利用转基因钙离子荧光报告蛋白Aequorin进行正向遗传筛选以鉴定钙信号通路中的新靶点

摘要

基于Ca²⁺浓度升高的正向遗传筛选可鉴定参与植物钙依赖性信号通路的遗传组分。

摘要

正向遗传筛选一直是无偏见地鉴定参与多种生物通路的遗传组分的重要工具。该筛选方法的基础是构建一个突变群体，并针对感兴趣的表型进行筛选。EMS（乙基甲烷磺酸盐）是一种常用的烷基化试剂，在经典的正向遗传筛选中用于诱导随机突变，以鉴定参与特定生物学过程的多个基因。细胞质钙离子（Ca²⁺）²⁺) 升高是应激感知后激活的关键早期信号通路。然而，介导 Ca²⁺ 在许多研究体系中仍然难以捉摸。Aequorin 是一种从细胞中分离得到的钙离子报告蛋白 Aequorea victoria 并在拟南芥中稳定表达。利用这一特性，我们设计了一个正向遗传筛选实验，对表达水母素的转基因植株进行EMS诱变。收集突变植株的种子（M₁）并对分离群体（M₂) 群体。使用96孔高通量Ca²⁺ 测量方案中，可鉴定出多个具有不同钙响应特征的新型突变体，并实现实时检测。具有目标表型的突变体将被拯救并扩繁，直至获得纯合突变体植株群体。本方案提供了一种在Ca²⁺ 报告背景并鉴定新型 Ca²⁺ 受调控的靶点

引言

细胞在感知生物或非生物刺激后，胞质钙离子（Ca²⁺）浓度的变化是一种被广泛研究的早期信号事件，可激活多种信号通路^1,2,3,4。细胞在基础静息状态下，胞质中的Ca²⁺浓度较低，并将多余的Ca²⁺隔离在不同的细胞内细胞器及细胞外的质外体中，从而形成显著的Ca²⁺浓度梯度^5,6。在信号感知后，由于细胞外和/或细胞内来源的Ca²⁺流入，胞质中的Ca²⁺水平上升，并产生特定于刺激的钙信号特征^7,8,9。多种刺激均可引发胞质Ca²⁺的升高，但特异性由不同的钙库释放Ca²⁺、独特的Ca²⁺信号模式以及相应的感受器蛋白共同维持^10,

方案

1. EMS诱变及基于单系谱的种子收集（1-3个月）

1. 称取150 mg（约7500粒）aequorin种子用于EMS诱变（M₀种子），另称取150 mg种子作为对照。
2. 将种子转移至50 mL离心管中，加入25 mL 0.2% EMS（v/v）（注意：具有危险性）（处理组），或加入25 mL高压灭菌水（对照组）。
   注：乙基甲磺酸（Ethyl-methane sulfonate）是一种用于植物材料诱变的化学试剂。
3. 用Parafilm封口，并用铝箔纸包裹试管。在室温下翻转旋转处理18小时。
4. 静置使种子沉降。小心移除EMS溶液，并将其与等体积的1 M NaOH混合后弃置于废液容器中（NaOH有助于中和/失活EMS，确保安全 disposal）。使用过的塑料器皿应弃入含1 M NaOH的溶液中。
   注： 24小时后，按照实验室危险品处理规范处置废弃物。
5. 用40 mL高压灭菌水彻底清洗诱变处理的种子，至少清洗8次。含EMS的废液按上述方法弃入含NaOH的废液容器中。
6. 最后一次清洗时，加入40 mL 100 mM硫代硫酸钠溶液，冲洗3次，以去除残留的EMS。
7. 将种子在40 mL高压灭菌水中浸泡约1小时，以促进EMS从种子中扩散出来，然后将种子置于滤纸上直至完全干燥。
8. 将种子转移至微量离心管中，在40 mL高压灭菌水中于4 °C....

结果

通过过氧化氢（H₂O₂）诱导的钙离子（Ca²⁺）升高表型对EMS突变群体进行筛选。如前所述，从每个M₁家系中筛选12株独立的M₂幼苗。在图3中，展示了其中一个M₁家系的结果，每个图示面板包含12株独立的M₂幼苗。以野生型水母素作为对照，用于比较和评估突变体的响应。隐性突变体的分离比例为1:7（突变体:非突变体）。在每个M₁家系筛选12株幼苗的情况下，每家系可鉴定出1至2个突变体。我们已从12株M₂幼苗中鉴定出2个候选突变体（图3）。这些突变体进一步繁殖至M₃和M₄代，并建立纯合群体。随后对纯合突变体进行基因定位，以鉴定其致变基因。

讨论

EMS诱变是群体中产生突变的一种强大工具。利用EMS进行经典正向遗传筛选之所以能有效鉴定新基因，主要有两个原因：首先，该方法无需对基因身份进行任何先验假设；其次，它不会引入任何偏好性偏差。目前已有多种方法可用于构建筛选群体，例如EMS诱变、T-DNA插入、辐射等。在所有这些方法中，基于EMS的诱变具有若干优势。第一，通过本方案所述方法暴露于EMS即可相对容易地构建突变体群体^21,22。第二，可产生足够大规模的突变种子群体，从而可用于针对一种或多种刺激的多重筛选。第三，可鉴定出由于错义突变而产生的必需基因的弱等位基因。第四，通过EMS筛选可识别一系列基因功能变化，包括完全功能缺失、部分功能丧失、功能改变以及组成型基因功能。该方法还有助于鉴定其他诱变方法难以实现的双突变体^23,24,25。 本方案中采用的基于单系谱的M.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔组织培养板	Jetbiofil	11024	用于幼苗培养
96孔白色Cliniplate板	Thermo Scientific	9502887	用于发光仪检测
Aequorin
Agropet	Lab Chem India		用于植物生长
氯化钙	Fisher Scientific	12135	用于放电溶液
腔肠素	PJK	55779-48-1	aequorin的辅基
乙基甲磺酸	Sigma Aldrich	M0880-5G	用于种子诱变
乙醇	分析纯试剂	1170	用于放电溶液
盐酸	Merck Life Sciences	1.93001.0521	消毒溶液
过氧化氢	Fisher Scientific	15465	作为诱导钙离子升高的刺激物
Luminoskan ascent	Thermo Scientific	5300172	aequorin发光检测
MES缓冲液	Himedia	RM1128-100G	用于植物生长
MS培养基	Himedia	PT021-25L	用于植物生长
氢氧化钠	Fisher Scientific	27805	用于中和EMS
次氯酸钠	Merck Life Sciences	1.93607.5021	消毒溶液
硫代硫酸钠	Fisher Scientific	28005	用于步骤1.6中的种子洗涤
土壤基质（Soilrite）	Lab Chem India		用于植物生长
方形培养盆	Lab Chem India		用于植物生长
蔗糖	Sigma Aldrich	S0389	用于植物生长
Taxim	Alkem	7180720	用于幼苗挽救