Per studiare le interazioni chaperone-chaperone e chaperone-substrato, eseguiamo screening di interazione sintetica in Caenorhabditis elegans utilizzando l'interferenza dell'RNA in combinazione con mutazioni lievi o sovraespressione di chaperoni e monitoriamo la disfunzione proteica tessuto-specifica a livello di organismo.
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Articolo metodologico
Utilizzo di Caenorhabditis elegans per lo screening delle interazioni chaperone tessuto-specifiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il corretto ripiegamento e assemblaggio di proteine e complessi proteici sono essenziali per la funzione cellulare. Le cellule impiegano percorsi di controllo della qualità che correggono, sequestrano o eliminano le proteine danneggiate per mantenere un proteoma sano, garantendo così la proteostasi cellulare e prevenendo ulteriori danni alle proteine. A causa delle funzioni ridondanti all'interno della rete di proteostasi, lo screening per fenotipi rilevabili utilizzando knockdown o mutazioni in geni chaperone-encoding nell'organismo multicellulare Caenorhabditis elegans porta alla rilevazione di fenotipi minori o nulli nella maggior parte dei casi. Abbiamo sviluppato una strategia di screening mirata per identificare gli accompagnatori necessari per una funzione specifica e quindi colmare il divario tra fenotipo e funzione. In particolare, monitoriamo nuove interazioni chaperone utilizzando schermi di interazione sintetica RNAi, abbattendo l'espressione dell'accompagnatore, un accompagnatore alla volta, in animali portatori di una mutazione in un gene che codifica per l'accompagnatore o sovraesprimendo un accompagnatore di interesse. Interrompendo due chaperoni che individualmente non presentano fenotipo grossolano, possiamo identificare chaperoni che aggravano o espongono un fenotipo specifico quando entrambi sono perturbati. Dimostriamo che questo approccio può identificare insiemi specifici di chaperoni che funzionano insieme per modulare il ripiegamento di una proteina o di complessi proteici associati a un dato fenotipo.
Introduzione
Le cellule affrontano il danno proteico impiegando macchinari di controllo qualità che riparano, sequestrano o rimuovono eventuali proteine danneggiate1,2. Il ripiegamento e l'assemblaggio di complessi proteici sono supportati da chaperoni molecolari, un gruppo eterogeneo di proteine altamente conservate che possono riparare o sequestrare le proteine danneggiate3,4,5,6,7. La rimozione delle proteine danneggiate è mediata dal sistema ubiquitina-prote....
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Protocollo
1. Preparazione di piastre di crescita di nematodi per RNAi
- In una bottiglia da 1 L aggiungere 3 g di NaCl, 2,5 g di Bacto-Peptone, 17 g di agar e acqua distillata fino a 1 L e autoclave.
- Raffreddare la bottiglia a 55 °C.
- Aggiungere 25 mL di 1 M KH2PO4,pH 6,0, 1 mL di 1 M CaCl2,1 mL di 1 M MgSO4e 1 mL di soluzione di colesterolo(Tabella 1)per produrre mezzi di crescita nematodi (NGM).
- Aggiungere 1 mL di ampicillina (100 mg/mL) e 0,5 mL di 1 M IPTG(Tabella 1)per produrre la soluzione di NGM-RNAi.
NOTA: I batteri HT115 (DE3) E. coli comunemen....
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Risultati
Utilizzo di mutazioni sensibili alla temperatura in UNC-45 per lo screening delle interazioni aggravanti o attenuanti in condizioni permissive o restrittive, rispettivamente
L'assemblaggio e la manutenzione muscolare offrono un sistema efficace per studiare le interazioni chaperone tessuto-specifiche. L'unità funzionale dei muscoli contrattili, il sarcomero, presenta una disposizione cristallina di proteine strutturali e regolatrici. La stabilità della proteina motoria miosina e la sua incorporazione .......
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Discussione
Rimane carente un quadro integrato della rete di proteostasi che rifletta come è organizzata e funziona in diverse cellule e tessuti metazoici. Per affrontare questa carenza, sono necessarie informazioni specifiche sulle interazioni di vari componenti di questa rete, come gli accompagnatori molecolari, in tessuti specifici durante il corso dello sviluppo e dell'invecchiamento. Qui, abbiamo mostrato come l'uso di perturbazioni tessuto-specifiche ci ha permesso di esaminare la rete di chaperone in un determinato tessuto. P.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Caenorhabditis Genetics Center, finanziato dal NIH National Center for Research Resources (NCRR), per alcuni dei ceppi di nematodi. Gli anticorpi monoclonali sviluppati da H.F. Epstein sono stati ottenuti dallo Developmental Studies Hybridoma Bank sviluppato sotto gli auspici del NICHD e mantenuto dal Dipartimento di Biologia dell'Università dell'Iowa. Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione della Israel Science Foundation (sovvenzione n. 278/18) e da una sovvenzione del Ministero israeliano della Scienza e della Tecnologia, e del Ministero degli Affari Esteri e della Cooperazione Internazionale, Direzione Generale per la Promozione del Paes....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre a 12 pozzetti | SPL | BA3D16B | |
| piastre da 40 mm | Greiner Bio-one | 627160 | |
| piastre da 60 mm | Greiner Bio-one | 628102 | |
| piastre a 6 pozzetti | Thermo Scientific | 140675 | |
| 96 pozzetti 2 mL 128,0/85 mm | Greiner Bio-one | 780278 | |
| Agar Formedium | AGA03 | ||
| Ampicillina | Formedium | 69-52-3 | |
| blu di bromofenolo | Sigma | BO126-25G | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | |
| Fotocamera | Qimaging | q30548 | |
| Colesterolo | Amresco | 0433-250G | |
| Confocale | Leica | DM5500 | |
| Filtro (0,22 µ m) | Sigma | SCGPUO2RE | |
| Stereomicroscopio fluorescente | Leica | MZ165FC | |
| Glicerolo | Frutarom | 2355519000024 | |
| IPTG | Formedium | 367-93-1 | |
| KCl | Merck | 104936 | |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873.1000 | |
| KOH | Bio-Lab | 001649029100 | |
| MgSO4 | Fisher | 22189-08-8 | Dono dal laboratorio Morimoto |
| Miosina MHC A (MYO-3) Anticorpo | Hybridoma Bank | 5-6 | |
| Na2HPO4· 7H2O | Sigma | s-0751 | |
| NaCl | Bio-Lab | 001903029100 | |
| Peptone | Merck | 61930705001730 | |
| Pompa di colata a piastre | Integra | lo fa p920 | |
| RNAi Chaperone libreria | NA | NA | |
| SDS | VWR Life Science | 0837-500 | |
| ß- mercaptoetanolo | Bio world | 41300000-1 | |
| stereomicroscopio | Leica | MZ6 | |
| Tetraciclina | Duchefa Biochemie | 64-75-5 | |
| Tris | Bio-Lab | 002009239100 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 |
Riferimenti
- Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
- Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E.
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Ristampe e permessi
