Summary
提出了一种利用超高磁场磁共振显微镜（MRM）以高空间分辨率研究生物组织的协议。提供了微科的特征分步说明。最后，在植物根上演示了成像的优化。
Abstract
该协议描述了电磁微线圈与生物样品结合的信号噪声比（SNR）校准和样品制备方法，设计用于高分辨率磁共振成像（MRI），也称为MR显微镜（MRM）。它可用于临床前的MRI光谱仪，在医学 根部样品上 演示。 Microcoil 通过将 RF 振振器的大小与感兴趣的样本大小相匹配来提高灵敏度，从而在给定的数据采集时间实现更高的图像分辨率。由于设计相对简单，电磁微胶的构造简单且价格低廉，易于适应样品要求。系统地，我们解释如何使用参考解决方案校准新的或自建的微型可可。校准步骤包括：使用螺母曲线确定脉冲功率;射频场同质性估计;并使用标准脉冲序列计算体积规范化信噪比 （SNR）。讨论了小型生物样品样品制备的重要步骤，以及可能的缓解因素，如磁易感性差异。优化电磁线圈的应用通过高分辨率（13 x 13 x 13 μmμm 3， 2.2 pL） 根样品的 3D 成像得到证明。
Introduction
磁共振成像是一种多功能工具，可对各种生物标本进行无创成像，从人类到单细胞1、2、3。虽然用于医学成像应用的 MRI 扫描仪通常使用场强度为 1.5 T 至 3 T 的磁铁，但单细胞应用的图像图像具有更高的场强度 1、3、4。以低于一百微米的分辨率对样品的研究称为磁共振显微镜（MRM）5。然而，与其他可用的显微镜或成像技术（如光学显微镜或CT）相比，MRM的声噪比（SNR）较低。可以采用几种方法来优化SNR6。一种方法是使用更高的磁场强度，而补充方法是优化单个样品的信号检测器。对于后者，应调整探测器的尺寸，以匹配感兴趣的样品的尺寸。对于直径为 ≈0.5-2 mm（例如根组织）的小样品，微线圈很有用，因为 SNR 与线圈直径6、7 成反比。使用专用微科8在动物细胞上实现了高达7.8 x7.8 x 15 μm3的分辨率。存在多种微线圈类型，其中平面线圈和电磁线圈最常用，具体取决于应用和组织几何9。平面线圈表面具有高灵敏度，可用于薄片的应用。例如，一种专为成像活体组织而设计的方法被描述为平面微科10。然而，平面线圈具有高灵敏度的落点，并且没有明确定义的参考脉冲功率。电磁阀线圈是圆柱形的，具有更广泛的应用范围，更受较厚样品的青睐。在这里，我们描述了电磁线圈的特性，一种为微线圈MRI准备样品的协议，以及电磁阀微线圈的校准（图1A）。
电磁阀线圈由一根导电丝（如螺丝钉）组成，缠绕在固定样品的毛细管周围（图1B）。微可可组件只能使用电容铜线、各种电容器和用于焊接组件的合适底座（图1B） 来建造。主要优点是简单、成本低，单位体积SNR和B1场均质性好。易于构建，可快速迭代线圈设计和几何形状。电磁阀微线圈设计和探针特性的具体要求（即电子理论、工作台测量和各种线圈几何的光谱仪测量）已在其他地方广泛描述7、11、12、13、14。
电磁线圈可以按照其他地方描述的准则15，16，记住所需尺寸的设计规则来制造。在此特定情况下，使用内径为 1.5 mm 的线圈，由带电皮的铜线制成，直径为 0.4 mm，绕在 1.5 mm 外径的毛细管周围。此电磁阀位于制造电路的基板上，由调谐电容器 （2.5 pF）、可变匹配电容器 （1.5-6 pF） 以及铜连接线（图 1A、1C） 组成。选择调谐电容器以实现所需的谐振频率950 MHz，而选择匹配电容器以实现50欧姆阻抗下的最大信号传输。较大的电容器是可变的，允许更精细的调整。在正常操作中，使用探头底座中的电容器进行调谐和匹配。组装的微可可需要安装在探头上，以便可以插入磁铁。可能需要额外的支架，具体取决于系统。在这里，我们使用 22.3 T 磁铁组合与布鲁克控制台 Avance III HD 与 Micro5 探头相结合。在这种情况下，我们使用已修改的支撑插入件，该插入件配备了必要的连接，以连接到探头的 1H 通道（图 1A）。
线圈的易感性匹配设计包括一个带全氟液体的储液罐，以减少由于铜线圈靠近样品17而引起的易感性不匹配。一个储液罐是由一个塑料注射器，以包围线圈，并充满fomblin。由于全氟液体需要将线圈封闭，样品的可用直径减少到 1 mm 的外径。为了便于更换样品，样品是在外径为 1 mm 且内径为 700 μm 的毛细管中制备的。图 2A显示了样品制备所需的工具。
基本实验 MR 参数高度依赖于使用的系统的硬件，包括梯度系统、场强度和控制台。几个参数可以用来描述系统性能，其中90°脉冲长度和功率，B1-均匀性和SNR每单位体积（SNR/mm3），是最实际相关的。SNR/mm3可用于比较同一系统18上不同线圈的性能。虽然系统之间可能存在硬件差异，但基准测试协议的统一应用也便于比较系统性能。
该协议侧重于校准和样品制备。显示电磁阀微胶性能的逐步表征：校准90°脉冲长度或功率;评估射频场的同质性;并计算单位体积的 SNR （SNR/mm3）。介绍了使用幻像的标准化自旋回波测量，以便于对线圈设计进行比较，从而优化不同的应用。描述了幻影和生物样品样品制剂，具体用于微可可。该协议可在任何合适的窄孔（≤60毫米）垂直磁铁上实施，该磁体配有市售的微成像系统。对于其他系统，它可以作为准则，并可以与一些调整一起使用。
MRI 测量的生物标本制备通常不是很广泛，因为样本的图像尽可能完整。然而，生物组织中的空气空间会导致图像伪影，因为磁易感性的差异19。效果随磁场强度的增加而增加20。因此，在高场强度下应避免空气空间，这可能需要将样品浸入流体中，以避免组织周围的空气和组织结构内空气空间的去除。具体来说，当使用微可可时，可能需要切除所需的样品组织，然后将其淹没在合适的液体中。随后将样品插入预切毛细管，最后用毛细管蜡密封毛细管。使用蜡作为密封剂，而不是胶水、火焰密封或替代品，意味着样品可以很容易地提取。这个过程在小腿植物 Mededago特伦卡 图拉的根部上得到证明。此协议的一个优点是有可能随后将 MRI 数据与光学显微镜共同注册，因为样品在 MRI 测量过程中不会被破坏。
所提出的协议适用于高空间分辨率的原位测量，更精细的设计可以允许在体内成像样品，其中需要解决与生命支持系统相关的挑战。
Protocol
注：本协议描述了使用和评估1.5毫米内径（ID）电磁线圈线圈特性的程序（图1）。用于演示协议的线圈位于易感性匹配储液罐中，但该协议同样适用于不匹配的线圈。该协议可以适应其他尺寸和不同的光谱仪设置。
1. 参考样品制备
- 要准备 100 mL 的灵敏度参考溶液，请将 156.4 mg 的 CuSO4 = 5 H2O 溶解到 100 mL GL45 烧瓶中包含在的 80 mL D2O 中。硫酸铜可缩短 T 1 和 T2 松弛时间，从而加快测量速度，而 D2O 可防止辐射阻尼和饱和效应。手动搅拌，直到固体完全溶解。
- 使用去维水将体积调整为 100 mL，最终浓度为 1 g/L CuSO4（无水，6.3 mM）。这种浓度足以缩短T1和T2的松弛，但不是太高，受降水的影响。密封参考样品以防止改变 H2 O：D2O 的比率。
- 可选地，将探头连接到网络分析仪，以测试线圈是否以所需的谐振频率产生谐振。执行 S11 反射测试，以测量通过调优和 Q 因子测量实现的频率范围，Haase 等人14. 详细描述。使用共轴电缆将微可可连接到网络分析仪。如有必要，请使用 BNC 适配器电缆。
- 根据线圈设计的预期磁场强度，将网络分析仪的中心频率设置为所需的共振频率。接下来，将扫描宽度设置为 10 MHz。调整微可可组件上的可变电容器（如果存在）以微调反射浸入到所需频率。
- 记录中心频率的反射水平，记录-7 dB 电平的频率f1 和f2。根据 Haase 等人14，使用这些方法计算 -7 dB 级别的 Q 因子
2. 样品制备
- 如果准备用于线圈校准的参考样品，请将 1 mL 的 CuSO4 溶液转移到立体显微镜下的手表玻璃盘上。
- 如果制备生物样品，将 1 mL 的全氟二甲酸素 （PFD） 转移到立体显微镜下的手表玻璃中，用于将样品淹没。PFD用于在无需进入生物细胞的情况下填充试样中的空气空间。质子 MRI 也无法观察到。在需要 PFD 之前，请立即用 Petri 盘盖盖住手表玻璃，以防止蒸发损失。
注：PFD是高度挥发性，是一种强大的长期温室气体21。当其溶解氧特性和低粘度不是必需的，它可以被Fomblin，一个全氟，也提供不明显的1H信号，但它不会蒸发得快17。 - 将适合外径的毛细管切成大小，以适合微可可架（18 mm）的直径，并允许重新定位（图1C）。使用陶瓷切割机每 10-12 mm 进行一次切口，并在切口点上小心地断裂。
- 如果准备参考样品，请使用钳子和立体显微镜使预切割毛细管与手表玻璃内的 CuSO4 溶液表面接触，使毛细管动作充满毛细管。
- 如果制备生物样品，请使用钳子和立体显微镜，使预切毛细管与手表玻璃内的 PFD 表面接触，使毛细管动作完全充满毛细管。将毛细管释放到手表玻璃中，使其完全淹没。
- 小心地从生长基质中提取一个五周大的整个根系，如土壤替代。仔细清洁根部样品。使用钳子去除较大的土壤颗粒，如果存在较小的颗粒，则使用蒸馏水清洗根系来清除它们。照片，如果需要供将来参考。使用手术刀选择并切除一小块纤维根，没有rhizosheath。
- 对于真空处理，将样品放入含有合适固定溶液的 1.5 mL 管中。关闭管盖，然后用副膜密封管，以密封管的开口。然后，用锋利的工具打孔在薄膜上，以便通风管。
- 将样品管放在真空室中，密封吸管，然后将实验室膜真空泵连接到真空室。对样品进行真空处理长达30分钟，以减少生物样品中气囊的存在。当未看到气泡从样品中逸出时，停止真空处理。
- 通过立体显微镜查看时，使用钳子将样品淹没在之前准备的渗透介质中。清洗潜在碎屑的样品。
- 使用钳子将样品插入毛细管，而毛细管和样品均完全浸入水中，以避免气泡。使用较小的毛细管或注射器针尖作为推杆（图2B）。
- 使用钳子从中型手表玻璃中拿样品毛细管。在 PFD 的情况下，盖上培养皿盖。
- 将纸巾塑造成细点，并用它来从毛细管的两端去除大约 1 毫米的液体。
- 使用蜡笔融化少量毛细管蜡。在两侧涂抹蜡。蜡凝固时会变不透明。注意从毛细管中排除气泡（图2C）。
注：避免蜡或毛细管过热，因为当成品样品冷却时，这可能会导致爆炸性沸腾和气穴口袋。 - 之后，用手术刀从毛细管外部刮掉多余的蜡，然后用细纸巾擦拭干净。
3. 安装样品
- 在立体显微镜下面放置一个微可可，并使用钳子插入样品，同时保持微可可稳定（图2D）。
- 使用杆将样品居中，将毛细管滑入电磁线圈内。
- 可选地，应用胶带固定毛细管的位置。
- 检查毛细管，确保电磁线圈内无气泡，避免由于易感性差异而造成 MR 信号破坏。
- 将微可可连接到探针底座的插座，同时保持微可可直立（图 3A，3B）。
- 小心地将三轴梯度线圈滑过微线圈，同时将梯度的水冷连接器与探针基座的冷却接头匹配（图 3C）。转动探针底座上的螺钉螺纹以将梯度固定到位。
注：此步骤仅适用于 Micro5 探头。对于其他系统（如 Micro2.5 或 Biospect），梯度在单独的插座上，而不是线圈。
4. 确定线圈特性
- 如果首次测试线圈，请使用参考样品溶液创建均匀样品，这可用于功率校准 和 B1 均匀性测试。使用此参考样品可以轻松测试线圈导线导致的潜在易感性问题。
- 将探头插入磁铁并连接必要的电缆：RF 传输/接收电缆、水冷却线、热电偶电缆和空气冷却线。
- 为水冷装置设置所需的水冷温度（建议为 298 K）。
- 设置目标温度 （298 K） 和目标气流 （300 L/h）。对于不同的线圈设计或样品体积，气体流量可能不同。这仅适用于具有温度控制系统的系统。
注：只有在测试新型（家庭制造）线圈时，才需要执行以下步骤。 - 使用 50 英寸共轴 Ω电缆将探头连接到具有适当宽扫描宽度 （400 MHz） 的网络分析仪，该扫描宽度以预期谐振频率为中心。
- 通过调整探头底座中的可变匹配和调谐电容器来观察谐振模式。
- 调整谐振模式并匹配到所需频率。
- 可选地，确定网络分析仪上的线圈质量系数（Q 因子）。获得质量因子的一个方法是使用耦合网络，将中心频率（fc）除以-7 dB的反射浸入宽度（即，Q = fc/（f 1 - f2）14。将fc设置为磁体的操作频率，而f1和f2分别设置为 f c的左和右 -7 dB 点。某些网络分析器内置 Q 因子确定功能。
- 在扫描仪上启动反射测试（通常称为摆动曲线），并根据需要调整调谐和匹配。建议将任何调谐和匹配电容器设置为新线圈范围的中点。因此，从高光谱扫描宽度开始。在某些情况下，在网络分析仪上调整和匹配磁体外的线圈可能更方便。
- 如果成像探头的最大体积线圈可用，请选择其填充文件。如果从以前使用的线圈开始，请使用可用的填充文件。如果两个选项都不可用，请从设置为 0 的所有填充值开始。
- 如果微型线圈在成像软件（即 ParaVision）中可用，请选择其正确的线圈 配置。否则，请根据系统手册创建与线圈规格相匹配的新线圈配置（例如，单调或双调）。本研究中使用的这种电磁阀微胶的安全限值为 1 W 峰值功率和 1 mW 连续功率时 1 ms。
注意：微科机所需的小电容器（通常为 1 mm 尺寸）高度敏感，容易被高压损坏。自动脉冲功率测定可能无法与非标准线圈一起工作，过高的功率可能会损坏线圈或光谱仪的其他部件。因此，建议进行手动调整。 - 记录新线圈的螺母曲线，以获得线圈正确射频功率的指示（图4）。如果线圈的安全限值未知，请从 0.6 W 的低脉冲功率下 10 μs 开始，然后一次缓慢地将脉冲长度增加 1 μs，直到信号出现。
- 在没有梯度编码的情况下使用 FID 实验，在保持脉冲功率恒定的同时系统地更改 RF 脉冲长度。理想的脉冲长度是脉冲长度，其中信号强度达到最大值。如果测试新线圈，首先使用功率极低的 10 μs 脉冲，然后开始逐渐增加脉冲功率。
注：如果线圈特性和光谱仪的组合功率远高于预期，这已经表明选择了错误的振振模式。 - 对于具有均匀 B1场的线圈（如电磁线圈），确定信号强度降至零22的 180° 脉冲。
- 在没有梯度编码的情况下使用 FID 实验，在保持脉冲功率恒定的同时系统地更改 RF 脉冲长度。理想的脉冲长度是脉冲长度，其中信号强度达到最大值。如果测试新线圈，首先使用功率极低的 10 μs 脉冲，然后开始逐渐增加脉冲功率。
- 将确定的 90° 脉冲功率设置为创建的学习器的调整卡。在 ParaVision 中，参考功率调节卡可用于输入硬脉冲功率。
- 使用具有 3 个切片的定位器扫描，三个主轴中每个切片中各一个切片，以定位线圈在磁铁中的位置。为此，请从光谱仪的默认库加载本地化器扫描。建议从没有偏移的大视场开始。执行自动接收器增益调整并手动启动测量。
注：如果样本正好位于梯度系统的中心，则本地化器扫描将显示样本。如果线圈或样品不在图像切片中居中或缺失，则需要调整本地化扫描，在这种情况下，需要再次执行步骤 4.12。 - 或者，使用补充方法根据图像评估查找正确的 90° 脉冲。使用螺母曲线找到近似脉冲功率后，逐渐调整脉冲功率，以检查图像是否为 B1场均匀性。对于一些具有不均匀 B1 场的线圈，使用螺母曲线确定的 90° 脉冲功率可能过高，从而导致线圈所需甜点过度跳动。在这种情况下，请降低参考脉冲功率，并针对以前的图像检查新图像（图 5）。
- 根据 FID 信号手动填充磁场。建议的初始起静顺序为 Z-Z2-Z-X-Y-Z-XY-XZ-YZ-Z。在电磁阀的情况下，主对称轴位于 XY 平面中。因此，不同方向的施舍可能会导致此线圈配置的 B 0均匀性更强校正。高阶什马次没有影响，可能会被忽略。
- 计算一个体积规范化的SNR，以便根据制造商的协议18来比较不同系统的微可可特性。对于此处使用的微可可，我们使用了具有以下参数的自旋回波序列：视场 （FOV） 6 mm x 6 mm、重复时间 （TR） 1000 ms、回显时间 （TE） 7 ms、矩阵 256 x 256 和切片厚度 = 0.5 mm。调整切片厚度，直到接收器增益为单一。接下来，调整切片数，使切片超出 B1场均性区域。如果可能，在没有信号平均值的情况下记录图像。
- 通过两个步骤确定体积规范化 SNR （SNR/mm3）。首先，计算体美图体积（V体美音）（Eq.1）：
(1)
注：Dx、D y和D切片的单位以毫米为单位。同样，也可以对一系列切片执行此计算。 - 选择感兴趣的区域以确定样本的信号强度（μROI）以及样本外部区域（即噪声）的信号强度（μ噪声） 和标准差（σ噪声）。平均信号取自图像中心，而噪声信号则从角面片计算（图6）。光谱仪控制软件或通用图像处理软件可用于这些计算。如果可能，使用单个重复，以保持不同线圈之间的可比性。
- 使用值计算卷规范化 SNR（Eq.2）：
(2)
对于此处与参考解决方案结合使用的线圈，使用 Eq.2 可产生以下解决方案：
(3)
注：在比较不同磁场强度的线圈SNR时，除非使用很长的重复时间和非常短的回波时间，否则需要测量幻象的松弛特性23。
- 通过两个步骤确定体积规范化 SNR （SNR/mm3）。首先，计算体美图体积（V体美音）（Eq.1）：
- 检查磁场不同源性导致的易感性问题：加载并运行多个梯度回波 （MGE） 序列（图 7）。由于易感性差异导致的磁场不同质性在回波时间较长的图像中可见，因为梯度回波不会重新聚焦旋转，而由于静态场的不同源性，该旋转会去相。这样，样品中的不霍米可以可视化（由于样品中的空气空间），以及线圈材料引入的B0 场不自在。使用以下参数，根据使用的光谱仪和线圈的规格进行调整：TR 200 ms，TE 3.5 ms，48 个回波相隔 3.5 ms，翻转角度 30 度。矩阵大小 128 x 128。
注：如果在谐振（摆动）曲线中观察到多个（潜在）谐振模式或反射凹跌，则对每个谐振模式重复上述步骤以确定最敏感的模式。根据微可可，微可可组件的不同部分可能容易产生意外的共振模式。
(1)
(2)
(3)5. 高分辨率成像
- 运行具有以下参数的 3D-FLASH 实验：TR 70 ms、TE 2.5 ms、矩阵大小 128 x 64 x 64、FOV 1.6 x 0.8 x 0.8 mm、翻转角度 30°和接收器带宽 50 kHz。
- 从先前确定的参考脉冲功率中获取脉冲功率;这是自动在大多数成像软件。使用自动调整确定接收器增益。如有必要，调整 FOV，在两个相位编码方向上覆盖整个对象，以避免混叠。运行梯度占空比模拟（如果系统可用）以验证实验的占空比是否保持在梯度线圈的规格范围内。
注：这些参数特定于用于演示的线圈;优化本地系统细节非常重要。
6. 回收样品作进一步研究或储存
- 从微管中去除样品毛细管。
- 使用钳子，取下立体显微镜下的蜡塞。
- 使用注射器将样品从毛细管中洗出，并采用选择的解决方案。或者，使用玻璃推杆弹出样品。
- 为防止样品脱水，请存放在合适的存储介质中。
Representative Results
线圈特性
线圈成功调谐和匹配后，其性能可表现为线圈Q因子、90°参考脉冲和SNR/mm3。对于此处演示的 1.5 mm ID 易感性匹配电磁阀线圈，测量的 Q 因子（卸载）为 244，而 5 mm 鸟笼线圈为 561。
参考 90° 脉冲在功率级别为 0.6 W 时为 12 μs;cf. 5 μs 在 45 W 为 5 毫米鸟笼线圈 （图 4和图 5）.这等同于射频场强度 （ B1）， 
微线圈使用 0.53 mT，鸟笼线圈14使用 1.17 mT，其中 y 是陀螺磁比，而 tau 是脉冲持续时间。由于脉冲功率水平 （P） 不同，线圈的传输效率可进行比较：微线圈和鸟笼的电压为 
0.69 mT/W1/2和 0.18 mT/W1/2。 通过 90° 脉冲比较，微线圈是一个≈比鸟笼线圈敏感 4 倍的因素。
易感性匹配的影响
在超高场强度下，样品和线圈易感性成为图像质量的主导因素，如图7A，7B所示。 与缺乏易感性匹配储液罐的线圈相比，信号在参考样品中保留的时间更长、更均匀。但是，由于易感性储液罐，与没有储液罐的线圈的最大样品尺寸有关。
高分辨率成像
在20小时23分钟内，获得13×13×13 μm 3的高分辨率（图8）。从根的表面开始，可以看到根皮层，以及根外侧有一些残留的水。此外，木兰被观察为包围 phloem 的暗带。一些气囊被观察为具有完全信号损失的黑点。
M. truncatula 的共生根结节也可以使用此协议进行成像 （图9）.使用稍大无与伦比的线圈（长度约 3500 μm，内径 1500 μm），在 33 分钟内获得分辨率高达 16 x 16 x 16 μm3的图像。
图1：电磁阀微胶。 （A） 电磁线圈设计由线环螺旋体组成，通常缠绕在毛细管上。导线的几何形状（如其厚度、直径、绕组数和导线间距）会影响线圈特性。（B） 一种家用电磁阀微胶，具有易感性匹配流体储液罐（Fomblin）。它由一个0.4毫米厚的涂层铜线绕六次毛细管周围，外径为1500μm，线圈长度为3500μm。线圈被淹没在由注射器制造的储液罐中。可以插入外径为 1000 μm 的样品毛细管。使用两个电容器，一个1.5 pF电容器与电感器并联，第二个变量1.5-6 pF电容器与电感器平行放置。所有组件都焊接到玻璃纤维板（黄色）。它安装在商业支架（灰色聚合物）上，经过修改以支持储液罐。 （C） 电磁线圈设计元件：1.电磁线圈，2.样品毛细管，3.1.5 pF调谐电容器，4.可变匹配电容器，5.玻璃纤维基板，6.铜线引线。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：立体显微镜下样品制备。 （A） 制备微球所需的物品。从左到右： 1. CuSO4 参考 解决方案， 2.全氟二甲酸素，3。微可可，4。手术刀， 5.正张力钳子， 6.钳子， 7 。毛细管外径 = 1000 μm， 8.蜡笔， 9.毛细管蜡，10。硝酸盐手套，11。立体显微镜，12。手表玻璃与彼得里菜盖， 13 。生长基材中的植物材料。未显示：2 mL 注射器，带 ± 0.8 x 40 mm 针头和细纸巾。（B） 用钳子将样品插入毛细管，同时两者保持水下。（C） 使用熔融蜡密封毛细管。（D） 将准备好的毛细管插入微管中。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：微成像探头的组件。 （A） Micro5 探头基座，包含水冷却、加热、温度传感器、梯度功率、RF（可见共轴连接器）和可选探头识别 （PICS） 的所有必要连接。探头底座下方是用于调整可变调谐和匹配电容器的旋钮，以及固定螺钉以将探头固定到位的光谱仪内。（B） 安装在探针底座上的家建微型孔。请注意安装在探头底座上的可变电容器（白色陶瓷），用于调谐和匹配。（C） 集成的 3 轴梯度安装在探头底座上，配有水冷贮器和镀金触点，用于将梯度接地。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：螺母曲线。获取螺母曲线以确定参考脉冲功率。参考脉冲功率（90° 脉冲）定义为生成 B1场所需的功率和脉冲长度的组合，该场可将 z 方向上的所有可用磁化翻转到横向平面。在没有梯度编码的情况下记录一系列脉冲。对于每个脉冲，脉冲长度或脉冲功率都会增加。这里的脉冲功率设置为 0.6 W，而脉冲长度每次递增 1 μs。最大信号强度表示 90° 脉冲，大约 12 μs。180° 脉冲也可以使用最小强度以这种方式确定。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：90° 脉冲功率的视觉测定。 使用螺母曲线找到近似参考脉冲功率后，可以通过更改脉冲长度进行目视检查。根据线圈的不同 ，B1 场对变化可能或多或少敏感。（A） 11 μs 脉冲长度。（B） 12 μs脉冲长度，最适合此线圈。（C） 13 μs 脉冲长度。（D） 20 μs 脉冲长度。如果脉冲功率设置过高，则可能发生过度倾斜，从而降低线圈中心（箭头）的图像强度。增加 的 B1 场也增加了线圈的范围，如在图像宽度中观察到的。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 6：兴趣放置区域。 可以看到卷规范化 SNR 计算的感兴趣区域 （ROI）。平均样品强度取自参考解决方案样本中的 ROI。平均噪声和标准偏差是根据图像角的一个或多个 ROI 计算的。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7：通过梯度回声成像评估的射频均质。多个梯度回波 （MGE） 序列用于使用一系列梯度回波评估RF （B1 -场） 的均匀性。基本参数为：重复时间200ms，回波时间3.5ms，回波数48，回波间距3.5ms，平均64个，采集时间27m 18s，翻转角度30°。视野为 5 x 5 mm，矩阵 128 x 128，分辨率 39 x 39 x 200 μm. （A） 易感性匹配线圈。RF 线圈周围的易感性匹配流体（Fomblin）可降低线圈导线的易感性影响。随着回声时间的增加，小气泡会导致信号丢失。（B） 线圈直径相等的线圈（不易匹配）。在较长的回波时间，观察到由B0场不自异引起的伪影增加。请单击此处查看此图的较大版本。
图8：医疗根部分的3D成像。（顶部） 闪存图像.根部分的几个特征可以区分，包括表皮 （e）、皮层 （c）、phloem （ph） 和 xylem （xy）。气囊 （a） 在根本原因中导致完全信号丢失。基本参数如下：重复时间70ms，回波时间2.5ms，平均256个，采集时间20小时23米。分辨率 13 x 13 x 13 μm3.矩阵大小为 128 x 64 x 64，视野为 1.6 x 0.8 x 0.8 mm。接收器带宽 50 kHz。（底部）MSME 图像。基本参数如下：重复时间500 ms，回波时间5.2ms，28平均值，采集时间15小时55米。分辨率 13 x 13 x 13 μm3.矩阵大小为 128 x 64 x 64，视野为 1.6 x 0.8 x 0.8 mm。接收器带宽 70 kHz。请单击此处查看此图的较大版本。
图9：医疗根结核结节的3D成像。 （顶部） 低分辨率图像。基本参数如下：重复时间60ms，回显时间2.3ms，4平均值，采集时间4m。分辨率 31 x 31 x 31 μm3.矩阵大小为 64 x 32 x 32，视野为 2 x 1 x 1 mm。接收器带宽 50 kHz。（底部）高分辨率图像。基本参数如下：重复时间60 ms，回波时间2.3 ms，平均8个，采集时间33m。分辨率 16 x 16 x 16 μm3.矩阵大小为 128 x 64 x 64，视野为 2 x 1 x 1 mm。接收器带宽 50 kHz。请单击此处查看此图的较大版本。
Discussion
该协议最适合生物样品，因为许多材料和地质样品的T2松弛时间明显缩短，无法由此处使用的序列成像。甚至一些生物组织，表现出高样品磁易性异质性，可能很难在超高场成像，因为影响与场强度24相关。该协议不仅可用于新线圈，还有助于排除故障和诊断潜在问题。在测试新的或未知的样品时，可以事先在参考解决方案上执行此协议，以验证实验设置是否根据规范运行。这有助于故障排除，因为光谱仪可以排除为伪影和故障的来源。此外，这会将探头上的调谐和匹配电容器设置为微可可的典型值。
当第一次实验时没有记录到任何信号时，可以放大本地化器扫描的视场，以检查是否看到样品。接下来，重新检查线圈是否正确调整，然后尝试另一个定位器扫描。线圈可能表现出其他意外的振振模式，在这种情况下，需要确定正确的振振模式。如果仍然无法获取图像，则拆下样品以检查其在微可可组件中的位置，并验证样品是否完好无损（即，密封件中不存在气泡或泄漏）。最后，样品可以用水代替PFD制备。如果样品在局部扫描中发出很少的可检测信号，仍然可以检测到毛细管中的周围水。
由于微线圈理想中非常接近样品，因此空气和导线之间的磁易性差异可能会导致额外的信号丢失，如图7B 所示。潜在伪影包括空间错位和异常信号强度变化。特别是梯度-回声型脉冲序列受此非均匀信号损耗的影响。因此，我们提出了一个易感性匹配的线圈，通过将导线淹没在氟化物液体（Fomblin 或 FC-43）中。该协议中包含的B1估计方法可帮助确定 B 1易感性差异是否值得在线圈组件设计中加入易感性匹配策略。构建易感性匹配线圈的替代方法是使用易感性匹配线25。此外，只有由于线圈造成的易感性问题通过这种方法得到解决。样品内部的易感性不匹配（例如，由于空气空间）仍然具有挑战性。
气囊或气泡构成实验性挑战，导致大量信号丢失，由空气和流体或试样接口的易感性差异引起 （图5A）。样品制备成功的一个关键方面是样品和毛细管的淹没。但是，即使是小气泡也可能导致信号丢失，尤其是对于梯度回声类型序列。移动气泡可以通过毛细管迁移，直到它们与样品接触。其中一些效果可以通过稍微倾斜毛细管来缓解，使一端高于另一端。倾斜可确保在较高端放置潜在的气泡，而不会干扰样品。同样重要的是检查毛细管蜡是否形成良好的密封，因为脱水会导致形成大气泡。
对于样品内的空气空间，PFD 用于填充细胞间空气空间，同时不穿透细胞膜26。然而，即使采用这种方法，我们也无法移除所有空气空间。此外，这种方法意味着我们需要一个额外的代理，这通常不是首选，因为希望研究一个系统尽可能无创。
毛细血管的圆柱形意味着灌注设置应该是可行的，特别是对于容易腐烂的组织，如活检或活根材料研究过程。两个步骤可以实现灌注设置。首先，连接中进给管以及毛细管两侧的排水管将足以创建一个化疗器。其次，在样品毛细管中添加压痕可以根据流动方向保持样品的位。这类似于为平面微科10发布的协议。
MR 成像的非侵入性，结合本协议中使用的惰性液体（PFD 或 Fomblin）意味着在完成实验后，样品可从毛细管中去除，以作进一步研究。组合包括光学或电子显微镜和其他破坏性成像技术。我们最近演示了与光学显微镜在医疗根结核27的组合。
我们演示了一种在超高场 NMR 光谱仪上使用专用微coil对植物材料进行成像的方法。相对较大的样品量可以以高分辨率研究，具有良好的射频均匀性。此外，光谱成像可以执行更高的分辨率，否则可行。通过一种有效的方法来确定线圈性能特性，可使微线圈设计适应样品。电磁线圈方法也可以很容易地应用于植物以外的其他样品，包括动物组织。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
950 MHz仪器的实验得到了荷兰NWO资助的国家路线图大型设施uNMR-NL的支持（项目184.032.207）。R.S. 得到了 BioSolarCells 财团项目 U2.3 的支持。J.R.K.得到了荷兰磁共振研究学院（NMARRS）研究生院[022.005.029]的支持。我们感谢申德峰和托·比塞林提供 梅迪戈特伦卡图拉 样品。我们进一步感谢克拉特杰·胡本、玛丽·雷诺和约翰·范德兹万在UNMR-NL工厂的技术支持。我们还要感谢沃尔克·莱曼、亨尼·詹森和彼得·德·瓦德的技术支持。我们感谢弗兰克·韦尔格德特、约翰·菲利普和卡西克·赛·桑卡尔·古普塔的建议。最后，我们感谢杰西卡·德·鲁伊特为视频提供画外音。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reference solution preparation | |||
| CuSO4 | Sigma-aldrich | 469130 | Crystalline powder for creating reference solution |
| D2O | Sigma-aldrich | 151882 | Liquid used to prepare reference sample |
| Weigh Scale | Sartorius | PRACTUM513-1S | Scale for weighing compounds |
| Sample preparation | |||
| Capillary 1000 μm (Outer diameter) | Hilbenberg GmbH | 1408410 | Sample capillaries |
| Capillary wax | Hampton Research | HR4-328 | Solid wax used to seal samples |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | No. 11 | Used to excise samples |
| Perfluorodecalin | Sigma-aldrich | P9900 | Liquid used for submerging sample |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | Tabletop binocular microscope |
| Syringe | Generic | - | Used to apply PFD and manipulate the sample |
| Vacuum Pump | Vacuubrand | MZ2C | Two-stage membrane vacuumpump used for removing air pockets from samples. |
| Wax pen | Hampton Research | HR4-342 | Handheld wax pen used to melt and apply capillary wax to samples |
| Imaging Hardware | |||
| 22.3 T Magnet | Bruker GmbH | 950 US2 | Narrowbore superconducting magnet |
| Air cooler | Bruker GmbH | - | Used to regulate probe temperature |
| Console | Bruker GmbH | Avance III HD | Controls operation of the spectrometer |
| Micro5 gradient coils | Bruker GmbH | Mic5 | Removable gradient coils mount on the Micro5 probe body |
| Micro5 Probe body | Bruker GmbH | Mic5 | Holds microcoils and gradient coils |
| RF microcoil | Home-built | - | contains Fomblin |
| Vector Network Analyzer | Copper Mountain Technologies | TR1300/1 | Used to perform S11 reflectance test, frequency range 300kHz to 1.3 GHz |
| Water cooler | Bruker GmbH | BCU-20 | Open loop watercooling to dissipate heat from gradient coil operation. |
References
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