيوان التابعة لكلية العلوم الطبية الاساسية بجامعة شانغهاى جياو تونغ على جميع الاساليب الموصوفة هنا .
1- إعداد المواد
- استخدم تسلسل MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK MOG35-55 للحصول على الببتيد المنضب من المصادر التجارية. تأكد من أن نقاء الببتيد هو > 95٪. إعداد 10 ملغ / مل MOG حل المخزون في محلول الفوسفات المخزنة (PBS) وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- إعداد 4 ملغ / مل حل المخزون من M. السل H37 رع عن طريق وضع واحد 100 ملغ أنبوب من مرض السل H37 رع في 25 مل من أكمل فرويند 'sDjuvant (CFA) والاختلاط. تخزين حل الأسهم في -20 درجة مئوية.
- إعداد 1 نانوغرام /μL Pertussis حل عمل التكسين (PTX) عن طريق إضافة 50 ميكروغرام من PTX إلى 50 مل من برنامج تلفزيوني. تخزين حل العمل في -20 درجة مئوية.
- تخزين جميع الأجسام المضادة (أي، FITC المضادة للماوس CD3، PE/Cy7 المضادة للماوس CD4، PerCP/Cy5.5 المضادة للماوس CD11b، اليكسا Fluor700 المضادة للماوس CD45.2، PE المضادة للماوس IL-17A، وAPC المضادة للماوس IFN-γ) في 4 درجة مئوية.
- جعل تدفق الخلايا التلطين (FCS) العازلة عن طريق إضافة 2 mM اثيلين ديامين حمض رباعية (EDTA) و 1٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) إلى 500 مل من برنامج تلفزيوني.
2- إسكان فئران C57BL/6
- استخدام الفئران C57BL/6 الإناث في 8-12 أسابيع من العمر.
- فئران C57BL/6J المتأقلمة لمدة 7 أيام على الأقل قبل الحقن.
- فئران المنزل في منشأة حيوانية في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض في درجة حرارة ثابتة والرطوبة في دورة 12 ساعة خفيفة / داكنة وتوفر حرية الوصول إلى الماء والغذاء بيليه القياسية.
3- تحصين فئران C57BL/6
- اترك جميع حلول الأسهم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) لضمان الإماهة الكاملة.
- تمييع 300 ميكرولتر من MOG-ببتيد حل الأسهم مع 700 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لإعداد 3 ملغ / مل حل العمل.
- وضع 1 مل من M. السل H37 حل الأسهم رع و 1 مل من MOG35-55 الببتيدات حل العمل في الحقن 10 مل منفصلة, ثم استخدام الديك وقف رباعية للاستفادة من 10 دقيقة على الأقل. ضمان مستحلب كامل قبل الحقن.
- تخدير الفئران في ذروة EAE مع حقن داخل الرحم من 1٪ بينتوباربيتال الصوديوم (50 ملغ / كجم).
- مع حقنة 1 مل، حقن الفئران تحت الجلد مع 100 ميكرولتر من مستحلب MOG 35-55/CFA (300 ميكروغرام/200 ميكرولتر) في موقعين، وكلاهما في الجزء الخلفي بالقرب من الرقبة. حقن تحت الجلد الفئران التحكم مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
- في نفس اليوم (اليوم 0) وفي اليوم 2 بعد التحصين (PI)، Intraperitoneally حقن الفئران مع 200 ميكرولتر من 1 نانوغرام /ميكرولتر PTX حل العمل. Intraperitoneally حقن الفئران التحكم مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
- نقل الفئران إلى قفص وطنهم مع وسادة الاحترار.
- فحص و تصنيف جميع الفئران كل يوم بعد الحقن بطريقة عمياء للعلامات العصبية الموضحة في الجدول 1 1111,13. القتل الرحيم الحيوانات إذا كانت الدرجات أسوأ من الصف 4.
- سجل التغيرات في الوزن خلال دورة المرض. هذا هو مقياس إضافي قيمة لنشاط المرض في EAE نموذج11،13.
- إضافة اليوم الأول من علامات سريرية للفئران الفردية وتقسيمها على عدد الفئران في المجموعة; والنتيجة هي البداية. إضافة اليوم الأول من درجة EAE القصوى للماوس الفردية والقسمة على عدد الفئران في المجموعة؛ والنتيجة هي الذروة.
4. إعداد تعليق وحيد الخلية من الدماغ
- تخفيف كثافة التدرج المتوسط في نسبة 9:1 مع برنامج تلفزيوني في أنبوب مخروطي 15 مل لتسفر عن حل نهائي 100٪.
- تخدير الفئران في ذروة EAE مع حقن داخل الصفاق من 1٪ بينتوباربيتال الصوديوم (50 ملغ / كجم) و perfuse intracardially مع 20 مل من الجليد الباردة العقيمة PBS. تحقيق هذا عن طريق حقن ببطء وباطراد برنامج تلفزيوني في البطين الأيسر للقلب باستخدام حقنة 20 مل وفتح الأذين الأيمن.
- قطع الجمجمة بعناية من الأنف إلى الرقبة، ثم إزالة الدماغ من مربع الجمجمة إلى 10 مل من دورة في الدقيقة في أنابيب مخروطية 50 مل. تخلط جيدا لإزالة خلايا الدم الحمراء الملتزم بها. ثم إزالة المتوسطة عن طريق الطموح وإضافة 10 مل من RPMI.
- وضع العقل والمتوسطة في طبق 100 مم. ختم ناعما مع شفرة حلاقة.
- نقل 6 مل من الطبق إلى الجليد الباردة 7 مل المجانسة الزجاج الملتكز مع ماصة نظيفة. تجنب ترك كميات كبيرة من الأنسجة في الماصات. كمية صغيرة لا مفر منها.
- طحن الدماغ باستخدام "فضفاضة" المكبس من الآفات الأولى، ثم استخدام "ضيق" المكبس حتى تعليق متجانسة، وتصب في أنبوب مخروطي 15 مل والاحتفاظ بها على الجليد.
- بعد أن يتم تجانس كافة العينات، قم بتقدير وحدة التخزين. اضبط مستوى الصوت باستخدام RPMI إلى 7 مل. ثم ضع 3 مل من الجليد الباردة 100٪ مصفوفة غشاء الطابق السفلي في أنبوب مركزي مخروطي 15 مل مخروطية المبردة وإضافة 7 مل من تجانس الدماغ لتسفر عن 30٪ كثافة النهائي الانحدار المتوسطة. مزيج من قبل عكس بضع مرات. لا دوامة.
- لضمان واجهة حادة، بعناية وببطء إضافة 1 مل من 70٪ تحت كثافة المتوسطة في دورة في الدقيقة مع ماصة 3 مل.
- جهاز طرد مركزي عند 800 x ز فقط 20 دقيقة عند 4 درجة مئوية. تعيين التسارع إلى 1 والتباطؤ إلى 0. بعد الطرد المركزي، والتعرق تقريبا كل من المرحلة العليا، مع الحرص على إزالة تماما myelin في الجزء العلوي (الشكل 1).
- قم بإزالة الواجهة إلى أنبوب جديد من أجهزة الطرد المركزي 15. اضبط مستوى الصوت إلى 10 مل مع RPMI.
- جهاز طرد مركزي في 500 × ز لمدة 10 دقيقة. بعد الطرد المركزي، استلهموا المغرور. Resuspend بيليه في ~ 200 ميكرولتر من تدفق التلطخ cytometry (FSC) العازلة. الكريات ثم جاهزة لطخة لFACS.
5. تدفق تحليل القياس للخلايا المفردة من الدماغ
- استخدم مقياس الدم والمجهر لحساب الخلايا. إضافة 10 ميكرولتر من الخلايا إلى 10 ميكرولتر من الأزرق trypan، مزيج جيدا، ووضع 10 ميكرولتر على مقياس الهيموسيتلت لحساب الخلايا. ثم حساب عدد الخلايا الحية لكل ميكرولتر تحت مجهر مقلوب (على سبيل المثال، مجهر أوليمبوس المقلوب).
- Aliquot تقريبا 2 × 106 من الخلايا في RPMI في بئر واحد من 96 بئر.
- إضافة 500x كوكتيل تحفيز الخلايا بالإضافة إلى مثبطات نقل البروتين إلى الآبار.
- احتضان لوحة في الحاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
- الطرد المركزي الخلايا في 400 × ز لمدة 5 دقائق في RT. تجاهل فائقة وإعادة تعليق الخلايا في 100 μL من FCS العازلة.
- Preincubate الخلايا مع المضادة للماوس CD16/CD32 FC كتلة (1:33) لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية قبل تلطيخ لمنع التفاعلات غير محددة Fc بوساطة.
- علامات سطح الخلية وصمة عار دون غسل. إضافة مضادة للماوس CD45.2 (1:200) ، المضادة للماوس CD11b (1:200) ، المضادة للماوس CD3 (1:200) ، ومكافحة الماوس CD4 (1:200) المضادة الأجسام المضادة.
ملاحظة: لتحديد البوابات الإيجابية والسلبية، يجب أن تكون ملطّخة الفلوريسنس ناقص واحد (FMO) لكل لون و أي جسم مضاد تحكم isotype. - احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة على الأقل في 4 درجة مئوية أو على الجليد. حماية من الضوء.
- اغسل الخلايا عن طريق إضافة المخزن المؤقت FCS. استخدام 200 μL / جيدا للوحات microtiter. الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في RT. تخلص من فائقة.
- أضف 200 ميكرولتر من حاجز التثبيت داخل الخلايا (IC) إلى كل بئر لإصلاح الخلايا. تأكد من أن الخلايا يتم إعادة تعليقها بالكامل في الحل.
- احتضان 30-60 دقيقة في RT. حماية من الضوء.
- الطرد المركزي العينات في 400 س ز في RT لمدة 5 دقائق. تجاهل المُندفع.
- إضافة 200 ميكرولتر من 1x عازلة permeabilization لكل بئر والطرد المركزي العينات في 400 × ز في RT لمدة 5 دقائق. تجاهل المُندفع.
- إعادة بناء بيليه في حجم المتبقية وضبط حجم لحوالي 100 μL مع 1x عازلة permeabilization.
- إضافة المضادة للماوس IL-17A (1:200) ومكافحة الماوس IFN ز (1:200) الأجسام المضادة للكشف عن مستضدات داخل الخلايا إلى الخلايا.
- احتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 4 درجة مئوية. حماية من الضوء.
- إضافة 100 ميكرولتر من 1x عازلة permeabilization لكل بئر والطرد المركزي العينات في 400 × ز في RT لمدة 5 دقائق. تجاهل المُندفع.
- Resuspend الخلايا الملطخة في 100 ميكرولتر من تدفق الخلايا التلطخ العازلة.
- تحليل بواسطة تدفق عملية استئصال الدراجات.
ملاحظة: يتم ضبط إعدادات الليزر والتعويض على مقياس التدفق، ويتم وضع العينات على مقياس السيتا، ويتم تسجيل جميع الأحداث وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة.
6 - تحليل البيانات
- النافردات بوابة باستخدام FSC-A مقابل FSC-H وSSC-A مقابل SSC-H.
- بوابة الخلايا الحية باستخدام FSC-A وSSC-A على أساس الحجم.
- بعد ذلك ، حدد الكريات البيض ، باستثناء أحاديات البيض ، عن طريق ال gating على CD45+ CD11b- الخلايا.
- ثم، تحديد الخلايا الليمفاوية CD4 T عن طريق الغاء على خلايا CD3 + CD4+ .
- وأخيرا، تحديد المجموعات الفرعية Th1 و Th17 عن طريق الغاء على خلايا IFN-γ + والخلايا IL-17 + بشكل منفصل، وتحديد المجموعات السكانية الإيجابية والسلبية باستخدام عناصر تحكم isotype و FMO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد تطعيم فئران C57BL/6، تم وزن جميع الفئران وفحصها وتدّينها يوميًا بحثًا عن العلامات العصبية. وينبغي أن يؤدي الدورة السريرية ممثل EAE في منحنى المرض كما هو معروض في الشكل 2A وتغيير وزن الجسم في الماوس كما هو معروض في الشكل 2B. C57BL/6 الفئران المحصنة مع MOG35-55 بدأت عادة لتطوير أعراض المرض حول اليوم 10-12 وحققت ذروة المرض حول اليوم 15-21 بعد التحصين النشط(الشكل 2A). وكان تغيير الوزن مؤشرا قيما في نموذج EAE. قبل ظهور المرض ، زاد وزن الجسم للفئران المحصنة تدريجيا ، ثم انخفض عادة ارتباطًا مع أعراض المرض المتزايدة. في ذروة EAE، أظهرت الفئران أيضا أدنى وزن الجسم(الشكل 2B). ثم تعافى وزن الجسم قليلاً مع انخفاض الأعراض السريرية. ومع ذلك ، فإن الفئران عادة لا يتعافى تماما. C57BL/6 الفئران وضعت أمراض الأمراض المزمنة أحادية الطور على MOG35-55 التحدي(الشكل 2A).
وترتبط الخطورة السريرية لـ EAE بشكل مباشر بتنشيط الخلايا التىالتلقائية 14. الخلايا العصبية المضادة CD4+ T قادرة على بدء وإدامة الأعصاب وعلم الأمراض في EAE3. والخصائص النموذجية لـ CD4+T الخلايا في ذروة EAE تظهر في الشكل 3. وعلاوة على ذلك، تم تحليل نسبة المجموعات الفرعية Th1 و Th17 في الخلايا المسببة للحساسية، والتي هي الخلايا المسببة للأمراض الرئيسية التي تتوسط في EAE، عن طريق عملية استئصال الخلايا المتدفقة. بعد فصل تعليق خلية واحدة من الدماغ، كانت تلطخت الخلايا مع CD45، CD11b، CD3، CD4، IFN-γ، و IL-17 الأجسام المضادة، والتي يتم التعبير عنها من قبل الخلايا الليمفاوية T. FSC-A مقابل FSC-H وSSC-A مقابل SSC-H تم استخدامها لـ singlets بوابة (الشكل 3A، B) ، ثم تم استخدام FSC-A مقابل SSC-A إلى الخلايا الحية بوابة على أساس حجم و حبيبي(الشكل 3C). بعد، CD45+ CD11b- تم بوابات الخلايا لتحديد الكريات البيض باستثناء monocytes (الشكل 3D). ثم، تم تعيين البوابة على CD3+CD4+ لتحديد CD4+ الخلايا الليمفاوية T (الشكل 3E). وأخيرا، تم استخدام IFN-γ و IL-17 لتحديد المجموعات الفرعية Th1 و Th17 وتقييم التأثير الوظيفي وفقا لcytokines المفعول (الشكل 3F). وفقا لشدة السريرية للمرض, وأظهرت النتائج التمثيلية أن IFN-γ المنتجة Th1 و IL-17-إنتاج خلايا Th17 زيادة كبيرة في الخلايا الدماغية من الفئران EAE.
| الصف | علامة سريرية |
| 0 | لا مرض |
| 1 | انخفاض نغمة الذيل أو مشية خرقاء قليلا |
| 2 | الذيل اتوني والمشية الخرقاء باعتدال و / أو ضعف القدرة على حق |
| 3 | ضعف الأطراف |
| 4 | الشلل في الأطراف |
| 5 | الدولة المحتضرة. |
الجدول 1: نظام التهديف السريري. تم تحصين فئران C57BL/6 باستخدام الببتيد MOG35-55. ثم تم تسجيل علامات عصبية. تم استخدام نظام تسجيل النقاط من 5 نقاط لتقييم شدة EAE.
الشكل 1: تخطيطي لإعداد تدرج Percoll لعزل الخلايا أحادية النوى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: دورة تمثيلية EAE. تم تحريض EAE في فئران C57BL/6 عن طريق حقن MOG35-55 كما هو موضح في البروتوكول. تم تحديد النتيجة السريرية (A) وتغيير وزن الجسم (B) في هذه الفئران. وتقدم البيانات على أنها متوسط ± SEM؛ n = 8 لكل مجموعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل تدفق الخلايا التمثيلية للخلايا في الدماغ. تم عزل تعليق خلية واحدة من الدماغ في ذروة EAE. تظهر استراتيجية البوابات للخلايا اللمفاوية T. تم بوابات المفرد كما FSC-A مقابل FSC-H وSSC-A مقابل SSC-H(A,B). تم بوابات الخلايا الحية كما FSC-A مقابل SSC-A (C). الكريات البيض باستثناء monocytes كانت مسور كما CD45+ CD11b- (D). CD4+ الخلايا الليمفاوية T كانت مسور كما CD3+CD4+ (E). تم بوابات Th1 وTh17 المجموعات الفرعية كما IFN-γ+ و IL-17+ (F). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقدم هذه الدراسة بروتوكولًا للحث على EAE ومراقبته باستخدام MOG35-55 في فئران C57BL/6 ، والتي تعتبر نموذجًا تجريبيًا نموذجيًا لحيوانات الـ MS. EAE يمكن أن يسببه اختلاف سلالات الفئران أو نوع البروتين المستخدم للحث وفقًا لغرض الدراسة. على سبيل المثال، يمكن استخدام PLP139-151 الببتيد في الفئران SJL الحث على دورة مرض EAE الانتكاسية التي تناسب بشكل خاص لتقييم الآثار العلاجية على الانتكاسات15. ويمكن أيضا تطبيق الإجراء التجريبي المبين هنا على بروتوكولات EAE الأخرى7. في هذا النموذج، يتم تحصين الفئران C57BL/6 مع الببتيد MOG35-55 وتطوير مرض أحادي الطور. يتم استخدام نظام تسجيل النقاط من 5 نقاط لتقييم شدة EAE. على الرغم من أن العديد من أنظمة التهديف التي تتراوح بين 0-3 أو 0-10 نقاط تستخدم لتسجيل شدة المرض7،16،17، تظهر هذه النتائج أن نظام التهديف من 5 نقاط قادر على تحديد الاختلافات ذات الأهمية الإحصائية في درجات المرض بين المجموعات وغيرها من أنظمة تسجيل EAE لا تؤدي إلى تحسن واضح.
يتم تقييم خطورة EAE بشكل عام من قبل درجة سريرية EAE مع الأخذ في الاعتبار شدة الخلل العصبي11,13. لضمان قابلية مقارنة التجربة لجميع الفئران ، من المهم الاحتفاظ بها في ظل نفس الظروف ، بما في ذلك تغييرات في القفص ، وإدارة الطعام والماء ، وخاصة ظروف سكن الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أيضا إجراء التحصين الشامل لتجنب الظواهر الخاصة بالأقفاص التي يسببها المحقق.
تقدم هذه الدراسة طريقة لفصل الخلايا أحادية النوى عن الجهاز العصبي المركزي مناسبة لتحليل FACS أو الدراسة الوظيفية. لضمان إزالة الدم من أنسجة الجهاز العصبي المركزي، يجب أن تكون الفئران مُلَكَّمة قبل فصل الأنسجة. تنقية الخلايا أحادية النوى على الطارد المركزي للتدرج الكثافة هي خطوة رئيسية في العزل. ولضمان تأثير الفصل، ينبغي ضبط تسارع جهاز الطرد المركزي وتباطؤه على 1 و0 على التوالي. باستخدام هذه الطريقة، تكون غلة الخلية المفردة منخفضة عادة من الدماغ العادي، ولكنها أعلى من الدماغ المريض مع EAE. تظهر النتائج التمثيلية أن هناك زيادة واضحة في CD3+CD4+ T الخلايا الليمفاوية ، وخاصة الخلايا المنتجة IFN-γ والخلايا المنتجة IL-17 ، والتي تعتبر تساهم في تفاقم المرض.
هناك بعض القيود من هذا البروتوكول. نموذج EAE المستحثة مع MOG35-55 يظهر أساسا CD4+ T الخلية يحركها استجابة مناعية. إذا كان دور الخلايا CD8+ T والخلايا B بحاجة إلى تحليل، يجب النظر في بروتوكولات بديلة. كما مرض التهابية الجهاز العصبي المركزي، تم العثور على النمط الظاهري المرضي الشديد أيضا في الحبل الشوكي في نموذج EAE. ومع ذلك، نظرا لوجود كميات كبيرة من الميلين، فمن الصعب الحصول على ما يكفي من الخلايا المفردة من الحبل الشوكي لتحليل FACS. في هذه الحالة، هناك حاجة إلى استخدام الكيمياء المناعية أو المناعة لتحليل أنسجة الحبل الشوكي. وهناك أيضا الباحثين التي وضعت الدماغ والحبل الشوكي معا لفصل خلايا أحادية النوى لتحليل FACS12. يفصل هذا البروتوكول الخلايا الفردية عن الدماغ لتحليل FACS وأنسجة الحبل الشوكي من أجل تحليل المناعة والفلورية المناعية.
وقد تلقت أهمية الخلايا الليمفاوية T في تنظيم المناعة من مرض التصلب العصبي المتعدد وEAE المزيد والمزيد من الاهتمام في الآونة الأخيرة. الكثير من الأدب المنشور يركز على الطحال والغدد الليمفاوية11; ومع ذلك، تم العثور على الخلايا الليمفاوية في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي من الفئران EAE، وبالتالي، فإن التحليل المميز للخلايا اللمفاوية T في الجهاز العصبي المركزي ضروري. يمكن أن يحدد التلطّخ المناعي للقطع الخلايا المخترقة في الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، تحليل الظاهري والوظيفية محدودة. بعد عزل الخلايا المناعية من الجهاز العصبي المركزي للفئران العادية أو المريضة ، يصبح تحليل الأنماط الظاهرية الأكثر تفصيلاً ممكنًا. مع هذه الطريقة، يمكن دراسة الخلايا الليمفاوية T في الدماغ على أساس خلية على حدة، والتعبير عن علامات سطح مختلفة، السيتوكينات، كيموكينيات، وعوامل النسخ (على سبيل المثال، البروتينات داخل الخلايا) يمكن تحليلها بشكل أفضل. سيكون البروتوكول مفيدًا للدراسات المستقبلية لتقييم النمط الظاهري ووظيفة الخلايا الليمفاوية التائية في الدماغ أثناء مسار التصلب المتعدد وEAE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح ليعلنوا عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين منحة (31570921 إلى ZJ، 81571533 إلى LS)، لجنة شنغهاي البلدية للصحة، وتنظيم الأسرة (201540206 إلى ZJ)، Ruijin مستشفى الشمال منحة البحوث (2017ZX01 إلى ZJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
References
- Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
- Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
- Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
- Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
- Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R. Immunology of multiple sclerosis. Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).
- McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
- Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
- Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
- Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
- Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15, Unit 15 11 (2007).
- Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).
