Summary
我们提出了一种方案，通过消化缓冲液中的连续组织消化、循环离心循环的细胞采集以及使用抗大鼠CD31微珠进行细胞纯化，从大鼠心脏分离内皮和冠状内皮细胞。
Abstract
结果表明，内皮内皮细胞（EECs）和冠状内皮细胞（CECs）在原点、发育、标记和功能上有所不同。因此，这两个细胞群在心脏疾病中起着独特的作用。目前涉及分离内皮细胞的研究研究由ECs和CEC组成的细胞群。该协议概述了一种独立分离这两个细胞群的方法，用于细胞特异性表征。在收集左右心室自由壁后，外表面和内表面的内皮细胞使用消化缓冲液分别释放。外表面和内内侧层的连续消化保留了两个内皮细胞群的分离。通过识别每个种群特有的标记，进一步验证了EE和CEC的单独隔离。基于先前在小鼠心脏中发布的单细胞RNA分析，Npr3、Hapln1和Cdh11基因表达是ECs所独有的; Npr3而Fabp4、Mgll和MgllCd36基因表达是CECs独有的。qPCR数据显示，这些特征标记在各自的样本中具有丰富的表达，表明EEC和CEC分离成功，以及细胞表型的维持，从而进行进一步的细胞特异性功能分析。
Introduction
本文提供了一个详细的协议（从Gladka等人1）的解剖和随后分离的内皮内皮细胞（EECs）和冠状内皮细胞（CECs）从大鼠心脏。独立调查这些细胞群的能力将有助于探索各种心脏病背后的细胞类型特异性机制，这些机制可以作为潜在的治疗目标。然而，一种独立收集这些细胞群的成功方法尚未公布。
中氯在心脏发育和疾病,,1、2、3、4、5、6、72的病因、1标记和功能方面与EE不同。5,6,7,34EEC 源于心脏中皮3的腹腔表面。它们产生于Flk1+祖细胞，响应VEGF和HIF信号，并形成发育心脏三个离散区域的最内层：中庭、心室和窦静脉间3，6。6遗传谱系追踪表明，共和静脉间细胞的多能内卡细胞衍生出静脉细胞，它们迁移形成亚皮细胞层3。随后，亚皮质层分化成冠状动脉和静脉，包括中氯体，它们仍然穿过外围心室自由壁33、4。4这种内皮通路由VEGFC、ELA/APJ和SOX17信号33、4、6、8、94,6,8,9调节。心室内卡通过未知机制3得出干预性隔膜的CCS较少。随后，EEC 和 CEC 之间的局部分化由特定于这两个细胞群的标记建议，包括 CCS 中的5, Mgll、Fabp4和Cd36表达，或 EEC中的, Npr3、Cdh11和Hapln1 表达式。 Fabp4,
EE 和 CEC 在心脏功能中起着不同的作用。内卡到膜过渡，阀门形成，腔成熟，流出道调节，和三角管开发取决于EECs6。或者，CEC有助于血管运动性音和冠状动脉炎症11。这些功能差异导致疾病发展中的个体作用4,4，12。例如，有证据表明，功能故障的EEC可能导致先天性瓣膜疾病6，非压状心肌6，心律失常作用6，心肌纤维化13，左心脏低塑性综合征13，心室发育不良13，心脏肥大12。同样，研究发现异常的CECs导致冠状动脉疾病14和血栓形成11。
成功分离EE和中氯是全面了解这两个细胞群的必要条件，这两种细胞群可用于研究和临床环境。确定这些细胞群的生长和分化因子将为诱导多能干细胞（iPSCs）的内皮亚型的分化提供参考。此外，完整地识别 EEC 和 CC 的发展、调节和功能的差异对于以细胞类型特定的方式了解导致许多心脏病的基因组和表观基因组因子至关重要。本文概述了独立收集EE和CECs的步骤，并通过评估细胞类型特异性标记的基因表达水平提供分离证据。
Protocol
所有动物程序都得到斯坦福大学实验室动物护理行政小组（APLAC31608）的批准。
1. 准备缓冲区
- 使用表 1中列出的试剂准备消化缓冲液。
- 准备 DNase I 库存解决方案：将 DNase I 溶解在无 Nase 水中，用于 2，000 个单位/mL（1 mg/mL）的库存溶液。在 -20°C 下储存库存溶液。
- 准备脱脂溶液：用无RNase水溶解脱脂酶，用于5mg/mL的库存溶液。在 4 °C 下将其旋转在滚子堆上 30 分钟。
- 通过稀释0.50米乙酰二甲二甲酸 （EDTA） 和 10% 牛血清白蛋白 （BSA） 库存溶液，使用 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 制备分拣缓冲液，最终浓度为 EDTA 的 2 mM 和 BSA 的 0.5%。
2. 心脏收藏
注：本协议使用了六只重达50~100克的斯普拉格道利大鼠。未观察到性别差异。
- 用CO2对大鼠进行安乐死，并将其置于解剖平台上的上接位置。将四肢固定下来，用70%乙醇对腹部和胸部进行消毒。
- 用剪刀打开腹部，将21 G针插入位于肠后静脉的后部分。将注射器柱塞拉回来，从静脉中取出血液，直到肝脏颜色变浅，不能再抽血，表明有足够的血液去除。
- 使用剪刀，小心打开胸部，以避免损害肺部和心脏。用钳子抬起主动脉/中庭，切主动脉、肺动脉、肺静脉和静脉，以释放和取出心脏。
- 用50 mL的冷1x汉克斯平衡盐溶液（HBSS）缓冲液3倍来洗净心脏，去除过多的血液。
- 在微切显微镜下，将右心室自由壁取出至含有Dulbecco改性鹰介质（DMEM）（图1A、B）的5mL管中B。
- 把心放在它更平坦的后脸上，以识别左右两侧。
- 找到肺动脉，最前部的静脉和动脉从心脏顶部分支，穿过肺动脉，向下切入右心室。在心脏的前脸，沿着隔膜切割，直到到达顶点。继续沿着隔膜从心脏后侧向上切割，直到肺动脉和右心室结点（图1A）。
- 从肺动脉和右心室结点开始，垂直地将心脏的前侧和后侧垂直地切合到以前的解剖，远离隔膜，直到右心室自由壁从心脏的其余部分中解放出来（图1B）。
- 在微切显微镜下，将左心室自由壁取出为含有DMEM的5mL管（图1C，D）。D
- 找到主动脉，从肺动脉后面的心脏顶部分支，重复步骤2.5中描述的方法，切断左心室自由壁。
3. EEC 消化
- 将左右心室自由壁组织放在60厘米培养皿中，内表面平躺，朝下放置（图2）。
注：内表面是微凹形心室的内面，如图2A所示，C所示。 - 将0.5~1 mL的消化缓冲液加入到盘中，将移液器的尖端直接放在组织下方。继续，直到只有内部表面浸没。
- 在5%CO 2，37°C孵化器中孵育该菜5分钟。2
- 将 EC 介质添加到培养盘中以停止消化。
注：将消化缓冲液量保持在EC介质的1：5比率。 - 使用 1 mL 移液器用 EC 介质冲洗心室的内表面，并通过 40 mm 滤网将径流转移到 50 mL 收集管中（图 2E）。将藏品保存在冰上，以便下游净化。
4. CEC消化
- 沿着左心室的外表面切开，不受内层污染（图2B，D），并分别放入D一个单独的5 mL管中，含有1 mL的消化缓冲液。
注：左心室可确定为较厚的心室，外表面可确定为轻微凹裂室的外表面。 - 使用解剖剪刀，将心室壁切成小，1毫米3件。
- 将管子孵育在37°C的水浴中约15~20分钟。涡旋每2~3分钟。
- 移液器 4 mL EC 介质进入 5 mL 管，以终止消化。
- 通过40mm滤网将溶液与5 mL血清移液器转移到50 mL管中（图2E）。将藏品保存在冰上，以便下游净化。
5. 细胞集合
- 在室温 （RT） 下，将管子在 300 x g下离心 10 分钟，然后吸气上清液。
- 如果颗粒呈红色，则重新悬浮 1×2 mL 的 1x 红血球 （RBC） 裂液缓冲液（图 2F）。
注：如果没有 RBC，请继续执行步骤 6。 - 在37°C水浴中孵育管5分钟。
- 将 10 mL 的 PBS 移液器放入 50 mL 管中，以停止水烟。
- 在 RT 时将管子在 300 x g下离心 10 分钟，然后吸气上清剂。
6. EC 排序
- 在50 mL管中加入90μL的分拣缓冲液和10μL的抗CD31 PE抗体。
- 旋涡管，然后在4°C的冰箱中孵育10分钟。
- 将10 mL的分拣缓冲液加入管中，彻底混合，然后在RT时以300 x g的离心机10分钟。
- 在80μL的分拣缓冲液和20μL的抗PE微珠中吸气上清液并重新悬浮颗粒。
- 涡旋管，在4°C孵育15分钟。
- 通过在管中加入10 mL的分拣缓冲液来清洗细胞，彻底混合，然后在RT时以300 x g离心10分钟。
- 吸气上清液，并在500μL的分拣缓冲液中重新悬浮颗粒。
- 将含有超顺磁球的柱放入磁性分离器中，然后用3 mL分拣缓冲液冲洗该柱。
- 柱"流停止"后，移液器 500 μL 的细胞悬浮液进入柱中，然后用分拣缓冲器清洗列。重复洗涤3倍，每个与3 mL的排序缓冲器（图2G）。
- 从分离器中取出柱子，并将其放在新的 15 mL 收集管顶部。
- 使用移液器，将 5 mL EC 介质添加到柱位中，并使用柱塞推动解决方案。
- 在 RT 时将收集管在 300 x g下离心 10 分钟，然后吸气上清液。
- 按照制造商的说明，使用试剂盒从EEC和CEC样品的细胞颗粒中提取RNA。可以获得至少500纳克的RNA。
注：RNA提取后，样品可储存在-80°C。 - 根据制造商的说明，反向转录 500 ng 的 RNA，使用随机底漆和试剂盒获取 cDNA。
- 执行定量PCR，以验证内皮和内皮种群（图2H）。引素序列列在表2中。
- 将 5 μL 的 EEC 或 CEC cDNA （1 纳克/μL） 添加到 384 qPCR 板的孔中。将 EEC 或 CEC cDNA 添加到足够的井中，以便每个底漆数有三口井。
- 将 6 μL 的 2x qPCR SYBR 绿色缓冲液与每 10 μM 底漆的 0.5 μL 混合，包括正向和反向引底器，并将其添加到与每个候选基因对应的单个井中。
- 在 RT 时用塑料薄膜和离心机密封板 1 分钟，在 300 x g下。
- 将板放入 qPCR 机器中，然后在 95 °C 下启动程序 3 分钟，然后以 95 °C 启动 15 秒，然后 55 °C 为 60 秒。
Representative Results
图2描述了EEC和CEC隔离的过程。通过评估泛内皮细胞标记的存在以及两种亚型种群的不同物，确定了EEC和CEC的成功隔离。据预测，qPCR显示，相对于β-行为素，EECs表示更高的心肌标记Nnpr3，Hapln1和Cdh11相比，与CEC（图3A）。 Hapln1,同样，与EE相比，CECs表示的冠状标记法普4、Mgll和Cd36水平更高（图3B）。 Mgll此外，EEC 和 CEC 都表示泛 EC 标记基因Cdh5，CEC中的水平略高（图 3C）。
图1：心脏解剖图。（A） 首次切割，将右心室自由壁与隔膜分开。（B） 第二次切割，以完全解放右心室。（C） 首次切割，将左心室自由壁与隔膜分开。（D） 第二次切割，以完全解放左心室。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：中氯和EE的消化设置图，以及细胞分拣的以下安排。（A） 最内内自由心室壁和 （B） 最外C层心室自由壁分别浸入消化缓冲液或（D） 消化缓冲液中。（E） 收集和过滤细胞溶液，然后 （F） 红细胞 （RBC） 裂解和 （G） 磁性活细胞分拣 （MACS） 使用 CD31 抗体.（h） 使用 qPCR 处理纯化 EC 以进行基因表达验证。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 3：验证 CEC 和 EE 的隔离的 qPCR 数据。（A） EEC 标记 Npr3、Cdh11 和Hapln1在 EEC 和 CEC 中的基因表达水平通过实时 PCR 进行量化。 Npr3 Cdh11（B） EC 和 CEC 中 CEC 标记Mgll、Fabp4和Cd36的基因表达水平通过实时 PCR 进行量化。 Fabp4（C） 泛 EC 标记Cdh5通过实时 PCR 在 E 和 CEC 中进行量化。（n = 每个组中的 3 个）。柱线表示平均值 = SEM. \p < 0.05， \p < 0.01 vs. EEC， 未配对 t 测试.请点击此处查看此图形的较大版本。
| 表1.消化缓冲液（1.5毫升） | |||
| 股票公司。 | 最终康。 | 体积 | |
| Liberase TM | 5毫克/毫升 | 0.5毫克/毫升 | 150 ul |
| Dnase I | 1毫克/毫升 | 20微克/毫升 | 30 ul |
| 赫佩斯 | 1 米 | 10 mM | 15 ul |
| DMEM | - | - | 1305 ul |
表1：消化缓冲液的配方。
| 表2.引底序列 | ||
| 基因名称 | 向前 | 反向 |
| Npr3 | TCCTTGCAATGTGGCCTA | GGAATCTCTCTCT |
| Cdh11 | GTGAATGACTGACTGGACTGG | GTAATTTCTGGCCCTTGC |
| 哈普恩1 | CCAGCTAGGACTCGAAG | 格格加特茨加茨加茨格格格格格格格格 |
| 姆吉尔 | CCCGGCCCAAGAC | 加加特加格格格格格格格格格格格格格格格格格格格格格格格格格格格格格 |
| 法布4 | 阿加阿格格格茨格茨格茨格茨格茨格茨格茨格茨格茨格茨格格茨格 | ACTCTCTGAGATGACGA |
| Cd36 | GCAAAAAACTGCGGAA | CCCGGTCTTTTCTGA |
| Cdh5 | CCATTGAGACACCCCGAC | TGTGGAACGTGTTTGG |
| B-行为 | TCTGTGTGGATTGGGCT | CGGACTCATTTTGC |
表 2：引素序列
Discussion
CEC 和 EECs 在起源、标记和功能上有所不同，因此在发展和疾病中可以发挥独特的作用。现有的内皮细胞分离协议仅限于大血管组织，忽略了EE的收集，从而限制了对CEC和EEC特定功能的研究。分离和研究这两个种群至关重要，因为这种知识将为将iPSC分化为CCs和EE提供参考，供今后研究，并有助于检查这些细胞群的各种心脏疾病的潜在治疗目标。这一新颖的协议概述了一种将EE与成年大鼠心室自由壁外表面隔离的方法。
在此协议中非常精确地控制每个步骤的计时至关重要。由于大鼠心脏组织中EEC的数量非常有限，我们最大限度地减少了心脏内层的消化时间，以防止细胞损伤，更重要的是，CEC污染。立即添加EC介质溶液来终止酶反应对于保持高细胞生存能力也非常重要。细胞收集后的红颗粒表明存在大量的RBC。根据RBC污染量，可以添加1-2 mL的RBC淋液液化缓冲液来降解RBC。 孵化必须仔细定时，以避免对细胞造成重大损害，并立即添加PBS以终止反应。利用目前的协议，我们能够从六个大鼠心脏分离出10个5个EE。这些细胞可以种子到细胞培养皿上，以进一步扩张和表征。
在为自由壁收集准备组织时，用HBSS洗涤心脏以去除大部分剩余的RBC。 HBSS是推荐的介质，由于其外观清晰，能够对血细胞进行可视化，而DMED含有苯酚红色。消化缓冲液的组成确保内皮细胞的充分解放，其中细胞消化酶剥离暴露细胞的组织，DNase I从死细胞中消除DNA，促进细胞分离，可能受DNA的粘合质量抑制细胞分离，HEPES缓冲平衡pH值，DMEM是一种经过修饰的基底介质，氨基酸和维生素浓度较高，用于更好地维持细胞，并含有激活细胞活性所必需的钙。
根据从人类15和小鼠心脏10获得的单细胞RNA测序（scRNA-seq），报告了几个归因于特定EC种群的标记。我们选择了一些最丰富的基因来检查分离的EE（即Npr3、Cdh11和Hapln1）和ECs（即Mgll、Fabp4和Cd36）的纯度。 Npr3 Fabp4相对于ββ-Actin、Npr3、Cdh11和Hapln1标记，表明与CECs相比，EECs的表达性有所增加。 Npr3 Cdh11同样，与EE相比，在CECs中，Mgll、Fabp4和Cd36标记的表达也更大。 Fabp4每个样本的唯一表示标记分别与 EC 和 CEC 特有的标记一致，表明分离成功。
然而，目前的协议不能排除两个EC种群在隔离期间交叉污染的可能性，即使经过严格控制的顺序消化也是如此。因此，一些细胞表面标记可以应用于进一步纯化。例如，NPR3通常标记内卡10，而APJ可以跟踪大多数CEC16。由于这两个标记在细胞表面表示，它们可用于荧光活性细胞分拣（FACS），以及用于进一步纯化不同EC种群的抗体。此外，人类15和小鼠10心脏scRNA-seq可以确认在ECS中浓缩Npr3，Cd36Cd36可能用于CEC纯化。 Npr3
最后，所提出的议定书概述了EE和C与大鼠心脏的独立隔离。通过细胞隔离实现细胞特性的全面识别可用于重要的下游应用。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者非常感谢王玲丽博士在动物协议方面的帮助，以及斯坦福儿科部提供基础设施支持。这项工作得到了NIH/NHLBI K99 HL135258（至M.G.）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | 1M |
| 15ml Tubes | Eppendorf | 0030122151 | |
| 50ml Tubes | Nunc | 339652 | |
| 5ml Tubes | Eppendorf | 30119401 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Anti-CD31 PE | Miltenyi Biotec | 130-115-505 | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | 10% |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 1855485 | For qPCR |
| DNAse I | Worthington | LK 003172 | 1 mg/mL in water |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10313021 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | EC Medium |
| Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) X1 | Gibco | 14025092 | |
| Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-rad | HSP3805 | For qPCR |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| Liberase TM | Sigma Aldrich | 5401119001 | 5 mg/mL |
| MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | For EC isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | For EC isolation |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-rad | MSB1001 | For qPCR |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | For heart harvest |
| Nylon Sterile Strainer | Falcon | 352340 | 40 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) X1 | Gibco | 1001023 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | For qPCR |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1050 | For RNA extraction |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips | F.S.T | 00632-11 | For heart harvest |
| Strabismus Scissors - Tungsten Carbide | F.S.T | 14574-11 | For heart harvest |
| Vannas Spring Scissors - Microserrated | F.S.T | 15007-08 | For heart harvest |
References
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