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Biology

조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 Caenorhabditis elegans를 사용

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61140
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

Summary

샤페론-샤페론과 샤페론 기판 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 온화한 돌연변이와 결합된 RNA 간섭을 사용하여 Caenorhabditis elegans에 있는 합성 상호 작용 스크린을 능력을 발휘하고 chaperones의 과잉 발현및 유기체 수준에서 조직 특정 단백질 기능 장애를 감시합니다.

Abstract

단백질과 단백질 복합체의 올바른 접이식 및 조립은 세포 기능에 필수적입니다. 세포는 건강한 프로테오아질을 유지하기 위해 손상된 단백질을 정확하거나 격리하거나 제거하는 품질 관리 경로를 사용하여 세포 프로테오스타증을 보장하고 추가 단백질 손상을 방지합니다. 프로테오스타증 네트워크 내의 중복 기능으로 인해 다세포 유기체 인코딩 유전자에서 녹다운 또는 돌연변이를 사용하여 검출 가능한 표현형을 선별하면 대부분의 경우 사소한 또는 표현형이 검출되지 않습니다. 우리는 특정 기능에 필요한 보호자를 식별하고 따라서 표현형과 기능 사이의 격차를 해소하기 위한 표적 선별 전략을 개발했습니다. 특히, 우리는 RNAi 합성 상호 작용 스크린을 사용하여 새로운 보호자 상호 작용을 모니터링, 다운 다운 샤페론 발현, 한 번에 하나의 보호자, 보호자 - 인코딩 유전자에 돌연변이를 운반하거나 관심의 보호자를 과발 현현동물에서. 개별적으로 총 표현형이 없는 두 개의 보호자를 방해함으로써, 우리는 둘 다 혼란할 때 특정 표현형을 악화하거나 노출시키는 보호자를 식별할 수 있습니다. 우리는 이 접근법이 주어진 표현형과 관련되었던 단백질 또는 단백질 복합체의 접기를 조절하기 위하여 함께 작동하는 chaperones의 특정 세트를 확인할 수 있다는 것을 보여줍니다.

Introduction

세포는 손상된 단백질1,2를수리, 격리 또는 제거하는 품질 관리 기계를 사용하여 단백질 손상에 대처한다. 단백질 복합체의 접이식 및 조립은 분자 보호자에 의해 지원되며, 손상된 단백질을 수리하거나 격리할 수 있는 다양한 보존된 단백질군3,4,5,6,7이지원된다. 손상된 단백질의 제거는 유비퀴틴-프로테솜 시스템(UPS)8 또는자가기계(9)에 의해 중재되어 샤페론10,11,12와공동으로 처리된다. 단백질 항상성(proteostasis)은, 따라서 접기 및 분해 기계로 구성된 품질 관리 네트워크에 의해 유지된다3,13. 그러나 생체 내에서 프로테오스타증 네트워크의 다양한 구성 요소 간의 상호 작용을 이해하는 것이 주요 과제입니다. 단백질 단백질 상호 작용 스크린은 물리적 상호 작용 및 보호자 복합체14,15에중요한 정보를 기여하는 동안, 생체 내의 조직 및 보상 메커니즘을 이해하는 것은 부족합니다.

유전 상호 작용은 종종 공통 또는 보상 생물학적 경로16,17,18에관여하는 유전자의 쌍 사이의 관계를 검사하는 강력한 도구로 사용됩니다. 이러한 관계는 돌연변이 쌍을 결합하고 제2유전자(16)의돌연변이에 의한 현상증 중증도에 대한 한 유전자의 돌연변이의 영향을 정량화함으로써 측정될 수 있다. 대부분의 이러한 조합은 표현형의 관점에서 어떤 효력도 보여주지 않지만, 몇몇 유전 상호 작용은 측정된 표현형의 엄격을 악화시키거나 완화할 수 있습니다. 이중 결실 돌연변이의 표현형이 단일 삭제 돌연변이를 결합할 때 볼 수 있는 예상 표현형보다 더 심각할 때, 두 유전자가 병렬 경로에서 기능한다는 것을 암시하는 경우, 함께 주어진 기능에 영향을 미치는 돌연변이가 관찰된다. 대조적으로, 이중 결실 돌연변이의 표현형이 단일 결실 돌연변이체로 보인 표현형보다 덜 심각할 때, 두 유전자가 복합체로 함께 작용하거나 동일한경로(16,18)에참여한다는 것을 암시하는 경우, 경감 돌연변이가 관찰된다. 이에 따라, 치사, 성장률 및 무리 크기와 같은 광범위한 표현형을 포함하여 정량화될 수 있는 다양한 표현형뿐만 아니라 전사 기자와 같은 특정 표현형이 유전적 상호 작용을 식별하는 데 사용되어 왔다. 예를 들어, Jonikas 등은 ER 스트레스 리포터에 의존하여 쌍방향 유전자 삭제 분석을 이용한 Saccharomyces cerevisiae ER 전개 단백질 반응 프로테오스타시스 네트워크의 상호 작용을검사한다.

유전 상호 작용 스크린은 이중돌연변이20의포괄적인 세트를 생성하기 위하여 체계적으로 쌍으로 삭제 돌연변이를 교차하는 관련시킵니다. 그러나 동물 모델, 특히 C. elegans에서는이 대규모 접근 방식이 실현 가능하지 않습니다. 대신, 돌연변이 균주는 RNA 간섭(RNAi)21을사용하여 유전자 발현을 다운 조절함으로써 그들의 유전 상호 작용 패턴을 위해 시험될 수 있다. C. elegans는 RNAi22,23을기반으로 한 스크린을 위한 강력한 시스템입니다. C. elegans에서,이중 좌초 RNA (dsRNA) 납품은 수많은 조직에 dsRNA 분자의 퍼짐으로 이끌어 내는 세균성 공급에 의해 달성됩니다. 이러한 방식으로, 도입된 dsRNA 분자는 신속하고 간단한절차(21)를통해 동물에 영향을 미친다. RNAi를 이용한 유전 상호 작용 스크린은, 그러므로, RNAi 도서관24를사용하여 유전자 또는 대부분의 C. elegans 코딩 유전자의 세트를 아래로 조절의 충격을 밝힐 수 있습니다. 이러한 화면에서, 관심있는 돌연변이의 동작에 영향을 미치지만 야생 형 변형은 모니터링되는 표현형의 잠재적 인 수정자(25)입니다. 여기서, 우리는 C. elegans에서조직 별 보호자 상호 작용을 체계적으로 매핑하기 위해 돌연변이와 RNAi 스크리닝의 조합을 적용합니다.

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Protocol

1. RNAi에 대한 선충 성장 미디어 플레이트의 준비

  1. 1 L 병에는 NaCl 3 g, Bacto-Peptone 2.5 g, 17 g의 천및 증류수를 최대 1 L 및 오토클레이브에 추가하십시오.
  2. 55 °C에 병을 냉각.
  3. 1M KH2PO4,pH 6.0, 1 M CaCl2의1mL, 1 M MgSO4의1mL, 콜레스테롤 용액 1mL(표1)의25mL를 추가하여 선충 성장 미디어(NGM)를 만듭니다.
  4. 1mL의 암피실린(100 mg/mL)과 0.5mL의 1M IPTG(표1)를추가하여 NGM-RNAi 용액을 만듭니다.
    참고: 일반적으로 사용되는 HT115(DE3) 대장균 균에는 dsRNA-인코딩 플라스미드를 발현하는 데 사용되는 IPTG 유도가능한 T7 DNA 폴리머라아제가 함유되어 있습니다. 이 플라스미드는 또한 암피실린 저항을 위해 인코딩합니다.
  5. 병을 소용돌이에 의해 따뜻한 용액을 섞는다.
  6. 후드 또는 멸균 절차를 사용하여 NGM 용액을 플레이트에 붓거나 연동 펌프를 사용하여 용액을 플레이트에 분배합니다. 이 화면에 는 6웰, 12웰, 40mm 또는 60mm 플레이트를 사용합니다. 한천은 플레이트 깊이의 약 2/3을 채워야 합니다.
  7. 접시를 실온에서 벤치에서 밤새 건조하게 하여 접시를 덮어 두십시오. RNAi용 NGM 플레이트는 최대 한 달 동안 4°C로 저장할 수 있습니다.

2. RNAi 박테리아를 재배하고 접시를 파종

  1. 후드 또는 멸균 절차를 사용 하 여, 암피실린의 1 mL를 추가 (100 mg/mL) 그리고 2.5 테트라 사이클린의 mL (5 mg/mL)(표 1)LB 용액의 사전 자동 1 L에.
    참고: 일반적으로 사용되는 HT115(DE3) 대장균 박테리아는 테트라사이클린 내성입니다.
  2. 후드 또는 멸균 절차를 사용하면 2mL 깊이96웰 멸균 플레이트에 각 웰에 600 μL의 LB 솔루션을 추가하십시오. 미디어를 분배하기 위해 멀티채널 파이펫을 사용하는 것이 가장 좋습니다.
  3. 멸균 절차를 사용하여 HT115 (DE3) 대장균 박테리아로 굴절 된 우물은 dsRNA 인코딩 플라스미드로 변형되어 관심 있는 유전자 또는 빈 플라스미드를 대조군으로 선별합니다. 플레이트를 덮고 하룻밤 사이에 37°C에서 배양합니다. dsRNA를 발현하는 세균클론으로 구성된 라이브러리는, 예측된 C. elegans 유전자의 ~94%에 대응하는 이전에22,23을 시판하고 상용화되었다. 여기에 사용되는 샤페론 도서관은 박사 리처드 모리모토 연구소에 의해 건설되었다26.
  4. 멸균 절차를 사용하여, 12-well, 40mm 및 6-well 또는 60mm NGM RNAi 플레이트에 박테리아의 종자 75, 150 또는 250 μL, 각각. 명확하게 플레이트에 대상 유전자의 이름을 표시합니다. 박테리아는 천 표면의 30-50 %를 커버해야하며 접시의 가장자리를 만지지 않아야합니다.
  5. 플레이트가 실온에서 벤치에서 적어도 2일 동안 건조하여 접시를 덮어 두십시오.
    참고 : 플레이트는 하룻밤 사이에 37 °C에서 배양 할 수 있습니다. 플레이트를 사용하거나 보관하기 전에 내부 우물이 건조한지 확인하십시오. 모든 장기적인 목적(즉, 건조 또는 보관)을 위해 플레이트를 어둠 속에서 유지합니다. 건조, 종자 플레이트는 최대 한 달 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다.

3. 배아의 스트레스가 없는 동기화

  1. 웜 픽을 사용하여 동기화되지 않은 웜 플레이트에서 새로 시드된 NGM 플레이트로 약 100개의 달걀을 이동합니다.
  2. 15°C에서 5일 동안, 20°C에서 3.5일 또는 25°C에서 2.5일 동안 동물을 재배한다. 동물은 계란 누워의 첫 날에 도달해야합니다.
    참고: 벌레는 일반적으로 20°C에서 재배됩니다. 그러나, 상이한 보호자 돌연변이 균주는 특정 재배 온도를 요구할 수 있다. 예를 들어, 많은 온도 에 민감한 균주는 15 °C에서 재배되지만 표현형을 노출하기 위해 25 °C로 이동합니다.
  3. 세균 잔디에서 천천히 멀리 M9 버퍼(표 1)의1 mL을 추가합니다. 버퍼가 플레이트를 완전히 덮도록 플레이트를 회전합니다. 그런 다음 한쪽으로 기울어 접시에서 액체를 제거하고 접시에서 동물을 씻어.
    참고: 온도에 민감한 동물 이나 보호자 돌연변이를 사용 하는 경우, 동물의 재배 온도에서 프로토콜에 사용 되는 버퍼를 유지 하는 것이 좋습니다.
  4. 3.3을 세 번 반복하거나 모든 동물이 접시에서 씻겨 나갈 때까지 반복하십시오.
  5. 표준 플라스틱 팁을 사용하여 계란이 농축된 세척된 접시에서 한정된 천을 자르고 새로 시드된 NGM 플레이트에 한천 조각을 놓습니다.
    참고 : ~ 200 계란은 충분한 계란 누워 동물을 생산하는 데 필요합니다; 너무 많은 동물이 너무 빨리 박테리아를 소비합니다. 낮은 식품 수준은프로테오스타증(27)에영향을 줄 수 있다.
  6. 15°C에서 5일 동안, 20°C에서 3.5일 또는 25°C에서 2.5일 동안 동물을 재배한다. 이 시점에서 플레이트는 동기화된 계란으로 덮여 있어야 합니다.
    참고: 동물을 더 엄격한 동기화를 위해 짧은 기간 동안 새 접시로 이동할 수 있습니다. 그러나, 동물이 동기화에 영향을 미치는 그들의 자궁에 있는 계란을 유지할 수 있기 때문에 계란 누워의 초기 단계에서 만 성인을 사용하는 것이 중요합니다.
  7. 세균 잔디에서 천천히 멀리 M9 버퍼의 1 mL을 추가합니다.
  8. 버퍼가 플레이트를 완전히 덮도록 플레이트를 회전합니다. 그런 다음 한쪽으로 기울어 접시에서 액체를 제거하고 접시에서 동물을 씻어.
  9. 3.7을 세 번 반복하거나 모든 동물이 접시에서 씻겨 나갈 때까지 반복하십시오.
  10. M9 버퍼 1mL을 추가하고 셀 스크레이퍼를 사용하여 접시에서 계란을 방출합니다.
  11. 플레이트에서 계란을 포함하는 M9 버퍼를 수집합니다.
  12. 2 분 동안 3,000 x g에서 계란을 포함하는 M9 버퍼 원심 분리.
  13. 상체를 제거하고 M9 버퍼를 추가하여 1mL의 부피에 도달합니다.
  14. 계란과 박테리아의 어떤 덩어리를 방해 하기 위해 계란을 다시 중단.
  15. 3.11-3.13 단계에 설명된 세척 절차를 5회 반복한다. 달걀 펠릿은 흰색으로 표시되어야 합니다. 노란색/갈색이면 흰색 펠릿이 얻을 때까지 세척을 반복합니다.
    참고: 계란에 남아 있는 박테리아는 dsRNA 표현 박테리아를 오염시킬 수 있습니다.
  16. 대부분의 상체를 제거하여 약 200 μL을 남기고 RNAi 화면에 동기화된 계란을 사용할 수 있습니다.

4. 일반적인 표형 에세이

  1. 실험 중 동물의 재배
    1. 각 RNAi 시드 접시에 세균 잔디에 가까운 ~ 30 계란의 방울을 놓습니다. 참고로, 빈 벡터 함유(L4440) 박테리아로 시드된 접시에 ~30개의 알을 놓습니다.
    2. NGM RNAi 시드 플레이트에서 연령 동기화 동물을 육성합니다. 실험의 기간은 동물을 모니터링하는 단계와 재배 온도에 따라 달라집니다. 온도에 민감한 돌연변이 동물을 사용할 때 재배 온도를 조정합니다. 발달 지연 된 돌연변이 동물을 사용할 때 재배 기간을 조정합니다.
      참고: 시기는 다를 수 있지만, 동물이 성인기에 도달하면 계란 누워 (그리고 그 결과로 급속한 음식 소비), 뿐만 아니라 연령에 따라 달라 둔 proteostsis 붕괴28,결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 계란 누워의 발병 전에 동물을 득점하는 것이 좋습니다 (성인의 일 1 일). 야생형 동물은 15°C에서 4.5일, 20°C에서 3일 또는 25°C에서 2일 후에 이 단계에 도달한다.
    3. 사용된 반복의 수는 검토된 유전자 세트의 크기에 따라 달라집니다. 샤페론 라이브러리(97유전자)의 경우 실험을 적어도 4번 반복한다. 채우기의 크기는 사용되는 분석에 따라 다릅니다. 여기에서 논의된 행동 적 소에서, 각 반복에서 실험 조건 당 >15 동물을 점수. 데이터 및 통계 분석은 또한 사용되는 분석의 유형에 크게 의존합니다. 여기에 설명된 분석서의 데이터는 SEM을 ± 수단으로 제시될 수 있습니다.
    4. RNAi 및 빈 벡터 제어 처리 동물을 독립적인 인구로 비교합니다. P 값은 검사된 변경 사항, 즉 단독으로 또는 둘 다를 악화또는 완화하는 변경 사항에 따라 단방향 또는 양방향 ANOVA를 사용하여 계산할 수 있습니다. 단일 RNAi 처리 대 대조군을 검사할 때, P 값은 단방향 또는 양방향 Mann-Whitney 랭크 합계 시험을 사용하여 계산될 수 있습니다. 통계적 유의 이외에 표현형에 미치는 영향 정도에 따라 안타에 대한 임계값을 고려하십시오.
  2. 발달 체포/지연
    1. 빈 벡터 함유 대조군 박테리아에서 자란 동물이 성인기에 도달할 때까지 4.1 단계와 같이 나이 동기화 된 동물을 육성하지만 계란 누워가 시작되기 전에.
    2. 스테레오 현미경을 사용하여 동물을 모니터링하고 애벌레와 성인의 수를 계산하여 발달 지연 된 동물의 백분율을 계산합니다. 참고로, 빈 벡터 함유 대조군 박테리아에서 자란 돌연변이 동물과 비교하십시오. hsp-1 또는 hsp-90 RNAi 치료는 야생 형 동물의 발달 체포를 초래하고 긍정적 인 제어로 사용될 수있다.
    3. 시간이 지남에 따라 발달 지연 동물의 퍼센트를 득점하려면 4.2.2 단계를 반복하십시오.
      참고: 접시에 계란 누워 성인이 있는 경우, 자손과의 혼동을 피하기 위해 동일한 표적 유전자에 표지된 새로운 NGM-RNAi 플레이트로 발달 지연된 동물을 이송합니다.
  3. 멸균 또는 계란 누워 결함
    1. 빈 벡터 대조균에서 자란 동물이 알을 낳기 시작할 때까지 4.1 단계에서와 같이 노화 동기화 된 동물을 육성합니다.
    2. 스테레오 현미경을 사용하여 동물을 모니터링하고 자궁에 눈에 보이는 계란이없는 동물의 퍼센트를 점수. 참고로 빈 벡터 제어 박테리아에서 자란 돌연변이 동물과 비교하십시오.
    3. 또는, 스테레오 현미경을 사용하여 동물을 모니터링하고 EGg 누워 결함 (Egl-d) 표현형(29)으로정의 계란의 전체 자궁을 가진 동물의 퍼센트를 점수.
  4. 배아 치사
    1. 동물이 알을 낳기 시작할 때까지 4.1 단계에서와 같이 나이 동기화 된 동물을 육성합니다.
    2. ~100개의 달걀을 빈 접시에 옮기습니다. 계란을 행으로 펴서 계산을 단순화합니다.
    3. 24-48 시간 후에 접시에 해치지 않은 계란의 백분율을 점수. 참고로, 빈 벡터 대조균으로 치료된 동물의 알과 비교하십시오.
  5. 마비 분석
    1. 1일째 성인의 경우, 빈 벡터 대조균에서 자란 동물이 성기에 도달할 때까지 4.1단계와 같이 연령과 동기화된 동물을 육성하지만 계란 누워가 시작되기 전에 재배합니다.
    2. 미세 마커를 사용하여 일반 NGM 한천 플레이트 뒷면에 선을 그립니다.
    3. 표시된 줄에 5-10 마리의 동물을 배치합니다.
    4. 타이머를 설정하고 10 분 기다립니다.
    5. 마비 된 벌레로 라인에 남아있는 동물의 퍼센트를 점수. 참고로 빈 벡터 제어 박테리아에서 자란 돌연변이 동물과 비교하십시오. unc-45 RNAi로 처리된 야생형 동물은 심각한 마비 표현형을 나타내며 양성 대조군으로 사용될 수 있다.
      참고 : 이 분석은 중증 마비에 중간을 보여주는 동물을 강조합니다. 이러한 동물들은 보통 일반적인 곡선 모양을 제시하기보다는 접시에 똑바로 놓여 있습니다. 또한, 마비 된 벌레의 머리 주위에 박테리아의 삭제 패치가 볼 수 있습니다.
  6. 스래싱 분석
    1. 빈 벡터 대조균에서 자란 동물이 성인기에 도달할 때까지 4.1 단계와 같이 나이 동기화 된 동물을 육성하지만 계란 누워가 시작되기 전에.
    2. 동물의 재배 온도에서 M9 버퍼의 파이프 100 μL을 96 웰 플레이트로 넣습니다.
    3. M9 버퍼 함유 우물에 잘 1개씩 - 15개의 웜을 배치합니다.
    4. 동물이 5 분 동안 조정하자.
    5. 스테레오 현미경아래 각 동물을 검사하고, 타이머가 15초 카운트다운되고, 각 동물이 해당 기간에 수행하는 신체 굴곡 수를 계산합니다. 계산된 값은 분당 바디 굽힘에 정규화할 수 있습니다. 참고로 빈 벡터 제어 박테리아에서 자란 돌연변이 동물과 비교하십시오.
      참고 : 이 운동성 분석은 매우 민감하며 치료 사이의 매우 가벼운 차이를 감지 할 수 있습니다. 그러나, 액체의 운동성과 한천에 운동성 다를 수 있습니다.

5. 단백질 녹다운 의 검증

  1. 관련 dsRNA-표현 또는 빈 벡터 함유(L4440) 박테리아와 시드된 60mm NGM-RNAi 플레이트에 250-300개의 동기화된 계란을 놓습니다.
    참고: RNAi 녹다운은 배아의 비정상적인 축적, 배아 부족 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 발달 체포의 결과를 초래할 수 있습니다. 이것은 검사될 동물의 나이를 결정할 때 고려되어야 합니다.
  2. 1일성인의 경우, 15°C에서 4.5일, 20°C에서 3일 또는 25°C에서 2일 동안 동물을 재배한다.
  3. 총 200마리의 젊은 성인 동물을 1.5mL 튜브 의 캡에 PBS-T 200 μL로 선택하고 옮기.
    참고: 온도에 민감한 동물 이나 보호자 돌연변이를 사용 하는 경우, 동물의 재배 온도에서 프로토콜에 사용 되는 버퍼를 유지 하는 것이 좋습니다.
  4. 캡을 조심스럽게 닫고 원심분리기를 1,000 x g에서 1분 간 닫습니다.
  5. PBS-T(표1)및 원심분리기 800μL을 1분 동안 1,000 x g에 추가합니다.
  6. 조심스럽게 상단 900 μL을 제거합니다.
  7. 5.4-5.6 단계를 세 번 반복합니다.
  8. 900 μL을 제거하여 200개의 웜을 포함하는 100μL의 용액을 남깁니다.
  9. 5배 샘플버퍼(표 1)의25μL을 추가합니다.
  10. 샘플을 92°C에서 10분 동안 가열하고 1000 rpm에서 흔들어 보입니다. 그런 다음 샘플을 동결하고 -20 °C로 보관 할 수 있습니다.
  11. 각 샘플의 20 μL을 로드하고 SDS 페이지 젤에서 실행합니다.
  12. 단백질의 상대적 안정성을 결정하기 위해 적절한 항체를 사용하여 서양 얼룩 분석을 수행합니다.
  13. 자유롭게 사용할 수 있는 ImageJ 젤 모듈과 같은 밀도 측정 소프트웨어를 사용하여 대역의 강도를 결정합니다. 모든 값을 제어 샘플에서 측정된 값으로 정규화합니다.
    참고: 우리의 화면에 RNAi 녹다운의 목표는 특정 보호자/ 공동 보호자의 단백질 수준을 낮추는 것입니다. 따라서, RNAi 녹다운의 효율을 평가하는 가장 좋은 방법은 서부 블롯 분석에 의한 것입니다. 이것은 특정 항체를 요구합니다. 또는 qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량화할 수 있습니다.

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Representative Results

UNC-45의 온도 에 민감한 돌연변이를 사용하여 허용 또는 제한 적인 조건에서 상호 작용을 악화또는 완화하기 위해 각각 검사합니다.
근육 조립 및 유지 보수는 조직 별 보호자 상호 작용을 연구하는 효과적인 시스템을 제공합니다. 수축 근육의 기능적 단위인 사컴레는 구조 및 조절 단백질의 결정과 같은 배열을 제공합니다. 모터 단백질 미오신의 안정성과 수축 근육 사혜성의 두꺼운 필라멘트에 의한 은 샤페론및 UPS성분(30)의협력에 달려 있다. 이러한 보호자 중 하나의 예는 주로 체벽 근육31,32,33,34, 35로발현되는 보존 및 전문 묘신 샤페론UNC-45이다. UNC-45의 돌연변이는 C에서근신 해체 및 심한 운동성 결함을 유도하는 것으로 나타났다. elegans31,36. UNC-45 탠덤 모듈은 UNC-45, HSP-90 및 HSP-1 간의 협업을 시행하는 다중 사이트 도킹플랫폼(37)으로 조립되며, 미오신 필라멘트 어셈블리25,36,37,38에서다른 샤페론과 공동 샤페론을 구현한다. 알려진 UNC-45 상호 작용을 확인하고 근육 프로테오스타증에서 새로운 유전적 상호 작용을 식별하기 위해, 우리는 조직별 샤페론 상호 작용스크리닝19,25에대한 민감성 유전 배경으로 C. elegans 온도에 민감한 unc-45 돌연변이를 사용하여 전략을수립하였다.

C. elegans UNC-45 (L822F 및 E781K에서 단일 아미노산 대체, e286 및 m94 알레에 각각 해당; unc-45(ts)) 영향을 받는 동물이 제한 조건(>22°C)에서 재배될 때 온도 의존성 운동성 결함 및 근신 해체 표현형을 담당합니다. 대조적으로, 이러한 unc-45(ts) 돌연변이는 허용 온도(15°C)31에서무브먼트 또는 미오신 조직 결함을 나타내지 않는다. 제안된 접근법에서, 제1 애벌레 단계(L1)에서 나이 동기화되지 않은 unc-45(e286) 동물은 RNAi(97 유전자)에 의해 상이한 분자 보호자의 고갈된 다음 허용 조건(15°C) 하에서 운동성 결함을 모니터링하였다(도1). 우리는 우리의 유전 상호 작용 스크린에 UNC-45 및 HSP-90 단백질의 알려진 상호 작용을 확인하고 3 개의 hsp-90 공동 샤페론, sti-1, ahsa-1 및 daf-41을확인, 구체적으로 unc-45 (ts) 돌연변이 동물에서 합성 운동 결함을 일으키는 것으로 하지만 야생 형동물25. 우리는 sti-1-, ahsa-1- 또는 daf-41-관련합성 표현형이 확립된 면역 염색기술을사용하여 미신 중형 A(MYO-3)의 세포전 배치를 모니터링하여 미신 해체에 의해 발생되었는지 여부를 검토했습니다. sti-1, ahsa-1 또는 daf-41 RNAi를 가진 야생 형 동물의 처리는 myofilament 조직에 영향을 미치지 않은 반면, unc-45 (e286) 돌연변이 동물에서 이 유전자의 고갈은 육종 구조와 MYO-3 의 잘못된 지역화의 완전한 중단 귀착되었습니다, 심지어 허용 조건 (15°C). 이러한 효과는 제한 온도(25°C)25에서자란 unc-45(e286) 단일 돌연변이체로 본 것과 비교할 수 있었다. 이러한 결과는 다른 unc-45(ts)-allele, 즉 unc-45(m94) 돌연변이동물(25)을사용하여 확인되었다.

UNC-45를 불안정하게 하는 샤페론을 확인하기 위해, 우리는 RNAi에 의한 유전자 녹다운에 의존하여 25°C에서 unc-45(286) 동물의 운동성을 향상시키는 샤페론을 위해 다음으로 선별했습니다. unc-45(e286) 돌연변이 동물은 25°C에서 심한 운동 결함을 보였지만, 97개의 샤페론 중 4마리를 인코딩하는 유전자에 대해 RNAi로 치료된 동물의 운동성이 현저히 개선되었다. 여기서도, 결과는 unc-45(m94) 돌연변이 동물을 사용하여 확인되었다. 따라서 온도에 민감한 돌연변이를 사용하면 화면이 수행되는 온도에 따라 화면이 악화되고 완화되는 화면을 모두 확립할 수 있습니다.

샤페론의 조직별 과발현을 사용하여 상호 작용을 악화시키는 화면을
우리는 다음으로 스크리닝 목적으로 근육 보호자 네트워크의 가벼운 동요로 단일 보호자의 조직 별 과발현을 활용했습니다. 구체적으로, 우리는 동물을 과도하게 표현하는 야생형 dnj-24를활용해 C. 엘레간 바디 월 근육(DNJ-24M)에서 Hsp40 단백질 DNAJB6의 C. 엘레간 균성 동종로를 인코딩하였다. 위와 같이, L1 DNJ-24M 동물은 다른 샤페론에 대한 RNAi로 처리되었고 운동성 결함(20°C)(도1)을모니터링하였다. DNJ-24M 동물은 주목할만한 운동성 결함을 보여주지 않았지만, 3 개의 유전자 (48 개의 샤페론 인코딩 유전자 검사; 6 %), 즉 hsp-1, rme-8및 dnj-8은 DNJ-24M 표현 동물의 운동성에 특히 영향을 미쳤지만 야생 형 동물은 그렇지 않았습니다. 다른 샤페론, 즉 HSP-90, 근육(HSP90M)을 과도하게 표현하는 동물을 사용하여 안타의 특이성을 테스트하는 것은 hsp-1, rme-8또는 dnj-8 RNAi 치료40시HSP90M 운동성에 영향을 미치지 않는다는 점에 유의한다. 종합하면, 전이성 돌연변이 단백질 또는 조직별 과발현의 발현과 같은 샤페론 네트워크에 온화한 동요를 채택하는 스크리닝 플랫폼은 매우 특이적인 적중률(보통 ~5%)을 초래하였다.

조직 별 RNAi를 사용하여 조직별 유전 적 상호 작용을 검사합니다.
조직 별 RNAi 에 민감한 균주는 dsRNA 전달을 위해 세균성 공급을 사용하는 동안 유전자의 조직 특정 녹다운을 허용합니다. 이러한 균주는 효과적인 유전자 침묵21에필요한 RNAi 통로의 주요 성분인 RDE-1 아르고나테 단백질을 위한 돌연변이이다. 그러나, 조직 특이적 프로모터의 통제하에 야생형 RDE-1을 발현하는 것은 효과적인 조직 특이적 유전자녹다운(41,42)으로이어졌다. 이 도구는 이렇게 UNC-45 또는 DNAJ-24M과 같은 조직 특정 보호자를 사용하지 않고 유전 적 상호 작용 화면을 허용합니다. 예를 들어, 개발 중 야생 동물에서 hsp-6(mortalin) 녹다운이 강한 발달 적발(RNAi 처리된 동물의 96±1%)을 초래하였다. 동시에, hsp-6 녹다운근육에서 야생형 RDE-1을 발현하는 균주는 발달적 체포를 일으키지 않았고, 장내 세포에서 야생형 RDE-1을 발현하는 반면, 강한 발달형 형(90±3%)을 초래하였다. 그림 2). 따라서, 장 세포에서 HSP-6 기능은 정상 발달을 위해 요구된다. hsp-6 (mg585)의 돌연변이는 경미한 성장 지연을 일으키는 원인이 되는, 그러므로, 그 돌연변이한 유전자를 장 특정 RNAi 긴장으로 교차하고 chaperone RNAi 도서관을 검열해서 chaperone 상호 작용을 악화하거나 경감하기 위하여 스크리닝하기 위하여 이용될 수 있습니다.

유전 적 상호 작용을 사용하여 접는 환경에서 연령에 따라 달라 지는 변화 모니터링
동물은 육종분해43,44,45와연관된 운동성 에서 연령 의존적인 감소를 보여준다. 단백질 접이식 용량의 변화는 UNC-45, CHN-1 및 UFD-2의 변경된 수준을 포함하여 세포 프로테오스타증기계(28)의변화된 조절 및 조성과 일치하며, 근육 품질 관리기계(46)의단백질이다. 합의에 따라, myosin 접기 및 분해는 성인기47로의전환시 프로테오틱 용량의 변경에 의해 영향을 받습니다. 따라서 이러한 변화가 샤페론 상호 작용에 영향을 줄 수 있는지 물었습니다. 예를 들어, 우리는 시간이 지남에 따라 운동성에 sti-1, ahsa-1 및 daf-41 넉다운의 영향을 모니터링했습니다. 우리는 sti-1-, ahsa-1- 및 daf-41-RNAi 처리 동물이 애벌레 발달 도중 감소된 운동성을 보였더라도, 운동성은 강하게 unc-45 (ts) 성인 벌레에서 감소했다는 것을 것을을 발견했습니다. 더욱이, MYO-3 조직은 sti-1로처리된 unc-45(ts) 돌연변이 동물, 아사-1 또는 daf-41 RNAi는 4차 애벌레 단계(L4)에서 야생형 벌레와 유사했지만, 돌연변이는 동물이 성인기에 도달한 후 중단된 사코메르를 나타냈다(그림3). 대조적으로, 빈 벡터 대조군으로 처리된 unc-45(ts) 돌연변이 동물과 야생형 동물은 모두 영향을 받지 않은 채로 남아있었다(도 3). 따라서, 프로테오스타증의 기능으로서 연령 또는환경조건(27,45,46,48, 48,49)은 샤페론 상호작용에 비판적영향을 미칠 수 있다.

Figure 1
도 1: 관심의 보호자를 코딩하는 유전자에 돌연변이를 운반하는 C. elegans를 사용하여 RNAi 합성 상호 작용 스크린의 설정. (A)표적 샤페론 상호 작용 화면의 기본 설정의 회로도 표현. (B)적중 유효성 검사는 다른 보호자 돌연변이를 사용하여 유전 적 상호 작용의 확인뿐만 아니라 RNAi 녹다운의 지정을 검증해야합니다. (C-D) 운동성 결함과 같은 간단한 판독은 마비 또는 스래싱 작용을 사용하여 상호 작용을 악화또는 완화시키는 것을 결정하기 위해 정량화 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: 미토콘드리아 샤페론 hsp-6의 조직 별 RNAi는 하나의 조직에서 유전적 상호 작용을 검사하는 데 사용될 수 있다. 야생형 장및 근육특이적 RNAi 균주는 hsp-6 RNAi로치료되었고(A)발달 지연이 채점되거나(B)이미지는 성인기 첫날에 촬영하였다. 데이터는 SEM, N=6을± 의미합니다. 스케일 표시줄은 1mm입니다.

Figure 3
그림 3: RNAi의 연령 의존적 효과. (A)나이가 있는 운동성. 야생형 또는 unc-45(e286) 배아는 15°C에서 sti-1, ahsa-1 또는 daf-41 RNAi 시드 플레이트에 배치되었고 각 발달 단계, L1-L4, 젊은 성인 및 성인 1일째에 스래싱 분석체를 사용하여 운동성도를 위해 득점하였다. 데이터는 SEM, N=15에 ± 의미입니다. (B)바디 월 근육의 공초점 이미지. 동물은 A에서로 치료되었고, L4, 젊은 성인 및 성인 1일째에 정해져 서 항MYO-3 항체로 면역 염색하였다. 스케일 바는 10 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

용액 준비 지침 보관
1 M CaCl2 (1 L) 147.01 g CaCl2·2H2O 추가 RT에 저장
dH2O를 1 L에 추가
자동 클램 또는 필터 (0.22 μm)
1 M KH2PO4,pH 6.0 (1 L) 136.09 g KH2PO4 추가 RT에 저장
800mL dH2O 추가
마그네틱 교반기를 사용하여 용해될 때까지 섞으세요.
KOH를 이용한 Titrate pH
dH2O를 1 L에 추가
자동 클램 또는 필터 (0.22 μm)
1 M MgSO4 (1 L) 248.58 g MgSO4·7H2O 추가 RT에 저장
dH2O를 1 L에 추가
자동 클램 또는 필터 (0.22 μm)
콜레스테롤 용액 (50 mL) 50mL 팔콘 튜브에 250 mg 콜레스테롤 추가 -20°C에 보관하십시오.
40mL 에탄올에 완전히 용해
에탄올을 50mL에 추가
1 M IPTG (50mL) 50mL 팔콘 튜브에 11.9g IPTG(이소프로필-β-D-티오갈라크토피라노사이드)를 추가합니다. -20°C에서 어둠 속에서 보관하십시오.
40mL dH2O로 완전히 용해
dH2O ~ 50mL 추가
필터(0.22 μm), 알리쿼트 1mL 튜브
암피실린 재고 (50mL) 50mL 팔콘 튜브에 5g 암피실린을 추가 -20°C에 보관하십시오.
40mL dH2O로 완전히 용해
dH2O ~ 50mL 추가
필터(0.22 μm) 에펜도르프 튜브에 1mL 알리코트 분배
테트라사이클린 재고(50mL) 50mL 팔콘 튜브에 250 mg 테트라사이클린을 추가 -20°C에 보관하십시오.
40mL 에탄올에 완전히 용해
에탄올을 50mL에 추가
알리쿼트 1mL 튜브
M9 버퍼 (1 L) 추가 5.8 g Na2HPO4·7H2O RT에 저장
KH2PO4 3g 추가
추가 5 g NaCl
추가 0.25 g MgSO4·7H2O
dH2O를 1 L에 추가
필터(0.22 μm)
1X PBS-T (pH 7.4) (1 L) NaCl 8 g 추가 RT에 저장
추가 200 KCl의 mg
추가 1.44 g Na2HPO4·7H2O
추가 240 mg KH2PO4
800mL dH2O로 완전히 용해
KOH tp pH 7.4를 사용하여 Titrate pH
500 μL Tween-20 추가
dH2O를 1 L에 추가
5배 샘플 버퍼 6.8mL dH2O 추가 -20°C에 보관하십시오.
2mL 0.5M 트라이 pH 6.8 추가
3.2mL 글리세롤 추가
SDS 1.6mL 20% 추가
0.8mL ß-메르카포에탄올 추가
1% 브로모페놀 블루

표 1: 솔루션 레시피

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Discussion

프로테오스타증 네트워크의 통합 된 그림은 어떻게 조직되고 다른 대사 세포및 조직에서 기능이 부족한지 반영합니다. 이러한 단점을 해결하기 위해서는 분자 보호자와 같은 이 네트워크의 다양한 구성 요소의 상호 작용에 대한 구체적인 정보가 개발 및 노화 과정에서 특정 조직에서 필요합니다. 여기에서, 우리는 조직 특정 동요의 사용이 주어진 조직에서 chaperone 네트워크를 검토하는 가능하게 하는 방법을 보여주었습니다. 조직 별 보호자 유전 상호 작용을 탐구하기 위해, 세 가지 다른 접근 방식을 고려했다. 첫 번째 접근법에서, UNC-45, 근육 세포에서 높게 표현되는 chaperone는, 먹이-RNAi25를통해 보호자 상호 작용을 위해 스크린하기 위하여 이용되었다. 전문 적인 chaperone의 사용은 안목 조직 특이성을 허용 하는 동안, 그것은 단지 기여 하는 고도로 초점을 맞춘 하위 네트워크에 보고할 수 있습니다. 대부분의 C. elegans 뉴런은 공급 기반 RNAi전달에 저항하고 따라서 신경 세포에서 유전 상호 작용을 식별하기 위해이 방법을 사용하여 RNAi 강화 균주51로검사 돌연변이 샤페론을 건너해야합니다. 두 번째 접근법에서, 조직 별 프로모터는 근육에서 샤페론의 과발현을 구동하고 따라서 특히 근육 접이식 환경에 영향을 미치는 데사용되었다(40). 그러나 단일 보호자를 과도하게 표현하는 것은 일반적으로 접이식 환경에 유익할 수 있으므로 두 보호자로 인한 중단을 함께 마스크할 수 있습니다. 세 번째 접근법은 조직별 RNAi 녹다운에 의존하여 주어진조직(41)의보호자 간 작용을 검사했다. 이 접근법의 한 가지 장점은42를통해 RNAi 전달에 내성이 있는 신경 세포를 표적으로 삼을 수 있다는 것입니다. 여전히, 이 접근은 온화한 돌연변이의 사용을 요구합니다 (비록 특화되지 는 않지만), 뿐만 아니라 이 돌연변이는 조직 특정 rde-1 구조 유전자를 운반하는 rde-1 null 돌연변이로 교차될 것을 요구합니다. 중요 한 것은, 이러한 접근 은 잠재적으로 단일 조직 또는 단일 세포에 chaperone 기능을 조절 할 수 있도록 결합 될 수있다.

품질 관리 기계는 프로테오스타시스를 교란시켜 많은 유전자 제품의 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 이것은 품질 관리 네트워크(18)를탐구하기 위해 유전 상호 작용을 사용할 때 중요한 도전이다. 예를 들어, 응집되기 쉬운 단백질 또는 프로테오스타증의 만성 발현은 노화에서 붕괴되어 C. 예르간과 효모45,52,53에서관련이 없는 많은 메타안정 단백질의 페노티픽 악화를 초래했다. 더욱이, 포유류 세포에서 클라린 매개 내분비증은 Hsc70의 기능적 격리시 단백질 골재에 의해 억제되었다. 그러나 Hsc70 과발현에 의해 내분비증을 구출할 수 있는 것으로 나타났으며, 집계는54,55로할 수 없는 것으로 나타났다. 마찬가지로, 열 충격 반응의 조절기를 밝히기 위해 고안된 Drosophila의 유전 화면은 열 충격반응(56)을구성적으로 활성화시키는 비행 근육 액틴의 잘못된 돌연변이를 확인하였다. 종합하면, 프로테오스타증 네트워크의 변투는 메타안정 단백질을 노출하거나 결과 특이성에 영향을 미칠 수 있는 스트레스를 유도할 수 있다. 그럼에도 불구 하 고, 유전 상호 작용을 분석 매우 구체적인 및 기능적인 통찰력을 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 내민성 망상에서 접기 위해 요구되는 효모 유전자의 상피 분석은 그 이후에19로검증된 분자 보호자 들 사이의 특정 유전 적 상호 작용을 확인했습니다. 마찬가지로, 두 개의 집계 경향이 모델 (운동성에 의해 측정)의 독성을 향상시키는 chaperones에 대한 악화 화면은 18 개의 샤페론의 특정 하위 집합을 확인했으며, 그 중 직교는 인간 세포(26)에서헌팅틴 집계에 영향을 미쳤다. 여기서, 우리는 proteostasis 네트워크의 다양한 혼란이 특정하고 기능적인 보호자 상호 작용을 발견 할 수 있음을 보여 주었다.

RNAi 공급 기반 유전 상호 작용 화면을 사용하는 주요 장점은 방법의 상대적 단순성입니다. 운동성과 같은 일반적인 행동 출력을 사용하더라도 새로운 유전 적 상호 작용(그림 3)을드러낼 수 있습니다. 그러나 식 녹다운의 가변성 및 부분효과는결과(57)의견고성과 특이성을 제한할 수 있다. 더욱이, 유전 상호 작용은 물리적 인 상호 작용을 나타내지 않으며 두 유전자 사이의 관계는 따라서 간접적 일 수 있습니다. 상호 작용의 특성을 탐색하고 비특정 상호 작용을 폐기하는 것은 시간이 많이 소요될 수 있습니다57,58,59. 이는 화면 설정 및 유효성 검사에서 해결해야 하는 우려 사항입니다. 예를 들면, 유전 검열에 있는 null 유전자를 사용하여 주어진 생물학 프로세스에 있는 동일하거나 명백한 통로에서 이 유전자가 작동하는지 결정하는 것을 허용합니다. 그러나, 유전자 기능의 부분적 손실을 이용하여, 온도에 민감한 대립 유전자, 또는 RNAi 의존형 발현과 같은 저형성 대립유전자는 유전자가 동일하거나 평행경로에서 작용하든 관계없이 변류적작용을초래한다. 따라서 상호 작용의 특성에는 추가 분석이 필요합니다. 그러나, 저형성 알레일과 RNAi를 사용하여 동일한 단백질 복합체 또는 통로 또는 중복통로(59)에있는 유전자를 포함하여 광범위한 인터랙터를 식별할 수 있었다. 가능한 상호 작용의 이 더 큰 범위는 유전 스크린에 있는 더 많은 안타를 산출할 수 있는 동안, 또한 프로테오스타증붕괴45,53에있는 온도 에민감한 유전자의 비특이적 노출과 같은 비특이적 상호 작용으로 이끌어 낼 수 있습니다.

적중 유효성 검사 및 비특정 상호 작용은 여러 가지 방법으로 검사할 수 있습니다. 안타 수는 낮어야 합니다. 예를 들어, unc-45 돌연변이 배경에서 샤페론 발현의 하향 조절은 적중(4%)의 작은 비율을 초래했으며, 대부분의 샤페론 유전자 다운 규제는 운동성에 영향을 미치지 않습니다. DNJ-24M이 과도하게 표현되었을 때(6%)도 비슷한 비율로 관찰되었습니다. 위에서 언급했듯이, 집계되기 쉬운 단백질과의 보호자 상호 작용을 위한 스크린은 219의 18명의 보호자(8%)를 확인했습니다.

여러 돌연변이 진상선, 과발현 선 또는 질병 모델을 사용해야 합니다. 샤페론 기능에 다른 영향을 미치는 다른 돌연변이 송내의 사용뿐만 아니라 다른 유전 적 배경을 가진 다른 균주의 사용은 모든 화면 조회수의 특이성을 지원할 수 있습니다. 대안적으로, 유사한 변투로 이어지지 않는 상이한 샤페론의 돌연변이 또는 과발현을 사용하여 부정적인 대조군으로 작용할 수 있다. 예를 들어, unc-45(e286) 및 unc-45(m94) 모두 sti-1, ahsa-1 또는 daf-41이 다운 조절되었을 때 악화동작을 보였다. 더욱이, 아사-1(ok3501) 삭제 돌연변이를 운반하는 동물이 hsp-90 RNAi(25)로처리되었을 때 유사한 상호작용이 관찰되었다.

샤페론 안타와 알려진 상호 작용의 신원을 검사해야합니다. 예를 들어, unc-45 악화 화면에서 확인된 샤페론은 HSP-90 ATPase 주기에 필요한 매우 구체적인 샤페론 세트로, 고객 채용 담당자(STI-1), 리모델링 공동 샤페론(AHSA-1), 클라이언트 성숙 공동 차퍼론(DAF-41)을 포함한다. 사실, 이 공동 샤페론 세트는 완전한 HSP-90 접이식 사이클60을형성한다. 마찬가지로, DNJ-24M 화면은 Hsp40s40의주요 보호자 파트너 인 HSP-1을 확인했습니다.

동물의 수명에 걸쳐 상호 작용의 변화도 검사되어야한다. 예를 들어, unc-45 악화 화면에서 확인된 chaperones는 성인기에 운동성과 근신 조직에 큰 영향을 미쳤지만 개발 중에 더 온화한 영향을 미쳤습니다. 이는 성년28의 프로테오스타증 네트워크의 변화 또는 근섬유 접이식 및 유지보수 사이의 미오신 접이식 요구 사항의 변화로 인해 이루어질 수 있습니다.

보완적인 생화학적 접근법을 사용하여 단백질 간의 상호 작용과 세포내의 국소화를 직접 검사하십시오. 예를 들어, HSP-90 공동 샤페론, STI-1, AHSA-1 및 DAF-41은근신(25)과상호 작용하는 사코메레로 국한된다.

C. elegans는 품질 관리를 모니터링하기위한 잘 설립 된 메타 조아 모델입니다. 세포 생물학, 생화학 및 유전 적 접근법의 가변 도구 키트를 사용하여 세포 및 유기체 프로테오스타증을 모니터링하는 데 종종 사용됩니다. 여기서, 우리는 유전자 검열 접근법 및 사용 가능한 공구57,58,59,돌연변이 은행과 같은, 사용 가능한 RNAi 도서관(22,23 및 조직 특정 RNAi 균주41,42)를사용하여 발달 및 노화 중에 살아있는 동물의 보호자 상호 작용을 모니터링했습니다. 운동성과 같은 간단한 행동 적 소의 사용은 새로운 유전 적 상호 작용을 탐구하기 위해 많은 가능한 유전자 쌍의 화면을 단순화합니다. 이 다음 더 생체 내 및 체 외에서 그들의 잠재적인 상호 작용을 공부 하는 생 화 확 적인 도구를 사용 하 여 chaperone 현지화 및 물리적 상호 작용을 탐구 하는 플랫폼 역할을 할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 C. elegans 바디 월 근육25,40에서새로운 보호자 상호 작용을 확인하는 데 성공적으로 사용되었습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

우리는 선충 균주의 일부에 대한 NIH 국립 연구 자원 센터 (NCRR)에 의해 투자 Caenorhabditis 유전학 센터에 감사드립니다. H.F. 엡스타인에 의해 개발된 단클론 항체는 NICHD의 후원하에 개발되고 아이오와 대학 생물학부에 의해 유지된 발달 연구 Hybridoma 은행에서 취득되었습니다. 이 연구는 이스라엘 과학 재단 (278/18) 및 이스라엘 과학 기술부및 외교 국제 협력부, 국가 진흥, 이탈리아 공화국 (제 3-14337 권부)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 벤-즈비 연구소 회원들에게 이 원고를 준비하는 데 도움을 주신 것에 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well-plates SPL BA3D16B
40 mm plates Greiner Bio-one 627160
60 mm plates Greiner Bio-one 628102
6-well plates Thermo Scientific 140675
96 well 2 mL 128.0/85mm Greiner Bio-one 780278
Agar Formedium AGA03
Ampicillin Formedium 69-52-3
bromophenol blue Sigma BO126-25G
CaCl2 Merck 1.02382.0500
Camera Qimaging q30548
Cholesterol Amresco 0433-250G
Confocal Leica DM5500
Filter (0.22 µm) Sigma SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ165FC
Glycerol Frutarom 2355519000024
IPTG Formedium 367-93-1
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 1.04873.1000
KOH Bio-Lab 001649029100
MgSO4 Fisher 22189-08-8 Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody Hybridoma Bank 5-6
Na2HPO4·7H2O Sigma s-0751
NaCl Bio-Lab 001903029100
Peptone Merck 61930705001730
Plate pouring pump Integra does it p920
RNAi Chaperone library NA NA
SDS VWR Life Science 0837-500
ß-mercaptoethanol Bio world 41300000-1
stereomicroscope Leica MZ6
Tetracycline Duchefa Biochemie 64-75-5
Tris Bio-Lab 002009239100
Tween-20 Fisher BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
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생물학 문제 160 Caenorhabditis elegans,샤페론 유전 상호 작용 프로테오스타증 RNAi 화면 온도 에 민감한
조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 <em>Caenorhabditis elegans를</em> 사용
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Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., … More

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions. J. Vis. Exp. (160), e61140, doi:10.3791/61140 (2020).

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