一种用于刺激骨细胞力传导及分析骨重塑功能结果的芯片实验室平台

摘要

本文介绍了在芯片实验室平台上分析骨重塑的实验方案。该平台可与3D打印的机械加载装置联用，通过形变细胞基质来诱导骨细胞的机械转导。该平台还可用于定量评估破骨细胞和成骨细胞介导的骨重塑功能结果（吸收/形成）。

摘要

骨重建是一个受到严密调控的过程，对于骨骼的生长与修复以及适应机械环境的变化至关重要。在此过程中，机械敏感性骨细胞调控着分解代谢的破骨细胞与合成代谢的成骨细胞之间的拮抗反应。为了更深入地理解调控该过程的复杂信号通路，我们实验室开发了一种基础性的芯片实验室（LOC）平台，可在小规模系统内分析骨重建的功能性结果（形成与吸收）。由于骨重建是一个持续数周至数月的长期过程，我们在此系统中建立了长期细胞培养方案。成骨细胞和破骨细胞在LOC内的功能性活性基质上培养，并维持长达七周。随后拆卸芯片，以便定量分析骨形成与骨吸收。此外，我们设计了一种3D打印的机械加载装置，可与LOC平台配合使用，通过形变细胞基质来诱导骨细胞的机械转导。我们已优化了LOC平台内骨细胞、成骨细胞和破骨细胞的细胞培养方案，并解决了无菌性和细胞毒性方面的问题。本文介绍了LOC的制备与灭菌、在功能性基质上接种细胞、施加机械负荷以及拆卸LOC以量化终点结果的实验方案。我们认为，这些技术为构建真正意义上的骨重建类器官芯片奠定了基础。

引言

骨是一种高度动态的组织，其功能依赖于三种主要细胞类型——骨细胞、成骨细胞和破骨细胞之间的复杂协调。这些细胞之间的多细胞相互作用，既导致了瘫痪和长期不动所引发的骨量丢失，也介导了生长和运动刺激所引起的骨形成。骨细胞是骨组织中最丰富的细胞类型，对施加于骨的机械刺激具有高度敏感性。机械刺激会改变骨细胞的代谢活性，并导致关键信号分子的增加^1,2。通过这一被称为“机械转导”的过程，骨细胞能够直接调控成骨细胞（骨形成细胞）和破骨细胞（骨吸收细胞）的活动。维持骨稳态需要骨形成与骨吸收速率之间的精确平衡；然而，这一过程的紊乱可导致骨质疏松症或骨硬化症等疾病状态。

这三种细胞类型之间相互作用的复杂性非常适合利用微流控和芯片实验室（LOC）技术进行研究。为此，我们实验室近期已成功建立了一种用于分析骨重建过程中骨吸收与骨形成（功能结果）的LOC平台的概念验证。该平台可用于细胞间相互作用、不同力学载荷环境以及药物筛选研究。近年来，已有多种微流控装置被开发用于研究调控骨重建的分子信号通路；然而，这些系统中的许多仅通过间接标志物来量化骨重建过程，而这些标志物仅能反映功能活性^3,4,5,

方案

1. 芯片掩模制备

注意：步骤 1.1 - 1.3 仅需在首次收到芯片掩膜时执行一次，以确保掩膜在使用过程中不会发生弯曲。^11,14 微流控掩膜的设计此前已有描述。掩膜由本实验室自行设计，并通过商业途径采用高分辨率立体光刻技术加工制成（图 1A）。

1. 用塑料薄膜覆盖掩膜的顶面，以保护该表面免受粘合剂污染。使用喷雾粘合剂将芯片掩膜固定在尺寸相同的亚克力板上。将两部分用夹具夹紧过夜，使粘合剂充分固化。待粘合剂干燥后，从掩膜顶部移除塑料薄膜。
2. 使用双面胶带将亚克力板的底部固定到一个3D打印的调平盒上（补充图1，补充文件1-4）。用力按压，确保粘接牢固。
3. 使用防水密封剂密封调平盒可拆卸壁附近的任何小缝隙。让密封剂固化24小时。
4. 用70%乙醇（EtOH）清洁掩膜表面。将带有目标芯片掩膜的调平盒放入烘箱中。使用数字量角器确保掩膜顶部水平，必要时调节调平螺丝。

2. PDMS 制备

注意：功能活性（形成与吸收）检测采用浅孔（1 mm）芯片设计，而机....

结果

浅孔结构可用于分析成骨细胞和破骨细胞的功能活性。通过成骨细胞介导的骨形成以及通过破骨细胞介导的骨吸收，通常需要数周至数月的培养时间。使用茜素红和冯·科萨染色法对MC3T3-E1前成骨细胞的骨形成情况进行定量分析^11,15。在第49天，茜素红染色的平均表面积为10.7% ± 2.2%（均值 ± 均值标准误）¹¹，冯·科萨染色的平均表面积为6.4% ± 1.6%¹¹。图4A展示了第49天成骨细胞培养中经茜素红和冯·科萨染色后的典型骨形成结果。使用甲苯胺蓝染色法对RAW264.7前破骨细胞的骨吸收情况进行定量分析^11,15。在第30天，甲苯胺蓝染色的平均表面积.......

讨论

本文介绍了构建用于培养骨细胞、破骨细胞和成骨细胞的骨重塑器官芯片平台的基础方法。通过改变芯片内微孔的深度和尺寸，开发出多种配置，用于对骨细胞施加机械负荷，并量化骨重塑的功能性结果（图1B）。

在芯片组装过程中，优化等离子体氧化方案对于消除泄漏问题至关重要。我们发现，将PDMS表面暴露于中等射频功率（约10.2 W）条件下产生的氧气等离子体中30秒（步骤4.1），足以在各层之间形成牢固的键合。当使用更长的处理时间或更高的射频功率时，键合的完整性会下降。这与先前的报道一致，即PDMS过度暴露于氧气等离子体会增加表面粗糙度并降低粘附性^17,18。

此外，细胞存活率和典型细胞形态的维持在很大程度上依赖于PDMS的固化过程。PDMS聚合物由交联的二甲基硅氧烷低聚物组成。该交联过程受时间和温度共同影响；然而，即使经过充分固化，聚合.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
亚克力板	Optix	--	3.175 mm 厚
斜口分液尖	Jensen Global	JG18-0.5X-90	使用前移除塑料连接头
活检打孔器	Robbins Instruments	RBP-10	直径 1 mm
骨片	Boneslices.com	0.4 mm 厚	牛皮质骨
新生牛血清	Hyclone	SH30072
卡尺	Global Industrial	T9F534164
细胞刮刀	TPP	99010
芯片掩模	ProtoLabs	定制设计	打印材料：Accura SL 5530
打孔器	Fisher Scientific	07-865-10B
棉签	Puritan	806-WCL
培养皿（100 mm）	Corning	430591	无菌，非组织培养处理
培养皿（150 mm）	Corning	430597	无菌，非组织培养处理
双面胶带	3M Company	Scotch 237
胎牛血清	Hyclone	SH30910
镊子	Fisher Scientific	22-327379
调平盒	定制	--	3D 打印
遮蔽胶带	3M Company	Scoth 2600
MC3T3-E1 前成骨细胞	ATCC	CRL-2593	亚克隆 4
机械加载装置	定制	--	3D 打印
最低必需培养基 α 液	Gibco	12571-063
MLO-Y4 骨细胞	--	--	由 Lynda Bonewald 博士惠赠
包装胶带	Duck Brand	--	标准包装胶带
石蜡膜	Bemis Parafilm	PM999
青霉素/链霉素	Invitrogen	p4333
等离子清洗机	Harrick Plasma	PDC-001	扩展型等离子清洗机
聚二甲基硅氧烷试剂盒	Dow Corning	Sylgard 184
聚苯乙烯盖玻片	Nunc Thermanox	174942	无菌，组织培养处理
烘箱	Quincy Lab	12-180
RAW264.7 前破骨细胞	ATCC	TIB-71
手术刀	BD Medical	372611
硅胶管	Saint-Gobain Tygon	ABW00001	内径：1/32" (0.79 mm)，外径：3/32" (2.38 mm)
SolidWorks 软件	Dassault Systèmes	--	用于生成 3D 打印模型并进行有限元分析（FEA）
喷雾粘合剂	Loctite	2323879	多用途粘合剂
注射器（5 ml）	BD Medical	309646	无菌
注射泵	Harvard Apparatus	70-2213	Pump 11 Pico Plus
锥形实验室刮刀	Fisher Scientific	21-401-10
双组分环氧树脂	Loctite	1395391	5 分钟快干型
I 型胶原蛋白	Corning	354236	大鼠尾胶原
真空干燥器	Bel-Art	F42010-0000
防水密封剂	Gorilla	8090001	100% 硅酮密封剂