ハウスダニ(HDM)などの環境アレルゲンには、アレルギー性炎症を調節するために自然免疫応答を活性化する微生物物質が含まれていることが多い。ここで示したプロトコルは、好酸球性肺の炎症を調節する際のHDMアレルゲンにおけるdsRNA種の同定と免疫原性活性の特徴を示す。
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この記事について
サマリー
要約
ハウスダニ(HDM)などの環境アレルゲンは、異常な2型応答を駆動するアレルギータンパク質と自然免疫応答を誘導する微生物物質の両方を含む複雑な形態であることが多い。これらのアレルゲン関連微生物成分は、アレルギー性喘息などの2型炎症性疾患の発症を調節する上で重要な役割を果たす。ただし、基礎となるメカニズムはほとんど定義されていません。ここで提示されるプロトコルは、アレルゲン関連免疫刺激RNAの構造的特性およびインビボ活性を決定する。具体的には、肺におけるIFN応答を刺激し、HDM誘発性アレルギー性喘息のマウスモデルにおける重度の肺好酸球症の発症を抑制することができる二本鎖RNA(dsRNA)種の存在について調べられる。ここでは、HDM種を含むアレルゲンから単離された全RNA中のdsRNA構造を示すドットブロット、マウス肺におけるインターフェロン刺激遺伝子(ISG)発現におけるHDM RNAの活動を測定するRT-qPCR、およびBALおよび肺における好酸球数に対するHDM RNAの影響を決定するFACS分析の3つのアッセイを含む。
概要
ストラチャン1が当初提案した衛生仮説に基づいて、内毒素などの環境微生物因子への幼児期の暴露は、アレルギー障害の発症から22、33を防ぐ。微生物感染の間、例えば、ウイルス感染、外来核酸の自然免疫検出(RNA/DNA)は宿主防御応答44、5、65,6を引き起こす。しかし、ハウスダニ(HDM)や他の昆虫アレルゲン中の長い二本鎖RNA(dsRNA)種などの免疫原性核酸の存在と有病率は不明のままである。このプロトコルは、HDMまたは昆虫および非昆虫アレルゲンが、アレルギー性喘息のマウスモデルにおける重度の好酸球性肺炎症の発症を打ち消すために保護免疫応答を活性化することができる長いdsRNA種を含むかどうかを決定するために設計された。ここでは、アレルゲン誘導性好酸球性肺の炎症を調節するために必要なHDM全RNAの構造決定因子を評価するための3つの簡単かつ迅速な方法を提供する。
粘膜免疫系は、体内で最大の免疫器官であり、微生物感染とアレルギー侮辱77,8
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プロトコル
ここで説明する実験的な手順は、テキサス大学健康サンアントニオ校の施設動物ケアと使用委員会によって承認されました.
1. DSRNA構造のHDM総RNAにおける存在を示すドットブロット
- アレルゲン、昆虫、非昆虫アレルゲンからのRNAの全絶縁
- HDM、昆虫、または非昆虫動物を生きて採取または商業的に得られた50mLチューブに入れ、液体-N2で素早く凍結する。その後、-70°Cで保管し、その後のトータルRNA分離を行います。
注:この実験では、アレルギーの一般的な供給源であることが知られているため、HDM、昆虫、および非昆虫動物が選択されました。さらに、RNAの免疫刺激機能は不明のままである。 - -70°Cで保存されたHDM、昆虫または非昆虫動物の適正量(体積100μL以下)をビーズ(1.4mmセラミック球)を含む2mLチューブに移し、10分間液体N2容器にチューブを凍結します。
- RNAの全絶縁については、各チューブにグアニジニウム・チオシアネートベースのRNA分離試薬24を1mL加え、高エネルギー細胞破壊器で昆虫および非昆虫小動物を45秒間、氷上で冷やします。この手順を 2 回繰り返します。
- ステップ1.1.3から新しい1.5 mLチューブに溶液を移し、各チューブと渦に200 μLのク....
- HDM、昆虫、または非昆虫動物を生きて採取または商業的に得られた50mLチューブに入れ、液体-N2で素早く凍結する。その後、-70°Cで保管し、その後のトータルRNA分離を行います。
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結果
HDM、昆虫および非昆虫小動物における長いdsRNA構造の存在を、dsRNA特異的マウスモノクローナル抗体J2(≥ 40bp)を用いてドットブロットによって調べた。RNase IIIは、DsRNAを12-15 bp dsRNA断片に消化するために使用され、これはJ2では検出できなかった(図1)。
用量依存的にマウス肺における自然免疫応答を刺激するHDM総RNAの能力をRT-qPCR(図2、上)で分析した。RNase III治療は、HDM全RNAの免疫刺激活性を廃止し、HDM総RNA中のdsRNA構造が肺の自然免疫活性に不可欠であることを示す(図2、低)。
HDM全RNAの重症型2肺炎症の発症に対する阻害効果を、FACS分析で評価した(図3A)。本研究では、好酸球性肺炎症をHDM抽出物によって.......
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ディスカッション
現在のプロトコルは、アレルギー性喘息のマウスモデルにおける好酸球性肺炎症の発症に対するアレルゲン関連微生物RNAの免疫刺激特性およびそれらの影響を評価する方法を記述する。長いdsRNAは哺乳動物細胞におけるインターフェロン応答を強力に活性化することができる多くのウイルスの複製中間体として知られているが、HDMアレルゲンにおけるそれらの存在は我々の最近の研究15まで知られていなかった。本稿で提示されるRNAドットブロット、RT-qPCRおよびFACS分析の組み合わせは、アレルゲン誘導性好酸性炎症の調節に極度に関与している環境アレルゲン中のdsRNA種などの内性成分を解剖する良い例を提供するかもしれない。
このプロトコルでは、RNAドットブロットは、特異的に配列に依存しないdsRNA(≥40bp)に結合するマウスモノクローナル抗体J2を使用して天然アレルゲン中のdsRNA構造の存在を検出するために採用されている。この方法は、J2抗体がRNase T1(単鎖RNA特異的エンドヌクレアーゼ)で前処理されたdsRNAサンプルをまだ認識できるが、.......
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開示事項
開示するものは何もありません。
謝辞
フローサイトメトリーの技術支援をしてくれたカーラ・ゴレナさんに感謝します。L.S.は、中国奨学金協議会と湖南省大学院イノベーション財団(CX201713068)の支援を受けています。H.H.A.は、サウジアラビアのサカカ大学ジュフ大学応用医科学部臨床検査科学科の支援を受けています。X.D.L.は、UTヘルスサンアントニオ医学スタートアップファンドとマックスとミニーボーカー基金によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.40 以上m Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL チューブ | TH.ガイヤー | 7696702 | |
| 50mLチューブ | TH。ガイヤー | 7696705 | |
| 70%エタノール | デコンラボ | 2701 | |
| アブソリュートカウンティングビーズライフサイエンスヨーロッパ | BV | C36950 | |
| ACK-RBC 溶解バッファー | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | 注:局所的に収集された | |
| 抗体希釈バッファー | (レシピについては表 5 を参照) | ||
| 抗マウス CD11b V450 ラット (クローン M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 から200希釈抗 |
| マウスCD11c PE-Cy7(クローンN418) | BioLegend | 117317 | 1〜200希釈抗 |
| マウスCD19 Alexa Flour 647(クローン1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1〜200希釈抗 |
| マウスCD3e APC(クローン145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1〜200希釈抗 |
| マウスCD45 APC-Cy7(クローン:30-F11) | BioLegend | 103130 | 1〜200希釈 |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 希釈 |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 希釈 |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200希釈 |
| 抗マウス Siglec-F PE (クローン E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 から 200 希釈 |
| BCIP/NBT 基質 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | PI34042 | |
| ブロッキングバッファー | (レシピは表 5 を参照) | ||
| カニュール、20G X 1.5 インチ | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| 遠心分離機 | サーモフィッシャー サイエンティフィック | 75004030 | |
| CFX384 タッチリアルタイム PCR 解析システム | バイオ・ラッド ラボラトリーズ | 1855485 | |
| クロロホルム | モフィッシャーサイエンティフィック | C298-500 | |
| ゴキブリ | アラボラトリーズ | B26 | |
| カウントビーズ | サーモフィッシャーScientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath - Four Blocks | Universal Medical, Inc. | ||
| ミミズ | サンアントニオ | 注:局所的に収集された | |
| エチレンジアミン四酢酸(EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACSバッファー | (表5のレシピを参照) | ||
| Falcon丸底ポリプロピレンチューブ、5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| フローサイトメーター(BD FACS Celesta) | BDBiosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| 血球計算盤 | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb 抗マウス CD16/CD32 (クローン:2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA合成キット | バイオ・ラッド ラボラトリーズ | 1708891 | |
| イソフルラン | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| イソプロパノール | サーモフィッシャーサイエンティフィック | BP2618500 | |
| J2 抗 dsRNA モノクローナル抗体 | SCICONS | 10010200 | |
| 肺消化液 | (表 5 のレシピを参照) | ||
| Lysing Matrix D | MPBiomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| マウス (メス、8-12週齢、C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| 顕微鏡 | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex サプライ | TSCND2000C | |
| 針、21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| ナイロンストリング | Dynarex | 3243 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | ロンザ | BE17-516F | |
| RNase III | サーモフィッシャーサイエンティフィック | AM2290 | |
| RNase T1 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | AM2283 | |
| はさみ | ロボズ 手術器具 | RS-6802 | |
| シェーカーまたは小型ラボミキサー | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 希釈 |
| Spider | San Antonio | 注:局所的に収集された | |
| TBS | (表5のレシピを参照) | ||
| TBS-T | (表5のレシピを参照) | ||
| 総細胞培地 | (表5のレシピを参照) | ||
| TRIzol 試薬 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| ズメバ | サンアントニオ | 注:地元で収集 |
参考文献
- Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
- Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
- Stein, M. M.....
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