本方案旨在训练一种机器学习算法，在乳腺癌骨转移的大鼠模型中，利用磁共振成像（MRI）和正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）获得的多种成像参数组合，以检测早期转移性疾病，并预测其后续进展为大转移灶的情况。
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摘要
摘要
机器学习（ML）算法能够将不同特征整合到一个模型中，以执行分类或回归任务，并实现超过其各组成部分的准确度。本方案描述了一种机器学习算法的开发过程，用于在标准成像方法尚无法观察到任何异常之前，预测大鼠模型中乳腺癌骨大转移灶的生长情况。此类算法有助于检测常规分期检查中经常被遗漏的早期转移性疾病（即微转移灶）。
所采用的转移模型具有部位特异性，即大鼠仅在其右后肢发生转移。该模型的成瘤率为60%–80%，在诱导后30天，部分动物通过磁共振成像（MRI）和正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）可观察到明显转移灶，而另一部分动物则未出现肿瘤生长。
本方案从早期获取的影像检查数据出发，描述了提取反映组织血管化的MRI特征和反映葡萄糖代谢的PET/CT特征的方法，并进一步确定用于预测大转移性疾病最关键的特征。随后，将这些特征输入模型平均神经网络（avNNet），以将动物分为两类：一类将发生转移，另一类则不会产生任何肿瘤。本方案还描述了标准诊断参数的计算方法，包括总体准确率、敏感性、特异性、阴性/阳性预测值、似然比以及受试者工作特征曲线的构建。该方案的一个优势在于其灵活性，可轻松适应训练多种不同的机器学习算法，并可任意组合无限数量的特征。此外，该方案还可用于分析肿瘤学、感染及炎症领域的不同问题。
引言
本实验方案的目的是将来自MRI和PET/CT的多个功能成像参数整合到一种模型平均神经网络（avNNet）机器学习算法中。该算法可在早期时间点预测乳腺癌骨转移大鼠模型中大转移灶的生长情况，此时骨内尚无肉眼可见的宏观变化。
在大转移灶形成之前，播散性肿瘤细胞通常会侵入骨髓，这种情况常被称为微转移性疾病1,2。这种初始侵袭可视为转移性疾病的早期阶段，但在常规分期检查中通常被遗漏3,4。尽管目前可用的影像学手段单独使用时无法检测到骨髓微侵袭，但联合反映血管化和代谢活性的多种影像参数已被证明具有更优的检测性能5。通过将不同的影像参数整合为一种机器学习算法——即 avNNet，可实现上述互补优势。此类 avNNet 能够在尚未出现可见转移灶之前，可靠地预测骨大转移灶的形成。因此，将影像生物标志物整合至 avNNet 中，可作为骨髓微侵袭及早期转移性疾病的替代参数。
为建立该实验方案，采用了一种先前报道过的裸鼠乳腺癌骨转移模型6,7,8。该模型的优势在于其部位特异性，即动物体内的骨转移病灶仅出现在右后肢。然而，该方法的成瘤率为60%–80%，因此在研究过程中有相当数量的动物不会发生任何转移。通过MRI和PET/CT等影像学手段，可在注射后第30天（PI）检测到转移灶的存在。而在较早的时间点（例如注射后第10天，PI），影像学检查尚无法区分哪些动物将发展为转移性疾病，哪些则不会（图1）。
基于本方案所述在感染后第10天获取的功能成像参数训练的平均神经网络（avNNet），可可靠地预测或排除在随后约3周内大转移灶的生长。神经网络通过不同层中的人工节点相互组合构成。在本研究方案中，骨髓血液供应和代谢活性的功能成像参数构成底层，而对恶性病变的预测则构成顶层。中间另有一层包含隐含节点，与顶层和底层均相连。在神经网络训练过程中，各节点之间连接强度会不断更新，以实现高准确度的分类任务9。通过整合多个模型的输出结果并取其平均值，可进一步提高此类神经网络的准确性，从而形成平均神经网络（avNNet）10。
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方案
所有护理和实验操作均遵循国家和地区的动物保护法律法规，所有动物实验程序均已获得德国弗兰肯地区政府批准（参考编号：55.2 DMS-2532-2-228）。
1. 在裸鼠右侧后肢诱导乳腺癌骨转移
注意：关于在裸鼠中诱导乳腺癌骨转移的详细描述已在其他文献中发表6,8。最相关的步骤如下所述。
- 在 RPMI-1640 培养基中培养 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞，添加 10% 胎牛血清（FCS）。将细胞置于标准条件下（37 °C，5% CO2）培养，每周传代 2–3 次。
- 用含 2 mM EDTA 的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤接近汇合的 MDA-MB-231 细胞，随后用 0.25% 胰蛋白酶消化使细胞脱落。使用血细胞计数板（Neubauer 计数室）测定细胞浓度，并将细胞重悬于 200 µL RPMI-1640 培养基中，浓度为 1.5 × 105 个细胞/200 µL。
- 使用 6–8 周龄的裸鼠，在无病原体、环境受控的条件下饲养（室温 21 °C ± 2 °C，湿度 60%，12 小时光照-黑暗循环）。自由提供经高压灭菌的饲料和饮水。
- 手术前，皮下注射镇痛药物（例如卡洛芬 4 mg/kg）。使用异氟烷（1–1.5 体积%）与氧气混合气体（流速 2 L/min）对大鼠进行麻醉。通过夹捏足趾检查麻醉深度。
- 手术过程中使用放大倍数为 16 倍的手术显微镜。
- 在大鼠右侧腹股沟区域做一条 2–3 cm 的切口。解剖右侧腹股沟区域的所有动脉，包括股动脉（FA）、浅表腹壁下动脉（SEA）、降膝动脉（DGA）、腘动脉（PA）和隐动脉（SA）。在股动脉（FA）上放置两个可移除的夹子：一个位于浅表腹壁下动脉（SEA）起始处近端，另一个位于降膝动脉（DGA）起始处正近端。
- 结扎浅表腹壁下动脉（SEA）的远端部分。切开 SEA 血管壁，将一根直径为 0.3 mm 的针插入 SEA。将装有步骤 1.2 中细胞悬液的注射器连接至该针头。移除 FA 上的远端夹子，改为夹闭 SA。
- 缓慢将步骤 1.2 中的 MDA-MB-231 细胞悬液（1.5 × 105 个细胞/200 µL）注入 SEA。拔出针头，结扎 SEA，并移除动脉夹子。使用外科夹关闭切口，终止麻醉。每日监测动物，评估肿瘤大小及是否存在疼痛迹象。
2. 磁共振成像（MRI）
注意：有关 MRI 操作的详细描述，请参见 Bäuerle 等人11。
- 接种后第10天使用专用实验扫描仪（见材料表）或配备合适动物线圈的人体磁共振系统进行MRI检查。
- 按照前述方法使用异氟烷（1–1.5 体积%）/氧气混合气体麻醉大鼠。在大鼠尾静脉插入导管并用胶带固定于尾巴上。连接含有对比剂的注射器（0.1 mmol/kg Gd-DTPA，约0.5 mL）。
- 将麻醉后的大鼠置于磁共振系统中。在解剖序列（例如T2加权快速自旋回波序列；TR = 8,654 ms；TE = 37 ms；矩阵 320 x 272；视野 = 65 mm x 55 mm；层厚 = 1 mm；扫描时间 11:24 min）中定位右后肢远端股骨和近端胫骨。
- 确定覆盖右后肢远端股骨和近端胫骨的层面，并启动动态对比增强MRI序列（例如快速小角度激发序列；TR = 3.9 ms；TE = 0.88 ms；矩阵 = 256 x 216；视野 = 65 x 54 mm2；层厚 = 1 mm；8层；100个时间点；扫描时间 = 8:25 min）。在开始扫描30秒后，于10 秒内开始注射对比剂。
注意：每只动物完成一次MRI检查的总时间约为20分钟。
3. 正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）
注意：有关 PET 操作的详细描述，请参见 Cheng 等人12。
- 使用专用实验扫描仪，在接种后第10天进行PET/CT成像（参见材料表）。
- 成像前保持动物禁食。按照步骤2.2所述方法麻醉大鼠，并按上述方法在尾静脉插入导管。
- 经尾静脉注射6 MBq的18F-氟脱氧葡萄糖（18F-FDG），等待约30 分钟，使示踪剂充分分布。
- 进行CT扫描（管电压 = 80 kV，管电流 = 500 µA，各向同性分辨率 = 48.9 µm，持续时间 = 10 分钟）。
- 进行静态PET扫描（能量下限/上限 = 350/650 keV；时间窗 = 3.438 ns；持续时间 = 15 分钟）。
4. 替代成像策略
- 为早期评估后肢中的 MDA-MB-231 细胞，每只后肢接种 1.5 × 105 个标记细胞/200 µL，用于生物发光成像（即表达荧光素酶的细胞，MDA-MB-231-LUC13）或荧光成像（即表达绿色或红色荧光蛋白的细胞，MDA-MB-231-GFP/RFP13）。使用临床前光学成像系统，在肿瘤细胞接种后检测骨内 MDA-MB-231 细胞14。
- 静脉注射微泡后，使用专用超声扫描仪进行实验性超声检查，以获取与磁共振成像（MRI）相当的血管化形态学和功能参数7。
5. MRI 分析
- 使用带有DCE插件15的DICOM查看器16，通过点击顶部菜单中的“导入”按钮，选择包含步骤2.4中MR图像的DICOM文件夹，然后在顶部菜单中点击“4D查看器”，以4D模式加载DCE序列。
- 在右后肢胫骨近端骨干的骨髓内放置一个目标面积为1.5 mm2的圆形二维感兴趣区域（ROI），建议使用由8幅图像组成的序列中的第4或第5幅图像，因为这些中心图像可提供更稳定的结果。
- 从顶部菜单启动DCE插件，在“绘图类型”字段中选择“相对增强”，并通过在相应字段中输入数字1至5来定义基线时间范围。使用相应的按钮将分析结果导出为.txt文件，并将文件命名为“DCEraw.txt”。
- 打开RStudio17，通过“文件”菜单选择“打开文件”来加载提供的DCE-Script.R文件。在菜单中依次选择“代码”、“运行区域”和“运行全部”，以执行整个脚本。将输出结果复制到名为“ImagingFeatures.xlsx”的模板文件中（图2）。
- 在DICOM查看器中，在动物背部肌肉内放置第二个ROI，并重复步骤5.2–5.4，以获得用于归一化的肌肉DCE测量值。在“ImagingFeatures.xlsx”电子表格中，相应的骨组织测量值将自动除以相应的肌肉测量值以实现归一化。
- 对所有动物重复步骤5.1–5.5，并完成电子表格。
6. PET/CT 分析
- 打开 PET/CT 分析软件，通过点击“文件”，然后选择“手动导入”来导入步骤 3 中获得的数据。选中 ct.img.hd 和 pet.img.hdr 文件，点击“打开”，然后选择“全部导入”。
- 选择“常规分析”，然后点击“确定”以打开数据集。
- 选择“ROI 定量分析”，然后点击“创建”，再选择“从模板创建 ROI”。在右后肢胫骨近端骨干的骨髓内放置一个约 4 mm × 6 mm 的二维 ROI。
- 选择“ROI（靶区 1 叠加）”，记录 Bq/mL 单位下的平均值、最小值和最大值。
- 计算最大标准化摄取值（SUVmax）：将最大值（Bq/mL）除以注射活性，再乘以动物体重（单位为克）。将结果填入电子表格中（图 2）。
7. 确定肿瘤成瘤率
- 为诊断右后肢肿瘤生长情况，按照上述方法在接种后第30天重复进行MR和PET/CT成像 。
注意：在接种后第30天，肿瘤将清晰可见，MRI上表现为T2加权像高信号病灶，并有明显对比增强，同时PET/CT显示SUVmax显著升高。根据以往实验结果，约60%–80%的动物将在右后肢发生转移。 - 在电子表格中新增一列“Tumor”，对出现转移的动物输入“1”，无可见肿瘤负荷的动物输入“0”（图2）。将该电子表格保存为“ImagingFeatures.xlsx”，并存入Downloads文件夹中。
8. 特征选择
- 为了确定预测未来肿瘤生长的最重要特征，将电子表格导入开源的数据可视化、机器学习与数据挖掘工具包18.
- 吸取 文件-子程序 来自 数据菜单 到右侧工作区并双击。通过点击“文件夹” 图标，然后选择文件“ImagingFeatures.xlsx”。选择“导出”工作表，并将目标属性分配给变量“肿瘤“。分配“跳过”功能添加到动物编号（图3).
- 吸取“排名”子程序来自 数据菜单 到工作区并连接“文件” 和 “排名通过在它们之间画一条线来连接子程序。
- 打开“排名”子程序，通过双击其图标，然后选择“信息增益算法19.
- 从获取的五个参数中，选取最高的三个用于进一步分析（SUV最大，PE 和 AUC）。
注：这些参数反映代谢活性（SUV最大）以及组织血管化（PE 和 AUC）。
9. 机器学习分析
- 打开 RStudio 3.4.117，通过“文件”菜单加载提供的 TrainModel.R 脚本。
- 安装所需的程序包（此步骤仅需执行一次），输入以下命令： install.packages(c("caret", "readxl", "pROC", "RcmdrPlugin.EZR", "ggplot2"))
- 要加载所需的程序包并将“下载”文件夹设置为工作目录，请选中 TrainModel.R 脚本中的第 3–5 行。
- 在菜单中点击“代码”，然后选择“运行所选行”，以执行所选代码。
10. 训练 avNNet 机器学习算法
- 为了训练 avNNet 算法，请从 TrainModel.R-Script 中选择第 8–39 行（参见步骤 9.1）。
- 在菜单中点击“代码”，然后点击“运行所选行”，以执行所选代码。
11. 分析机器学习算法的结果
- 为评估诊断准确性的标准参数（敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值，以及似然比），请选择 TrainModel.R-Script 中的第 41–50 行。
- 在菜单中点击“代码”，然后点击“运行所选行”，以运行所选代码。。
12. 比较最终模型的受试者工作特征（ROC）曲线与其组成参数的ROC曲线
- 为了执行 DeLong 检验以比较模型的 ROC 曲线与其组成参数的 ROC 曲线，从 TrainModel.R-Script 中选择第 52–62 行（见步骤 9.1）。
- 在菜单中点击“代码”，然后点击“运行所选行”，以运行所选代码。
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结果
大鼠在手术及注射 MDA-MB-231 乳腺癌细胞后迅速恢复，并于接种后第 10 天和第 30 天接受 MR 及 PET/CT 成像（图 1）。图 2A 展示了一只大鼠右侧近端胫骨的代表性 DCE 分析结果。通过点击“导出”按钮并选择“DCEraw.txt”作为文件名，保存 DCE 原始测量数据。
动态参数 AUC、PE 和清除率的后续计算在 RStudio 中通过相应脚本完成。DCE 测量结果需保存为“Downloads”文件夹中的“DCEraw.txt”文件，以便脚本无需额外配置即可直接运行，生成如图 2B所示的数据表。这些数据被复制到提供的电子表格中（图 2C）。同样，肌肉组织的 DCE 参数也被测定并转入电子表格（图 2D、E
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讨论
机器学习算法是强大的工具，可用于将多个预测特征整合到一个综合模型中，从而获得比单独使用任一特征时更高的准确性。然而，实际结果取决于若干关键步骤。首先，所使用的机器学习算法是一个关键因素，因为不同的机器学习算法会产生不同的结果。本方案中使用的算法是 avNNet，但其他有前景的算法包括极端梯度提升21或随机森林。RStudio 的 caret 包20提供了大量不同的算法（目前>175 种），本方案在从一种算法切换到另一种算法方面具有高度灵活性，只需更改代码中的单行即可（例如，将 method = “avNNet” 更改为 method =“rf”），并相应调整 TunedGrid 设置以适配所选的机器学习算法。详细信息请参见 caret github 仓库22。Fernández-Delgado 等人23发表了一篇关于不同算法及其在不同分类问题中表现的出色综述，可作为其他实验的起点。
另...
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披露
作者声明不存在利益冲突。资助方在研究设计、数据收集、分析或解释、论文撰写，以及决定发表结果等方面均未发挥作用。
致谢
本工作由德国研究基金会（DFG，协作研究中心 CRC 1181，子项目 Z02；重点计划 μBone，项目编号 BA 4027/10-1 和 BO 3811）资助，其中包括对扫描设备的额外支持（INST 410/77-1 FUGG 和 INST 410/93-1 FUGG），以及由埃尔朗根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学新兴领域计划（EFI）“Big Thera”资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 双目手术显微镜 | Leica | NA | |
| ClinScan MR 系统 | Bruker | NA | |
| DICOM 查看器 | Horos | NA | www.horosproject.org |
| Excel：电子表格 | Microsoft | NA | |
| FCS | Sigma | F2442-500ML | |
| Gadovist | 拜耳-先灵 | NA | |
| Inveon PET/CT | 西门子 | NA | |
| Inveon Research Workplace 软件 | 西门子医疗有限公司 | NA | |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | NA | |
| MDA-MB-231 人乳腺癌细胞 | 美国典型培养物保藏中心 | N/A | |
| 开源数据可视化、机器学习与数据挖掘工具包 | Orange3，卢布尔雅那大学 | NA | https://orange.biolab.si/ |
| RPMI-1640 | Invitrogen/ThermoFisher | 11875093 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma | 9002-07-7 | |
| Vevo 3100 | VisualSonics | NA |
参考文献
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