L’ADN extracellulaire (ECDNA) libéré pendant la mort cellulaire est proinflammatoire et contribue à l’inflammation. La mesure de l’ECDNA sur le site de la blessure peut déterminer l’efficacité du traitement thérapeutique dans l’organe cible. Ce protocole décrit l’utilisation d’un outil d’apprentissage automatique pour automatiser la mesure de l’ECDNA dans les tissus rénaux.
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Article de méthode
Apprentissage automatique supervisé pour la semi-quantification de l’ADN extracellulaire dans la glomerulonephrite
Dans cet article
Résumé
Résumé
La mort cellulaire glomerulaire est une caractéristique pathologique de l’anticorps cytoplasmique associé à l’anticorps cytoplasmique anti neutrophile de myeloperoxidase (MPO-AAV). L’acide désoxyribonucléique extracellulaire (ECDNA) est libéré pendant différentes formes de mort cellulaire, y compris l’apoptose, la nécrose, la nécroptose, les pièges extracellulaires neutrophiles (NET) et la pyroptose. La mesure de cette mort cellulaire prend beaucoup de temps avec plusieurs biomarqueurs différents nécessaires pour identifier les différentes formes biochimiques de la mort cellulaire. La mesure de l’ECDNA est généralement effectuée dans le sérum et l’urine en tant que substitut pour les dommages rénaux, pas dans l’organe cible réel où la blessure pathologique se produit. La difficulté actuelle dans l’étude ecDNA dans le rein est le manque de méthodes pour la formaline tissu incorporé de paraffine fixe (FFPE) à la fois expérimentalement et dans les biopsies de rein humain archivées. Ce protocole fournit un résumé des étapes nécessaires pour tacher pour ecDNA dans le tissu FFPE (humain et murin), étancher l’autofluorescence et mesurer l’ECDNA dans les images résultantes à l’aide d’un outil d’apprentissage automatique de la segmentation disponible au public open source de Wbeka. La segmentation weka formable est appliquée à l’ECDNA dans le glomeruli où le programme apprend à classer l’ECDNA. Ce classificateur est appliqué aux images rénales acquises ultérieures, réduisant ainsi le besoin d’annotations manuelles de chaque image individuelle. L’adaptabilité de la segmentation weka formable est démontrée plus loin dans le tissu rénal de la glomerulonephrite expérimentale de murine (GN), pour identifier les NET et l’ecMPO, les contributeurs pathologiques communs au GN anti-MPO. Cette méthode fournit une analyse objective de l’ECDNA dans les tissus rénaux qui démontre clairement l’efficacité dans laquelle le programme de segmentation Weka moyenisable peut distinguer l’ECDNA entre les tissus rénaux normaux sains et les tissus rénaux malades. Ce protocole peut facilement être adapté pour identifier l’ECDNA, les NET et l’ecMPO dans d’autres organes.
Introduction
L’anticorps cytoplasmique anti neutrophile de myéloperoxydase associé à la vasculite (MPO-AAV) est une maladie auto-immune qui entraîne une insuffisance rénale causée par une lésion glomerulaire pathologique avec une mort cellulaire considérable et la libération d’acide désoxyribonucléique (ADN)1,2. L’ADN peut activer le système immunitaire en agissant comme un signal de danger. Dans des conditions normales et saines, l’emplacement nucléaire de l’ADN offre une protection contre l’exposition au système immunitaire. L’auto-ADN qui est libéré extracellulairement pendant les processus pathogènes ou l’autoimmunité ....
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Protocole
Cette méthode permet la détection de pan ecDNA à partir de toutes les formes de mort cellulaire. La même méthode et les mêmes anticorps sont utilisés pour les tissus de biopsie rénale humaine (à partir de l’étape 4). Tous les sujets animaux et humains ont reçu l’approbation de l’Éthique de l’Université Monash et de Monash Health, Clayton, Victoria, Australie.
1. Coloration pour ecDNA avec DAPI et β-Actin
- Induire un modèle de 20 jours de glomerulonephrite anti-myeloperoxidase (anti-MPO-GN) chez les souris C57/Bl6 âgées de 8 à 10 semaines, avec des commandes9.
- Euthanasier les souris humainement à l’ai....
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Résultats
Ces images représentent les multiples étapes nécessaires pour utiliser avec succès la segmentation weka formable pour minimiser la mesure manuelle à forte intensité de main-d’œuvre de l’ecDNA dans le tissu rénal ffpe fluorescent d’une souris avec anti-MPO GN induit. Ces étapes sont résumées à la figure 1 et à la figure 2 avec des images prises directement du programme de segmentation Weka, décrivant chaque étape du processus d’an.......
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Discussion
Il existe de multiples protocoles qui mesurent les marqueurs proinflammatoires dans le sérum et l’urine des patients et des modèles de souris de glomerulonephrite. Ce protocole décrit permet l’analyse des produits de la mort cellulaire (ecDNA, NETs et ecMPO) dans le glomerulus directement. Les étapes les plus cruciales de ce protocole sont la préparation et l’imagerie des tissus. Le principal élément limitant de l’utilisation d’une méthode de coloration fluorescente pour l’analyse est l’autofluorescence des tissus. Le ti.......
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Déclarations de divulgation
Rien à divulguer.
Remerciements
Nous reconnaissons Monash Micro Imaging pour l’utilisation du microscope à balayage laser confocal vertical Nikon C1 et de la plate-forme d’histologie Monash pour le traitement des tissus rénaux.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Les solutions d’albumine sérique bovine | SIGMA | A2153 | à 5 % et à 1 % sont constituées de PBS, peuvent être préparées en vrac et congelées - jetées une fois décongelées. |
| Anticorps à absorption croisée IgG (H+L) de poulet Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Tourner dans une mini-centrifugeuse pendant 1 minute avant l’utilisation pour éviter tout conjugué libre dans votre cocktail d’anticorps |
| Anticorps IgG (H+L) de poulet anti-souris, anticorps à absorption croisée Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Tourner dans une mini-centrifugeuse pendant 1 minute avant l’utilisation pour éviter tout conjugué libre dans votre cocktail |
| d’anticorpsPoulet anti lapin IgG (H+L) Anticorps à absorption croisée Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Tourner dans une mini centrifugeuse pendant 1 minute avant utilisation pour éviter tout conjugué libre dans votre cocktail d’anticorps |
| Sérum de poulet | SIGMA | C5405 | Composé de 1 % BSA/PBS |
| Lamelles 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 Ce n’est pas une épaisseur standard - conçu pour une utilisation en microscopie |
| confocaleEDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Ajouter TRIS et EDTA ensemble dans de l’eau distillée et un pH à 9, pour la récupération de l’antigène, peut être préparé dans une solution 10x |
| Éthanol 30 %, 70 % et 100 | %Chem Supply | UN1170 | Fourni sous forme d’éthanol 100 % non dénaturé - dilué à 30 % et 70 % avec de l’eau distillée |
| Formaldéhyde, 4 % (10 % Formalin tamponné neutre) | TRAJAN | NBF-500 | Le rein est placé dans un tube de 5 ml contenant 3 ml de formol pendant 16 heures à RT, le formol doit être utilisé dans une hotte |
| Lames d’histologie en verre - Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | L’utilisation de lames à revêtement chargé positif est essentielle. Nous ne recommandons pas l’utilisation de la poly-L-lysine pour le revêtement des lames, car les tissus se délogent des lames pendant l’étape de récupération de l’antigène. |
| D | AF3667 | Aliquote et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée | |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Utilisé pur, dans des récipients de 200 ml de support de coloration, utilisation dans une hotte |
| Stylo hydrophobe | VECTOR | Labs H-400 | Utilisation pour dessiner un cercle autour du tissu rénal |
| Souris anti humain/souris Peptidyl arginase 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Aliquote et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée |
| Tête laser à balayage confocal Nikon C1 fixée au microscope inversé Nikon Ti-E | Aliquote scientifique | et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée | |
| Saline tamponnée au phosphate | SIGMA | P38135 | 0,01M PB/0,09 % NaCl Maquillage jusqu’à 5L à la fois |
| Autocuiseur 6L Tefal secure 5 Neo stainless | Tefal | GSA-P2530738 | Acheté dans un magasin d’articles ménagers |
| local Prolong Gold DAPI | Life Technologies | P36962 | Appliquer les gouttes directement sur la lamelle |
| Anticorps anti-actine bêta humain / souris de lapin | ABCAM | ab8227 | Aliquote et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée |
| Chien anti humain / souris Anticorps H3Cit | ABCAM | ab5103 | Aliquote et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée |
| Rack de coloration 24 lames | ProScitech | H4465 | La grille de coloration choisie doit pouvoir résister à l’ébullition sous pression et à l’incubation dans un four à 60 degrés |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | 0,3 % Ajouter 3g à une bouteille de 1L dans 70 % d’éthanol, filtrer et protéger de la lumière - stable pendant 6 mois à température ambiante |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | Ajouter TRIS et EDTA ensemble dans de l’eau distillée et pH à 9, pour le prélèvement d’antigènes, peut être préparé dans une solution 10x |
| Xylene | Trajan | XL005/20 | Doit être utilisé dans une hotte |
Références
- O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H.
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Réimpressions et autorisations
