פרוטוקול זה מתאר את הזיהוי של נדידת תאי גזע שלד periosteal בתיווך CCL5 בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה תוך-וינטלית חיה של בעלי חיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה בזמן אמת של הגירה הנגרמת על ידי CCL5 של תאי גזע שלד Periosteal בעכברים
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי גזע שלד periosteal (P-SSCs) חיוניים לתחזוקה ותיקון עצם לכל החיים, מה שהופך אותם למוקד אידיאלי לפיתוח טיפולים כדי לשפר את ריפוי שבר. תאי periosteal במהירות נודדים לפציעה כדי לספק כונדרוציטים חדשים osteoblasts לריפוי שבר. באופן מסורתי, היעילות של ציטוקינים כדי לגרום לנדידת תאים נערכה רק במבחנה על ידי ביצוע transwell או שריטה. עם התקדמות במיקרוסקופיה תוך-וינטלית באמצעות עירור מולטי-פוטונים, לאחרונה התגלה כי 1) P-SSCs מבטאים את הגן הנודד CCR5 ו-2) טיפול בליגנד CCR5 המכונה CCL5 משפר את ריפוי השברים ואת ההעברה של מחשבי P-SSCs בתגובה ל- CCL5. תוצאות אלה נלכדו בזמן אמת. מתואר כאן פרוטוקול כדי לדמיין נדידת P-SSC מן נישה שלד תפר עגל (SSC) נישה כלפי פציעה לאחר טיפול עם CCL5. הפרוטוקול מפרט את בנייתו של ריסון עכבר והר הדמיה, הכנה כירורגית של קלבריה העכבר, אינדוקציה של פגם קלבריה, ורכישת הדמיה לשגות זמן.
מבוא
תיקון שבר הוא תהליך דינמי, רב תאי, השונה מהתפתחות השלד העוברי ושיפוץ. במהלך תהליך זה, אינדוקציה של אותות פגיעה מרקמה פגומה מלווה גיוס מהיר, התפשטות, ובידול לאחר מכן של תאי גזע שלד / אבות, אשר כולם קריטיים ליציבות הכוללת קיבוע של שברים1. בפרט, שלבים מוקדמים של ריפוי שבר דורשים היווצרות קדנציה רכה, המיוחסת בעיקר לתאים תושב periosteal2. כאשר העצמות נפגעות, תת-קבוצה של תאי פריוסטאלי מגיבים במהירות ותורמים לסחוסים מובחנים חדשים ומתווכים אוסטאובלסטים בתוך היבלת3, מה שמסבך את נוכחותה של אוכלוסיית תאי גזע שלד/אבות מובהקת בתוך periosteum. לכן, הזיהוי והאפיון התפקודי של תאי גזע השלד (SSCs) המקומיים פריוסטאו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל העכברים נשמרו בתנאים נטולי פתוגנים, וכל ההליכים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של מכללת ביילור לרפואה (IACUC).
1. הכנת עכבר
- קרוס Mx1-Cre17 ו-Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (טום)18 עכברים (שנרכשו ממעבדת ג'קסון) עם עכברי αSMA-GFP (מסופקים כאן על ידי ד"ר איבו קלג'זיץ' והנרי קרוננברג) כדי ליצור עכברי Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) עכברים (איור 2A).
- עבור אינדוקציה Mx1-Cre, להזריק עכברים עם 25 מ"ג/ק"ג pIpC כ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אבות השלד הוצעו להיות בעלי פוטנציאל נודד או במחזור הדם20. לאחרונה, Mx1-Cre +Rosa26-עגבניות +α SMA-GFP+ (Mx1/עגבניות/αSMA-GFP) נוצרו עכברים כתב, שבו P-SSCs מסומנים על ידי Mx1 + α SMA + תיוג כפול (איור 2A, B). העברה משמעותית של Mx1+α SMA+ P-SSCs התרחשה מתוך mesenchyme תפר בתוך 24-48 שעות לאחר
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במהלך ריפוי העצם, תאי periosteal הם המקור העיקרי של כונדרוציטים מובחנים חדשים אוסטאובלסטים בתוך יבלת פציעה3. בדומה מוח עצם, SSCs osteogenic / chondrogenic זוהו גם periosteum4,5,6. הערכת מאפיינים פונקציונליים P-SSC אנדוגני הוא מאתגר מבחינה טכנית. לעתים קרובות, דינמיקה נודדת של SSCs מוערכים במבחנה, מה שהופך את הפרשנות של מערכות vivo המקבילות שלהם מאתגר. בשל ההתקדמות האחרונה במיקרוסקופיה תוך-וינטלית של בעלי .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
L.C.O. ו- D.P. לחשוף פטנט תלוי ועומד שכותרתו "תאי גזע שלד Periosteal בתיקון עצם" (BAYM. P0264US. פ1). המחברים הנותרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית מחלות העצמות של פרס טקסס, פרס קרן החוק קרוליין וויז, ואת NIAMS של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי פרס R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 ל- D.P. אנו מודים ל- M.E. Dickinson ות.ג'יי וודאקאן בהדמיה אופטית BCM וליבת מיקרוסקופיה חיונית וליבות הטכנולוגיה המתקדמת BCM במימון NIH (AI036211, CA125123 ו- DK056338).
.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ½ ” פוסט אופטי | ThorLabs | TR2 | להדמיה הר |
| 1 מ"ל מזרק | BD | 309659 | |
| 27G מחט | BD PercisionGlide | 305111 | |
| 29G מזרק אינסולין | McKesson | 102-SN05C905P | |
| 50 מ"ל צינור קוניקול | פלקון | 352098 | לריסון עכבר |
| צלחת זווית מתכווננת | Renishaw | R-PCA-5023-50-20 | לתושבת הדמיה |
| מגבוני אלכוהול | Coviden | 6818 | |
| betadine פילינג כירורגי | הנרי שן | 67618-151-16 | |
| בופרנורפין SR-LAB | ZooPharm | 1 מ"ג/מ"ל משולבת שחרור מושהה | |
| III | מתקבל מהווטרינר הצוות | N/A | 37.6 מ"ג/מ"ל קטמין; 1.9 מ"ג/מ"ל קסילזין; 0.37 מ"ג/מ"ל אצפרונאזין |
| Coverslip | Fisher | 12-545-87 | 24 x 40 פרימיום superslip |
| עדין forcepts | FST | 11254-20 | |
| קטמין | KetaVed | 50989-161-06 | 100 מ"ג/מ"ל |
| Leica TCS SP8MP עם DM6000CFS | Leica Microsystems | N/A | |
| Matrigel | R & D Systems | 344500101 | |
| סרט רפואי | McKesson | 100199 | 3 אינץ' x 10 יארד (7.6 ס"מ x 9.1 מ') |
| מתוצלולוזה | אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי | 19560 | |
| מספריים מיקרודיסקציה | FST | 1456-12 | |
| שלב ממונע | אוטומציה אנהיים | N/A | |
| מחזיק מחט | FST | 12500-12 | |
| תפרים בלתי נספגים | McKesson | S913BX | מונופילמנט ניילון 5-0 תפרים בלתי נספגים עם מחט חיתוך הפוכה C-1 מחוברת |
| משחה אופטלמית | רוגבי | 0536-1086-91 | |
| RANTES | Biolegend | 594202 | 10 ומיקרו; גרם/50 ומיקרו; L |
| מהדק זווית ישרה עבור ½ ” עמוד, 3/16 אינץ' Hex | ThorLabs | RA90 | עבור תושבת הדמיה |
| קפיצית 3/16 אינץ' נעילת משושה ו-frac14; ” בורג אגודל | ThorLabs | TS25H | לתושבת הדמיה |
| צמר גפן סטרילי | הנרי שן | 100-9249 | |
| DPBS סטרילי (1x) | קורנינג | 21-030-CV | |
| וילונות סטריליים | McKessen | 25-517 | |
| כפפות כירורגיות | McKessen | 3158VA | |
| Taro Pharmaceuticals ארה"ב, בע"מ | 51672-2120-2 | ||
| סט איסוף דם ואקוטיינר | BD | REF 367298 | 25G סט עירוי מחט פרפר עם צינורות 12 אינץ' |
מקורות
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
