In Vivo Kwantificering van eiwitomzet in Aging C. Elegans met behulp van Photoconvertible Dendra2

Summary

Hier gepresenteerd is een protocol om de afbraak van het eiwit huntingtine gefuseerd aan de fotoconvertible fluorophore Dendra2 te controleren.

Abstract

Eiwitten worden voortdurend gesynthetiseerd en afgebroken in een cel om homeostase te behouden. In staat zijn om de afbraak van een eiwit van belang te controleren is de sleutel tot het begrijpen van niet alleen de levenscyclus, maar ook om onevenwichtigheden in het proteostasenetwerk aan het licht te brengen. Deze methode laat zien hoe de afbraak van het ziekteverwekkende eiwit huntingtine kan worden gevolgd. Twee versies van huntingtine gefuseerd tot Dendra2 worden uitgedrukt in het C. elegans zenuwstelsel: een fysiologische versie of een met een uitgebreide en pathogene strook glutamines. Dendra2 is een fotoconverteerbaar fluorescerend eiwit; op een korte ultraviolette (UV) bestraling puls, Dendra2 schakelt zijn excitatie / emissie spectra van groen naar rood. Net als bij een pulse-chase experiment, kan de omzet van de omgebouwde red-Dendra2 worden gecontroleerd en gekwantificeerd, ongeacht de interferentie van nieuw gesynthetiseerd groen-Dendra2. Met behulp van confocale microscopie en door de optische transparantie van C. elegansis het mogelijk om de afbraak van huntingtine-Dendra2 in een levend, ouder wordend organisme te monitoren en te kwantificeren. Neuronale huntingtine-Dendra2 wordt kort na de conversie gedeeltelijk afgebroken en in de loop van de tijd verder gewist. De systemen die de afbraak beheersen zijn ontoereikend in aanwezigheid van mutant huntingtine en worden verder aangetast door veroudering. Neuronale subtypes binnen hetzelfde zenuwstelsel vertonen verschillende omzetcapaciteiten voor huntingtine-Dendra2. Over het algemeen kan het monitoren van een eiwit dat met Dendra2 is gesmolten, belangrijke informatie opleveren, niet alleen over de degradatie en de spelers van het betrokken proteostasenetwerk, maar ook over de locatie, de handel en het vervoer ervan.

Introduction

Het proteoom van een levend organisme vernieuwt zichzelf voortdurend. Eiwitten worden voortdurend afgebroken en gesynthetiseerd volgens de fysiologische vraag van een cel. Sommige eiwitten worden snel geëlimineerd, terwijl andere langer worden geleefd. Het monitoren van eiwitdynamica is een eenvoudigere, nauwkeurigere en minder invasieve taak bij het gebruik van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten (FPs). FPs vormen auto-katatisch en kunnen worden gefuseerd tot elk eiwit van belang (POI), maar vereisen geen enzymen te vouwen of cofactoren nodig, behalve voor zuurstof¹. Een nieuwere generatie FPs is onlangs ontworpen om kleur te schakelen op bestraling met een lichtpuls van bepaalde golflengte. Deze fotoactivatable FPs (PAF's) maken het mogelijk om POI's, organellen of cellen waarin ze zich bevinden, te labelen en bij te houden, en om hun kwantitatieve en/of kwalitatieve parameters te onderzoeken². FPs maken het mogelijk om elke POI's beweging, directionaliteit, snelheid van beweging, coëfficiënt van diffusie, mobiele versus onbeweeglijke breuken, de tijd dat het zich in een cellulair compartiment, evenals de omloopsnelheid. Voor specifieke organellen kunnen bewegings- en transport- of splijtings- en fusiegebeurtenissen worden bepaald. Voor een bepaald celtype kunnen de positie, de verdelingssnelheid, het volume en de vorm van een cel worden vastgesteld. Cruciaal is dat het gebruik van PAFP's tracking mogelijk maakt zonder continue visualisatie en zonder interferentie van een nieuw gesynthetiseerde sonde. Studies zowel in cellen als in hele organismen hebben met succes PAFP's gebruikt om biologische vraagstukken in vivo aan te pakken, zoals de ontwikkeling van kanker en metastase, assemblage of demontage van het cytoskelet en RNA-DNA/eiwit interacties³. In dit manuscript worden lichtmicroscopie en PAFP's gebruikt om de omloopsnelheid van het aggregatiegevoelige eiwit huntingtine (HTT) in vivo bloot te leggen in een C. elegans-model van neurodegeneratieve ziekte.

Het hier beschreven protocol kwantificeert de stabiliteit en afbraak van het fusie-eiwit huntingtine-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 is een monomerieke PAFP⁴ van de tweede generatie die zijn emissie/excitatiespectra onomkeerbaar schakelt van groen naar rood in reactie op UV of zichtbaar blauw licht, met een toename van de intensiteit tot 4.000-voudig^5,6. Huntingtine is het eiwit dat verantwoordelijk is voor het veroorzaken van de ZvH, een fatale erfelijke neurodegeneratieve aandoening. Huntingtine exon-1 bevat een stuk glutamines (CAG, Q). Wanneer het eiwit wordt uitgedrukt met meer dan 39Q, het misfolds in een mutant, giftig en pathogene eiwit. Mutant HTT is gevoelig voor aggregatie en leidt tot neuronale celdood en degeneratie, hetzij als korte oligomerische soorten of als grotere zeer gestructureerde amyloïden⁷.

De nematode is een modelsysteem voor het bestuderen van veroudering en neurodegeneratie dankzij het gemak van manipulatie, isogene aard, korte levensduur, en de optische transparantie⁸. Om de stabiliteit van HTT in vivo te bestuderen, werd een fusieconstructie uitgedrukt in het zenuwstelsel van C. elegans. Een HTT-D2 transgene met ofwel een fysiologische stretch van 25Qs (HTTQ25-D2) of een pathologisch traject van 97Qs (HTTQ97-D2) is overexpressed pan-neuronally gedurende de levensduur van de nematode⁹. Door live C. elegans te onderwerpen aan een kort en gefocust lichtpunt, wordt een enkel neuron gefotoswitcheerd en wordt de omgebouwde HTT-D2 in de loop van de tijd bijgehouden. Om de hoeveelheid HTT-D2 te laten afnemen, wordt het verschil tussen het rode signaal van de vers omgebouwde HTT-D2 vergeleken met het resterende rode signaal van HTT-D2 na een bepaalde periode. Daarom wordt het mogelijk om te onderzoeken hoe huntingtine wordt afgebroken wanneer het in zijn uitgebreide en toxische vorm wordt gevonden in vergelijking met zijn fysiologische vorm; hoe anterie of achterste neuronen anders reageren op de aanwezigheid van Q97 versus Q25, vooral over langere perioden; en hoe de ineenstorting van het proteostasenetwerk (PN) tijdens de vergrijzing bijdraagt aan de verschillen in degradatiepercentages. Deze resultaten beschrijven slechts een kleine reeks opmerkingen over de omzet van HTT-D2. Echter, veel meer biologische vragen die relevant zijn voor zowel het gebied van eiwit aggregatie en proteostase kan worden aangepakt met deze in vivo toepassing.

Protocol

1. Generatie van C. elegans die neuronale Huntingtine-Dendra2 fusie-eiwit uitdrukken

1. Kloon het gen dat de POI codeert in een nematode expressievector (d.w.z. pPD95_75, Addgene #1494), door traditionele restrictie enzymvertaet¹⁰, Gibson assemblage¹¹, of een methode van keuze. Plaats een promotor om expressie te stimuleren in een gewenst weefsel of in een gewenste ontwikkelingsfase. Plaats de Dendra2 fluorofophore n- of C-terminaal in frame met de POI.
2. Het genereren van transgene C. elegans die de fusieconstructie uitdrukken (bijvoorbeeld via microinjectie)¹².
   LET OP: De plasmide die het transgene draagt, blijft als een extrachromosomale array. Integratie van de constructie is niet nodig, maar kan indien gewenst worden uitgevoerd¹³. In dit protocol, C. elegans werden microinjected met een plasmide die de fusie constructie huntingtine exon 1-Dendra2 (HTT-D2) onder de controle van de pan-neuronale promotor Prgef-1. De C. elegans expressie ruggengraat werd verkregen uit Kreis et al.¹⁴, de huntingtine exon 1 met Q25 of Q97 werd verkregen uit Juenemann et al.¹⁵, en Dendra2 werd verkregen uit Hamer et al.¹⁶.

2. Leeftijdsmatching en onderhoud van C. elegans

1. Leeftijd komen overeen met alle aaltjes door te synchroniseren met alkalische hypochloriet oplossing behandeling¹⁷ of via ei leggen voor 4 uur bij 20 °C. Voor het leggen van eieren, plaats 10 gravid volwassenen op een vers gezaaide nematode groei media (NGM) plaat en laat voor 4 uur voor het verwijderen. De eieren gelegd in deze tijdspanne zal aanleiding geven tot gesynchroniseerde aaltjes.
2. Houd experimentele C. elegans op nematode groei media (NGM) platen gezaaid met de bacteriële voedselbron E. coli OP50, volgens standaard nematode veeteelt¹⁸.
3. Kweek aaltjes bij 20 °C naar het gewenste stadium. Voor dit protocol zijn de vereiste leeftijden dagen 4 en 10.
   OPMERKING: Jongvolwassenen op dag 4 kunnen worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van eieren in hunlieren en hun hoge mobiliteit. Leeftijd dag 10 aaltjes zijn post-vruchtbaar, en ondergaan weefsel verslechtering en locomotief daling¹⁹.
4. Voor dag 10 nematoden, passage dagelijks na de L4 fase op dag 3, zodra nematoden vruchtbaar zijn, om een gemengde bevolking te voorkomen.

3. Voorbereiding van microscopieglijbanen voor beeldvorming

1. Bereid de microscopieglijbanen voor op de dag van de beeldvorming. In een magnetron, smelt algemene rang agarose bij een concentratie van 3% (w / v) in ddH₂O. Laat iets afkoelen.
2. Snijd de punt van een 1 mL pipetpunt en aspiraat ongeveer 400 μL gesmolten agarose. Plaats voorzichtig een paar druppels agarose op een schone glazen glijbaan en plaats onmiddellijk een andere dia op de top, ervoor te zorgen dat een dunne pad van agarose wordt gemaakt tussen de twee. Laat drogen voordat u de bovenkant voorzichtig schuift of optilt.
3. Plaats de agarose pad glijbanen in een bevochtigde container om te voorkomen dat ze uitdrogen. Deze kunnen binnen 2-3 uur worden gebruikt.
   OPMERKING: Vermijd vorming van kleine belletjes in de agarose, omdat de aaltjes erin kunnen worden opgesloten.

4. Definitie van confocale microscoopparameters

OPMERKING: Definieer alle instellingen op de confocale acquisitiesoftware voordat u de aaltjes en gegevensverwerving monteert. De instellingen kunnen worden aangepast aan de imaging hardware en software van keuze.

1. Open de confocale software en definieer de laserbeeldvormingsinstellingen. Stel het lichtpad in voor excitatie/emissie voor groene Dendra2 op 486-553 nm en voor rode Dendra2 op 580-740 nm. Pas het vermogen en de winst van beide kanalen/lasers aan op basis van de intensiteit van de fluorofoof. Verander de digitale versterking of offset niet en stel het gaatje zo volledig open.
2. Definieer de acquisitie-instelling: selecteer een sequentiële kanaalmodus en schakel van spoor over elk frame. Stel de scanmodus in als frame en de framegrootte op 1.024 x 1.024, met een regelstap van 1. Stel het middeling in op 2 en gemiddeld met gemiddelde methode en wijze van unidirectionele lijn. Stel de bitdiepte in op 8 bits.
3. Definieer de instellingen voor multidimensionale acquisities voor de conversie van Dendra2. Voor conversie en bleken gebruik maken van de 405 nm diode laser ingesteld op 60% energievermogen. Activeer indien beschikbaar de veilige blekende GaAsP om de detectoren te beschermen.
4. Selecteer een tijdreeks van twee cycli, met een interval van 0,0 ms ertussen en een normale start en stop. Begin met bleken na scan 1 van 2 en herhaal voor 30 iteraties. Stop met bleken wanneer de intensiteit daalt tot 50%.
5. Definieer de snelheid van acquisitie/pixelbewoning zo snel (bijvoorbeeld maximaal = 12) voor conversie en gemiddelde snelheid (bijvoorbeeld medium = 5) voor het vastleggen van een snap-afbeelding.
   OPMERKING: De hier gedefinieerde bleekparameters zijn richtlijnen. Voor andere Dendra2-getagde POI's moeten de laserkrachtinstellingen en het bleken van iteraties en waarden empirisch worden vastgesteld.

5. Montage van C. elegans op microscopieglijbanen

OPMERKING: Plaats indien mogelijk een stereomicroscoop die in de montage dicht bij de confocale microscoopopstelling staat en monteer de aaltjes vlak voor beeldvorming.

1. Op de glazen deksel schuif aan de andere kant van de agarose pad, teken een venster met vier vierkanten met een permanente marker en nummer ze.
2. Pipet 15 μL levamisole in het midden van het agarosepad. De concentratie levamisole zal variëren afhankelijk van de leeftijd van de nematode: Bij beeldvorming dag 4 aaltjes gebruiken 2 mM levamisole; bij beeldvorming dag 10 aaltjes gebruiken 0,5 mM levamisole.
3. Breng vier aaltjes in de vloeistof met behulp van een draad te halen. Met behulp van een wimper pick, voorzichtig bewegen elke individuele aaltje naar een venster vierkant. Draai de wimper zodat elk spoor van E. coli OP50 wordt verdund en de fluorescerende achtergrond niet interfereert met signaalverwerving.
4. Wacht tot de aaltjes bijna stoppen met bewegen en plaats voorzichtig een afdekkingslip bovenop de vloeistof om de aaltjes in de laag levamisole tussen het agarosepad en de afdekslip te immobiliseren.
5. Plaats de omgekeerde dia op het confocale stadium om de aaltjes in beeld te brengen.

6. Conversie van groene Dendra2: Data-acquisitie op tijd nul

OPMERKING: De puls-chase experimenten beginnen met het onomkeerbaar omzetten van de Dendra2 fusie-eiwit van een groene emitterende fluorofofoër naar een rode.

1. Met behulp van het oculair van de microscoop, zoek de eerste nematode met een 20x doelstelling onder groene fluorescentie. Focus op de kop of staart en schakel over naar confocale modus.
2. Start live laserscanning met de 488 nm blauwe laser om de groene Dendra2 in het EGFP groene kanaal te visualiseren (ex/em = 486-553 nm). Selecteer een enkel neuron en breng het in beeld. Zoom 3x in en verhoog het doel van de laserstraal⁴.
   OPMERKING: Selecteer één neuron per nematode. Elk neuron vormt één monster of gegevenspunt.
3. Zoek het maximale projectievlak en verhoog of verlaag, afhankelijk van de helderheid van de fluorofofoof, de versterking of laserkracht om een verzadigd maar niet overbelicht beeld te verkrijgen dat herkenbaar is aan de kleurbereikindicator. Zodra dit is gedefinieerd, stopt u het scannen.
   LET OP: Bestraal het monster niet te lang of met te veel vermogen, want excitatie met zichtbaar blauw 488 nm-licht kan Dendra2 ook omzetten, zij het langzaam en minder efficiënt⁴.
4. Open in de software het tabblad om de regio's van belang (ROI's) te selecteren en een eerste ROI rond het geselecteerde neuron te maken. Definieer een grotere tweede interesseregio die het hoofd van de nematode omvat en inclusief de eerste ROI.
5. Selecteer in de kleurinstellingen voor de eerste ROI die moet worden verworven, gebleekt en geanalyseerd. Selecteer voor de tweede ROI die moet worden verworven en geanalyseerd, maar niet gebleekt.
6. Stel de scansnelheid in op maximaal (d.w.z. snelle pixeldwell) en start het experiment om de geselecteerde Dendra2-neuronen om te zetten.
   OPMERKING: Zodra het experiment is uitgevoerd, resulteert de verkregen afbeelding in twee afbeeldingen: één voor en één na conversie. Voor het groene kanaal moet het eerste beeld een hoger groen signaal hebben dat in het tweede beeld afneemt als gevolg van de omzetting van de groene Dendra2. Voor het rode kanaal moet de eerste afbeelding negatief zijn en geen signaal weergeven, met een rood signaal dat in de after conversion-afbeelding verschijnt. Als het groene signaal niet afneemt, is de conversie niet uitgevoerd en moeten de instellingen, zoals de 405-laserkracht of het aantal iteraties, worden gewijzigd. Als er een rood signaal in het eerste beeld, dan is de 488 nm laservermogen gebruikt was te hoog en een deel van de groene Dendra2 was al omgezet in rood. In dit geval moet een nieuw neuron/nematode worden geselecteerd.
7. Direct na conversie start live scannen met de groene 561 nm laser om Dendra2 te visualiseren in het rode kanaal (ex/em = 580-740 nm). Zoek de focus en de respectieve maximale projectie van het geconverteerde neuron met behulp van het bereik kleurindicator om overbelichting te voorkomen.
8. Stel de scansnelheid snel in op een lagere pixelwoningsnelheid (bijvoorbeeld 5x) en verkrijg een momentopname van beide kanalen met een hogere resolutie. Deze afbeelding wordt gedefinieerd als timepoint zero (T0) na conversie.
   OPMERKING: De snelheid van acquisitie voor de geconverteerde afbeelding kan worden gevarieerd. Echter, eenmaal gekozen, deze snelheid moet constant blijven tijdens het verzamelen van gegevens.
9. Sla de scan op met een identificeerbare naam en/of getal, gevolgd door het time zero label (T0).
   OPMERKING: Het is raadzaam om ook het beeld van het conversie-experiment (stap 6.6) op te slaan om het ontbreken van rood signaal voor conversie en het uiterlijk daarna te illustreren.

7. Beeldvorming van omgezette rode Dendra2 voor gegevensverwerving op een geselecteerd tweede keerpunt

1. Om Dendra2-degradatie na verloop van tijd bij te houden, definieert u een tweede timepoint om dezelfde aalematode/neuron opnieuw teimen. Selecteer het tweede timepoint experimenteel om een relevante biologische vraag aan te pakken. Voor het protocol hier beschreven, Dendra2 is afgebeeld zowel op 2 uur (T2) en 24 uur (T24) na conversie.
   1. Op het geselecteerde momentpunt, vind dezelfde nematode / neuron met het gebruik van het oculair en rode fluorescentie.
   2. Open de T0-afbeelding van de desbetreffende nematode/neuron en herlaad/hergebruik de afbeeldingsinstellingen. Zorg ervoor dat de acquisitie-instellingen van de momentopname precies hetzelfde zijn bij het verkrijgen van de T0-, T2- en T24-beelden.
   3. Het scannen van live in het rode kanaal, breng de omgezet rode neuron in focus. Omdat de rode Dendra2 na verloop van tijd degradeert, zal de bereikindicator een minder intense maximale projectie laten zien. Wijzig geen acquisitieparameters en verkrijg een momentopname met dezelfde snelheid (bijvoorbeeld 5x) als de eerste afbeelding.
2. Om de degradatie van Dendra2 na 4 uur of langer bij te houden, red je de aaltjes na de omzetting.
   1. Verwijder de dia onmiddellijk na het converteren en imaging van de vier aaltjes. Verwijder voorzichtig de coverslip en met behulp van een draad pick, til elke nematode uit de agarose pad.
   2. Plaats elke nematode afzonderlijk op een op de juiste wijze geëtiketteerde en identificeerbare NGM-plaat.
   3. Voor de tweede keer punt, monteer de nematode opnieuw op een verse agarose pad en ga verder met de beeldvorming van de omgebouwde rode Dendra2 volgens de instructies in sectie 6.

8. Beeldanalyse van omgerekend Dendra2

OPMERKING: Analyse van de afbraak van Dendra2 wordt uitgevoerd met Fiji / ImageJ software²⁰.

1. Open Fiji en sleep en zet het .lsm-bestand in de Fiji-balk. Open de T0-afbeelding die net na de conversie is genomen en de afbeelding van dezelfde nematode die is genomen op het geselecteerde tijdstip na conversie (T2 of T24 h).
   OPMERKING: Om de afbraak van het eiwit van belang gefuseerd naar Dendra2 te volgen, hoeft alleen het rode kanaal te worden geanalyseerd.
2. De meetparameters in het menu bepalen: Analyseren | Metingen instellen. Selecteer de functies Area en Integrated Density.
3. Selecteer de afbeelding verkregen met het rode kanaal. Selecteer het selectiegereedschap Veelhoeken in de fiji-balk.
4. Identificeer het geconverteerde neuron op de T0-afbeelding en teken er een ROI omheen met behulp van het selectiegereedschap.
   1. Als u de contouren van het neuron goed wilt identificeren, markeert u de intensiteitsdrempels door te selecteren in de balkAfbeelding | Aanpassen | Drempelwaarde. Sleep de balkcursor om de drempelwaarde af te bakenen en volg rond dit gebied met het gereedschap veelhoek. Om een nauwkeurige ROI te genereren, is het ook mogelijk om de contour van het geselecteerde neuron uit het groene kanaal te gebruiken.
5. Zodra de selectie is gemaakt in het rode kanaal venster, druk op Analyseren | Meten. Er verschijnt een pop-upvenster met de naam Resultaten en bevat de ROI-waarden voor Area, IntDenen RawIntDen.
6. Voer hetzelfde selectie- en metingsproces uit voor de afbeelding van het tweede tijdspunt (T2 of T24 h).
7. Kopieer de verkregen waarden in een spreadsheetsoftware, waarbij u ervoor zorgt dat de waarden op T0 na conversie en op T2 of T24 na conversie op de juiste manier worden geregistreerd.

9. Berekening van de verhouding van dendra2 degradatie

1. Om de verhouding van de afbraak te berekenen, wijst u eerst een waarde van 1 (of 100%) toe om de degradatie van tijdpunt nul (d.w.z. net na omzetting, wanneer alle rode omgezet Dendra2 nog aanwezig is) te timen. Dit vloeit voort uit het zelf verdelen van de waarde van IntRawDen van T0.
2. Om de vermindering van het rode Dendra2 intensiteitssignaal in de loop van de tijd en de degradatie te berekenen, deelt u de waarde van RawIntDen van het tweede tijdspunt (bijvoorbeeld T2 of T24 h) door de waarde van de RawIntDen van T0. Het resulterende aantal moet kleiner zijn dan 1. Deze waarden kunnen ook worden uitgedrukt als percentages, die T0 definiëren als 100%.
3. Herhaal sectie 7 voor elke omgezet aaltje. Voor een grafische weergave van de afbraak van Dendra2, grafiek een spreiding plot of staafgrafiek met het percentage of de verhouding waarden van fluorescentie daling verkregen in de y-as. Pas een gewenste statistische analyse toe en illustreer deze op de grafiek.

Representative Results

Twee nematodestammen die het huntingtine exon-1 eiwitfragment in frame met het fotoconvertible eiwit Dendra2 uitdrukken, werden verkregen via micro-injectie en de plasmiden werden bewaard als een extrachromosomale array. De fusieconstructie werd uitgedrukt in het hele C. elegans zenuwstelsel van ontwikkeling tijdens de veroudering. Hier bevatte HTT-D2 ofwel de fysiologische 25 polyglutamine stretch (HTTQ25-D2, Figuur 1A) of een volledig penetrante en pathogene herhaling met 97 glutamines (HTTQ97-D2, figuur 1B). Aanvankelijk werd het fusie-eiwit getest om ervoor te zorgen dat het veranderde van zijn groene spectrum naar zijn rode spectrum bij UV-bestraling. HTT-D2 is met succes uitsluitend binnen het verlichte gebied van groen naar rood overgestapt. Volgens de kracht en iteraties van de UV-puls, en afhankelijk van het z-vlak en de penetrantie van de laserstraal door de cuticula van de nematode, werd een bepaald deel van HTT-D2 omgezet, maar niet alle. Een rood signaal verscheen in de fotogeconverteerde neuronen, colocaliseren met de groene niet-geconverteerde HTT-D2(figuur 1C, D). Door de nauwkeurigheid van de laser scanning foton stralen was het mogelijk om een nauwkeurige ROI die overeenkomt met een enkel neuron om te zetten. Vóór de conversie was er geen rood signaal zichtbaar toen het monster werd opgewekt in het rode kanaal(figuur 2A). Bij UV-bestraling nam het groene signaal af naarmate HTT-D2 werd omgezet en er eindelijk een rood signaal verscheen(figuur 2B). HTT-D2 werd vervolgens afgebroken na verloop van tijd, wat resulteerde in een vermindering van de niveaus van rode HTT-D2 (figuur 2C) en een mogelijke toename van het groene HTT-D2-signaal, omdat er meer fusie-eiwit nieuw werd gesynthetiseerd. Omdat een significante daling al aanwezig was om 2 uur na conversie, werd dit interval voor het detecteren en kwantificeren van de afbraak van HTT-D2 gehandhaafd. Het is belangrijk op te merken dat degradatie niet het enige proces is dat kan optreden na conversie van HTT-D2. Omgerekend HTT-D2 kan worden verhandeld en vervoerd langs axonen, wat resulteert in een daling van het rode signaal niet als gevolg van klaring. Echter, met de instellingen die hier en over de korte tijdspanne van 2 uur, geen verspreiding van het rode signaal werd waargenomen, mogelijk te wijten aan het feit dat kleine HTT-D2 werd verplaatst van de soma naar de axon. Bovendien hielp het omzetten en imaging van een enkele hele neuronale soma de effecten van HTT-D2-diffusie binnen hetzelfde neuron uit te sluiten, omdat alle cellulaire compartimenten gelijktijdig werden geanalyseerd. Om zowel diffusie als transport/handel te bestuderen is het raadzaam om snelle en hogere vergrotingsbeelden te verkrijgen en een kleinere en mogelijk meer motile fractie van het eiwit van belang te volgen. Het is ook belangrijk op te merken dat binnen een reeks experimenten, elk dier één biologische herhaling vertegenwoordigde. Slechts één neuron per nematode werd afgebeeld, elk dier werd één keer per sessie afgebeeld en de beeldvorming vond plaats gedurende drie sessies, wat technische herhalingen vormde. De drie sessies vereisten dat de dieren voor elk experiment voor elk experiment op verse platen moesten worden gesynchroniseerd, hetzij op dag 4 of dag 10, zodat de aaltjes van het milieu kunnen worden gesynchroniseerd. Drie sessies houden ook rekening met elke variabiliteit die voortvloeit uit de ingestelde beeldvorming (bijvoorbeeld het laservermogen varieert door een andere temperatuur tussen experimenten). Alle biologische replica's die tijdens de drie sessies werden verkregen (minimaal 20 dieren) werden beschouwd als individuele monsters en werden gebruikt om statistische significantie vast te stellen.

Nadat werd bevestigd dat beide HTT-D2-stammen van C. elegans effectief waren en de optimale conversieparameters hadden vastgesteld, werden de verschillen tussen de omzet van een ziekteverwekkende HTT-D2-eiwit (d.w.z. HTTQ97-D2) onderzocht ten opzichte van de fysiologisch relevante controle (HTTQ25-D2). Ten eerste werd de afbraak van HTT-D2 in verschillende neuronen waargenomen(figuur 3). Het is bekend dat subtypes van neuronen binnen het zenuwstelsel van de nematode variëren in hun metabole activiteit en morfologie²¹, mogelijk het maken van een verschil in de afbraak en het opnieuw in evenwicht brengen van het proteoom. De neuronen van het staartgebied werden vergeleken met die van het hoofd en bleken aanzienlijk actiever te zijn(figuur 3A). Deze bevinding gold alleen voor HTTQ25-D2 en niet voor pathogene HTTQ97-D2, wat suggereert dat de PN niet in staat was htt-D2 te verwijderen met langere glutamine rekt zich door het hele zenuwstelsel(figuur 3B).

Om verder te bevestigen dat het modelsysteem zich zoals verwacht gedroeg, werden conversie-experimenten uitgevoerd over een langere periode, waardoor de afbraaktrajecten van de cellen het eiwit van belang bijna volledig konden elimineren(figuur 4). Inderdaad, er was aanzienlijk meer afbraak van de controle HTTQ25-D2 24 uur na conversie dan na 2 uur in het hoofd neuronen, en uitgebreid meer in de staart neuronen (Figuur 4A). Nogmaals, de achterste staart neuronen meer actief verwijderd rode HTT-D2, zelfs over een verhoogde tijdspanne. Een soortgelijke trend werd gedetecteerd voor de ziekteverwekkende HTTQ97-D2, met een zeer lichte vermindering van het rode HTT-D2-signaal over 24 uur. De HTTQ97-D2 werd echter niet zo gemakkelijk verwijderd als HTTQ25-D2, vooral na 24 uur. Het kan zijn dat alleen de oplosbare HTTQ97-D2 fractie efficiënt wordt afgebroken, goed voor de aanvankelijke vermindering van het rode signaal en de verdere milde daling in de tijd. Belangrijk is dat er na 24 uur twee populaties neuronen waren: een met een hogere degradatiesnelheid en een waarbij het rode HTT-D2-signaal helemaal niet werd afgebroken of mogelijk zelfs is toegenomen(figuur 4B). Verhoogd en stabiel signaal vertegenwoordigt mogelijk reeds geaggregeerde of continu aggregerende soorten die aanzienlijk moeilijker uit de cellen te verwijderen waren vanwege hun strak verpakte amyloïde aard. Deze insluitsels, die uitsluitend aanwezig zijn wanneer glutamine zich uitstrekt over de 40-herhalingsdrempel en die microscopisch als foci verschenen, zijn verondersteld zich te accumuleren als deposito's die niet gemakkelijk kunnen worden verwijderd²². Het is ook mogelijk dat een toename van het rode fluorescerende signaal een artefact was als gevolg van technische problemen (bijvoorbeeld het gebruik van verkeerde acquisitieparameters, sub-par prestaties van de microscopie-setup of een foutief herstel/montageproces). Bij het verkrijgen van beelden over langere perioden moet rekening worden gehouden met deze variabelen.

Ten slotte, omdat neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ZvH zich manifesteren in het volwassen leven, werd het effect van veroudering op de snelheid van HTT-D2 afbraak waargenomen. Conversie-experimenten werden uitgevoerd in de kop- en staartgebieden van jonge (dag 4) versus oude (dag 10) aaltjes in beide HTT-D2-stammen(figuur 5). Voor de hoofdneuronen was er geen significante verandering in de mate van afbraak als gevolg van veroudering binnen de levensduur van zowel HTTQ25-D2 als HTTQ97-D2, mogelijk omdat HTT-D2 gedurende het hele leven van elke nematode gelijk werd verwijderd. Er werd echter een zeer belangrijke verandering geregistreerd bij het vergelijken van oude aaltjes die ofwel een pathologische of een fysiologische glutamine-rek bevatten. HTTQ97-D2 werd niet zo efficiënt afgebroken als HTTQ25-D2, waarbij het onvermogen van de PN om geaggregeerde en mogelijk giftige soorten huntingtine in oudere aaltjes te verwijderen (figuur 5A) benadrukte. Nogmaals, een meer actieve en significante omzet in de staart neuronen werd waargenomen. Net als in de hoofdneuronen werd een robuustere omzet van HTTQ25-D2 niet waargenomen in de staartneuronen van jonge aaltjes in vergelijking met het oudere cohort, en de afbraak was gelijk op dag 4 en dag 10. Omgekeerd verschenen er significante veranderingen in afbraakpercentages tussen de controle en de pathogene HTT-D2-stammen in jonge dag 4-aaltjes, die op dag 10 nog belangrijker werden. Belangrijk is dat staartneuronen in staat waren om te gaan met giftige HTTQ97-D2 bij jonge aaltjes, wat illustreert dat verschillende gelijktijdige PN-mechanismen aan het werk zouden kunnen zijn om HTT-D2(figuur 5B)te verwijderen. Over het geheel genomen nam de PN-activiteit in de loop van de tijd af, mogelijk als gevolg van schadelijke effecten veroorzaakt door zowel veroudering als de aanwezigheid van aggregaten.

Figuur 1: C. elegans uitgedrukt huntingtine exon-1 gefuseerd tot Dendra2 in het zenuwstelsel. (A) Jong, dag 4 C. elegans pan-neuronaal uitdrukken huntingtine exon-1 met 25 glutamines, gesmolten tot Dendra2 in zijn onbekeerde groene excitatie / emissie staat. Schaalbalk = 100 μm. Insets tonen een vergroot beeld van de kop (boven) en de staart (onder) neuronen. Inzetschaalbalk = 10 μm. (B) Jong, dag 4 C. elegans pan-neuronaal uitdrukken huntingtine exon-1 met 97 glutamines, gesmolten tot Dendra2 in zijn onvervormde groene excitatie / emissie staat. Schaalbalk = 100 μm. Insets tonen een vergroot beeld van de staart (boven) en het hoofd (onder) neuronen, en het hoofd van een dag 7 nematode (uiterst rechts). Inzetschaalbalk = 10 μm. Witte pijlpunten wijzen naar HTTQ97-D2 foci, met huntingtine aggregaten. (C) Kanaal samenvoegen afbeelding van HTTQ25-D2 met conversie van het hoofdgebied. Box vertegenwoordigt het gedeelte van de hele C. elegans dat is UV-bestraald. Schaalbalk = 100 μm. Inset toont de Dendra2-emissie op 488 nm (boven, groen) en de op 561 nm (onder, rood). Schaalbalk = 10 μm.(D)Kanaalsamenvoegingsafbeelding van HTTQ97-D2 met conversie van het hoofdgebied. Schaalbalk = 100 μm. Vak vertegenwoordigt het gedeelte van de gehele C. elegans dat UV-bestraald is. Inzet toont de Dendra2-emissie op 488 nm (boven, groen) en de op 561 nm (onder, rood). Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Omgerekend rode HTT-D2 daalde na verloop van tijd in enkele neuronen. Staartneuronen van HTTQ25-D2. Twee neuronen worden gelijktijdig en onafhankelijk fotoconverteerd getoond. Afbeeldingen tonen achtereenvolgens drie tijdstippen: (A) Vóór bestraling (voor), (B) onmiddellijk na bestraling (conversie), en (C) 2 uur na bestraling (na). Bovenste paneel (groene kanaal) vertegenwoordigt HTT-D2 signaal verzameld op 486-553 nm excitatie / emissie. Het witte gebied van belang beschrijft de neuronen die zijn bestraald. Het middelste paneel (rood kanaal) toont het omgebouwde HTT-D2 signaal verzameld op 580-740 nm excitatie/emissie. Het onderste paneel is een samenvoeging van de twee kanalen. Schaalbalk = 5 μm voor alle afbeeldingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Kop- en staartneuronen vertoonden verschillende afbraakpercentages. Kolombalkgrafieken tonen het percentage rode intensiteit ten opzichte van de initiële waarde op het moment van conversie (d.w.z. 100%). Omgezet rood Dendra2 signaal daalde in het algemeen over de 2 uur interval als HTT-D2 werd afgebroken binnen de neuronen van C. elegans. Binnen het zenuwstelsel van de nematode vertoonden neuronale subtypes verschillende afbraakpercentages, waarbij staartneuronen een actievere omzet vertoonden, maar alleen bij aaltjes die een niet-pathogene polyglutamine-stretch dragen. (A) Kwantificering van afbraak in HTTQ25-D2 kop versus staart neuronen. Gemiddelde ± SD, ongepaarde twee-tailed Student's t-test. N = 23-28 samples/nematoden per regio, *P < 0,05. (B) Kwantificering van afbraak in HTTQ97-D2 kop versus staart neuronen. Gemiddelde ± SD, ongepaarde twee-tailed Student's t-test. N = 23-28 monsters/nematoden afgebeeld per regio, ns = niet-significant. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: HTTQ97-D2 werd na 24 uur niet significant geklaard. Kolombalkgrafieken tonen het percentage rode intensiteit ten opzichte van de initiële waarde op het moment van conversie (d.w.z. 100%). Omgezet rood Dendra2 signaal afgenomen als HTT-D2 werd afgebroken binnen de neuronen van C. elegans. HTT-D2 vertoonde verschillende degradatiepercentages. Zelfs over langere perioden na de omzetting kon pathogene HTT-D2 niet worden verwijderd in vergelijking met de gezonde controle. (A) Kwantificering van de mate van afbraak in HTTQ25-D2 op twee tijdstippen na conversie (2 uur en 24 h) in zowel kop- als staartneuronen. Gemiddelde ± SD, eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA). N = 21-28 samples/nematoden afgebeeld per tijd/regio, *P < 0,05, ****P < 0,0001. (B) Kwantificering van de mate van afbraak in HTTQ97-D2 op twee tijdstippen na conversie (2 uur en 24 h) in zowel kop- als staartneuronen. Gemiddelde ± SD, eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA), gevolgd door Tukey's Multiple Comparison post hoc test.  N = 21-28 monsters/nematoden afgebeeld per tijd/regio, ns = niet-significant. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Oude en jonge aaltjes die de pathogene HTT-D2 uitdrukken, hebben het niet efficiënt afgebroken. Kolombalkgrafieken tonen het percentage rode intensiteit ten opzichte van de initiële waarde op het moment van conversie (d.w.z. 100%). Omgezet rood Dendra2 signaal afgenomen als HTT-D2 werd afgebroken binnen de neuronen. Naarmate de nematode ouder was, werd zijn vermogen om pathogene HTT-D2 te degraderen bovendien aangetast in het hele zenuwstelsel. (A) Kwantificering van de mate van afbraak in de hoofdneuronen van jonge (dag 4) en oude (dag 10) HTTQ25-D2 nematoden in vergelijking met leeftijdsgede kommen. Gemiddelde ± SD, eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA). N = 23-28 monsters/nematoden afgebeeld per stam/dag, ****P < 0,0001. (B) Snelheid van afbraak 2 uur na omzetting in de staartneuronen van jonge (dag 4) en oude (dag 10) HTTQ25-D2 nematoden, vergeleken met oudergaande HTTQ97-D2-aematoden. Gemiddelde ± SD, eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA), gevolgd door Tukey's Multiple Comparison post hoc test. N = 23-28 samples/nematoden afgebeeld per stam/dag, *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Om de functie van een eiwit te begrijpen is het belangrijk om de synthese, locatie en afbraak ervan te begrijpen. Met de ontwikkeling van nieuwe, stabiele en heldere FPs is het visualiseren en monitoren van POI's eenvoudiger en efficiënter geworden. Genetisch uitgedrukte fusieps zoals Dendra2 zijn uniek gepositioneerd om de stabiliteit van een POI te bestuderen. Bij blootstelling aan paars-blauw licht breekt Dendra2 op een precieze locatie binnen een triade van geconserveerde aminozuren. De fluorofophore ondergaat een kleine structurele verandering, wat resulteert in een volledige verschuiving van spectra van groen naar rood²³. Deze verschuiving maakt het mogelijk om alle POI's die gekoppeld zijn aan Dendra2 op te sporen en te monitoren. Inderdaad, deze fusie constructies werden voor het eerst gebruikt om een C. elegans reporter stam te creëren om de ubiquitine-proteasoom systeem in vivo¹⁶te bestuderen. Dendra2 werd ook gebruikt om de kwetsbaarheid van selectieve neuronale subtypes en hun vermogen om te gaan met uitgebreide polyglutamine eiwitten²⁴te begrijpen, of de inductie van autofagie in modellen van motorneuronziekte²⁵te controleren.

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de afbraak van huntingtine, een ziektegerelateerd aggregatiegevoelig eiwit op een niet-invasieve manier, te monitoren. Na het succesvol genereren van een neuronale C. elegans model van de ZvH, het uitdrukken van HTT-D2 pan-neuronaal, werden de gradatiesnelheden van uitgebreide en pathogene HTT in vergelijking met zijn fysiologische tegenhanger gekwantificeerd. Opvallende verschillen werden waargenomen tussen neuronale subtypes, tussen jonge en oude aaltjes, en tussen het vermogen van de PN om in de loop van de tijd met giftige glutamineladingen om te gaan. Deze techniek kan ook worden toegepast om de locatie en beweging van huntingtine te volgen, evenals het lot ervan wanneer verstoringen van het PN worden geïntroduceerd. siRNA knockdown van belangrijke chaperonnes of toediening van verbindingen die proteasoomactiviteit remmen, kan de functie en het belang van deze componenten in aggregatiegevoelige eiwitten blootleggen: bijvoorbeeld of de PN specifieke knooppunten activeert om tekortkomingen te compenseren²⁶. Het kan ook verklaren de schadelijke effecten veroorzaakt door een ziekte in vergelijking met die van normale veroudering.

Hoewel veel verschillende vragen met deze techniek kunnen worden aangepakt, moeten, zodra een gewenst model is gegenereerd, de juiste conversie- en detectieparameters worden vastgesteld om betrouwbare gegevens te verkrijgen. Ook cruciaal is het bepalen van conversie-instellingen die het mogelijk maken voor voldoende opbrengst van geactiveerd eiwit zonder fotobleaching of fototoxiciteit en zonder ongewenste conversie. Bovendien is het voor elk bestudeerd eiwit binnen een specifiek modelsysteem, ex vivo of in vivo, noodzakelijk om experimenteel een voldoende grote termijn vast te stellen om een nauwkeurige kwantificering van het afbraakpercentage mogelijk te maken.

Dendra2 biedt een reeks voordelen ten opzichte van andere PAFP's: 1) het is monomeer en zeer helder; 2) het heeft een hoog contrast fotoconversie en een stabiele fotoconverteerd signaal; 3) het kan worden geactiveerd met een lage fototoxiciteit door een blauwe 488 nm laser, die deel uitmaakt van de meeste confocale hardware setups; 4) het rijpt efficiënt bij 37 °C voor toepassing in zoogdiercellen; 5) het heeft geen toxische bijwerkingen wanneer uitgedrukt voor langere tijd^23,27; en 6) het systeem wordt niet beïnvloed door variaties in expressieniveaus tussen of binnen een organisme of cel, aangezien alleen de verhouding van het Dendra2-signaal voor en na de conversie wordt gekwantificeerd. Alle genoemde eigenschappen maken Dendra2 een ideale fluorofoër voor het bijhouden van eiwitdynamica in real time en het monitoren van het lot van cellen.

Helaas hebben Dendra2-fusieeiwitten last van enkele veel voorkomende beperkingen van fluorescerende eiwitetikettering. De constructie is een chimerische soort die vaak experimenteel overexpressed is in biologische systemen, hoewel endogene expressie kan worden vastgesteld via genomische techniek. De mate van afbraak van Dendra2 zelf beïnvloedt mogelijk de afbraak van het doeleiwit, hoewel het is beschreven als een zeer stabiel, langlevend eiwit²⁷. Bovendien is Dendra2 niet geschikt om eiwitten met een zeer snelle omzet te volgen, omdat het misschien geen tijd heeft voor een eigen rijping. Ten slotte hebben 405 nm-lasers, die ongewoon zijn, de voorkeur voor efficiënte fotoswitching, hoewel ze giftiger zijn voor het monster. Inderdaad, minder fototoxisch blauw licht kan worden gebruikt om zowel visualiseren groene Dendra2 en converteren wanneer laservermogen is op hoge intensiteit. Deze specifieke functie moet altijd in gedachten worden gehouden, omdat langdurige blootstelling ongewenste conversie en mogelijk verkeerde metingen zal opleveren. Ten slotte kan het problematisch zijn om Dendra2 te gebruiken in combinatie met groene of rode fluoroforen. Er zijn echter veel verschillende PAFP's beschikbaar om de dynamiek van verschillende eiwitten tegelijkertijd te onderzoeken.

Experimenten met Dendra2 en andere PAFP's zijn gekoppeld aan fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP) en radioactieve puls-chase etiketteringstechnieken. In een FRAP-instelling is het onmogelijk om eiwitten te onderscheiden die opnieuw een ROI invoeren van nieuw gevormd fluorescerend eiwit, en constante monitoring en visualisatie van het monster is noodzakelijk. Met Dendra2 worden twee duidelijk te onderscheiden populaties gegenereerd die in de loop van de tijd onafhankelijk kunnen worden waargenomen, zodat de vervangen en nieuw gesynthetiseerde "inactieve" vorm van groene Dendra2 kan worden bijgehouden en gekwantificeerd¹⁶. Dendra2 is ook een nuttige sonde in superresolutie microscopie zoals totale interne reflectie fluorescerende microscopie (TIRF)²⁸ en fotoactivatie lokalisatie microscopie (PALM)²⁹. In de nabije toekomst zullen dergelijke ontwikkelingen zorgen voor een betere lokalisatie en mogelijk single molecule tracking van een POI, waardoor meer subtiele verschillen binnen en tussen monsters te ontdekken en uiteindelijk het opleveren van nieuwe informatie over het leven en het lot van een POI binnen een biologisch systeem.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM component
Agarose, Universal Grade	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500	Mounting slide component
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM component
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27	Carl Zeiss AG		Objective
Fiji/ImageJ 1.52p	NIH		Analysis Software
Levamisole Hydrochloride	AppliChem GmbH	A4341	Anesthetic
LSM710-ConfoCor3	Carl Zeiss AG		Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope	Leica Camera AG		Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2	this paper		C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2	this paper		C. elegans strain
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50	Nematode food source
Sodium Chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM component
Standard-Objektträger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Glass slides
ZEN2010 B SP1	Carl Zeiss AG		Confocal acquisition software