Summary
Intracraniale hersenen metastase modellering wordt gecompliceerd door een onvermogen om tumorgrootte en reactie op de behandeling met nauwkeurige en tijdige methoden te controleren. De gepresenteerde methodologie paren intracraniale tumor injectie met magnetische resonantie imaging analyse, die wanneer gecombineerd, cultiveert nauwkeurige en consistente injecties, verbeterde dier monitoring, en nauwkeurige tumor volume metingen.
Abstract
Uitgezaaide verspreiding van kanker is een ongelukkig gevolg van de progressie van de ziekte, agressieve kanker subtypes, en / of late diagnose. Hersenmetastasen zijn bijzonder verwoestend, moeilijk te behandelen, en verlenen een slechte prognose. Terwijl de precieze incidentie van hersenmetastasen in de Verenigde Staten blijft moeilijk te schatten, het is waarschijnlijk te verhogen als extracraniële therapieën blijven effectiever bij de behandeling van kanker. Zo is het noodzakelijk om nieuwe therapeutische benaderingen te identificeren en te ontwikkelen om metastase op deze site te behandelen. Hiertoe is intracraniale injectie van kankercellen een gevestigde methode geworden om hersenmetastase te modelleren. Voorheen was het onvermogen om tumorgroei direct te meten een technische belemmering voor dit model; echter, toenemende beschikbaarheid en kwaliteit van kleine dierlijke beeldvorming modaliteiten, zoals magnetische resonantie imaging (MRI), zijn enorm verbeteren van de mogelijkheid om tumorgroei te controleren in de tijd en veranderingen in de hersenen af te leiden tijdens de experimentele periode. Hierin wordt intracraniale injectie van murine borsttumoren in immunocompetent muizen, gevolgd door MRI, aangetoond. De gepresenteerde injectie aanpak maakt gebruik van isoflurane anesthesie en een stereotactische setup met een digitaal gecontroleerde, geautomatiseerde boor en naald injectie om de precisie te verbeteren, en technische fouten te verminderen. MRI wordt gemeten in de tijd met behulp van een 9,4 Tesla-instrument in de Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume metingen worden aangetoond op elk moment door het gebruik van ImageJ. Over het algemeen zorgt deze intracraniale injectiebenadering voor nauwkeurige injectie, dagelijkse monitoring en nauwkeurige tumorvolumemetingen, die samen het nut van dit modelsysteem sterk verbeteren om nieuwe hypothesen op de drivers van hersenmetastasen te testen.
Introduction
Hersenmetastasen komen 10 keer vaker voor dan volwassen primaire centrale zenuwstelsel tumoren1, en zijn gemeld in bijna elke vaste tumor type met longkanker, borstkanker, en melanoom vertonen de hoogste incidentie2. Ongeacht de primaire tumorsite leidt de ontwikkeling van hersenmetastase tot een slechte prognose die vaak gepaard gaat met cognitieve achteruitgang, aanhoudende hoofdpijn, epileptische aanvallen, gedrags- en/of persoonlijkheidsveranderingen1,3,,4,5. In termen van borstkanker, zijn er veel vooruitgang in de preventie en behandeling van de ziekte. Echter, 30% van de vrouwen gediagnosticeerd met borstkanker zal gaan ontwikkelen metastasen, en van degenen met stadium IV ziekte, ongeveer 7% (SEER 2010-2013) hebben hersenmetastase6,7. De huidige behandelingsopties voor metastase van de hersenen omvatten chirurgische resectie, stereotactische radiochirurgie en/of gehele hersenenradiotherapie. Toch, zelfs met deze agressieve therapie, de mediane overleving voor deze patiënten is een korte 8-11 maanden7,,8,9. Deze grimmige statistieken ondersteunen sterk de noodzaak van de identificatie en implementatie van nieuwe, effectieve therapeutische strategieën. Dus, zoals met alle vormen van kanker die metastaseren naar de hersenen, is het essentieel om goed model borstkanker geassocieerde hersenen metastase (BCBM) in het laboratorium om aanzienlijke vooruitgang in het veld te waarborgen.
Tot op heden hebben onderzoekers gebruik gemaakt van een verscheidenheid van methoden om mechanismen van metastase naar de hersenen te bestuderen, elk met duidelijke voordelen en beperkingen10,11. Experimentele metastase methoden zoals staart ader en intracardiac injectie verspreid tumorcellen door het hele lichaam en kan resulteren in immense tumor belasting op andere gemetastaseerde sites, afhankelijk van de geïnjecteerde cellen. Deze resultaten zijn dan verwarrend als specifiek het bestuderen van metastase naar de hersenen. De intracarotid slagader injectie methode is voordelig als het specifiek richt zich op de hersenen zaaien van tumorcellen, maar is beperkt als het technisch moeilijk kan worden uit te voeren. Orthotopische primaire tumorresectie wordt vaak beschouwd als het meest klinisch relevante model van metastase als het de gehele uitgezaaide cascade recapituleert. Toch omvat deze aanpak langdurige wachttijden voor spontane metastase optreden met dramatisch lagere tarieven van hersenuitzaaiingen in vergelijking met de andere gemetastaseerde sites zoals de lymfeklier, de long en de lever. Vaak moeten dieren worden verwijderd uit studies als gevolg van tumorlast op deze andere gemetastaseerde sites voorafgaand aan de ontwikkeling van hersenuitzaaiingen. Andere methoden waarbij de hersenen tropencellijnen zijn effectief bij uitzaaiingen naar de hersenen; echter, deze modellen zijn beperkt in die zin dat ze de tijd nemen om te ontwikkelen en vaak verliezen hun tropisme met voortplanting. Gezien deze beperkingen hebben onderzoekers routinematig gebruik gemaakt van de intracraniale injectiemethode om kankermetastase naar de hersenen te modelleren11,12,13,14 met verschillende methodologieën15,16,17,18,19. Er wordt erkend dat deze aanpak op dezelfde manier beperkingen heeft, vooral omdat het geen onderzoek mogelijk maakt van vroege gemetastasure stappen, waaronder intravasatie uit de primaire tumor, penetrance door de bloedhersenbarrière en vestiging in de hersenen. Het maakt het echter wel mogelijk voor onderzoekers om te testen (1) welke tumor afgeleide factoren de groei in de hersenen bemiddelen (bijvoorbeeld genetische manipulatie van een oncogene factor in tumorcellen), (2) hoe veranderingen in de gemetastaseerde micro-omgeving de groei van kanker op deze site veranderen (bijvoorbeeld vergelijking tussen transgene muizen met veranderde stromale componenten) en (3) effectiviteit van nieuwe therapeutische strategieën voor de groei van vastgestelde laesies.
Gezien het potentiële nut van het intracraniale injectiemodel, is het absoluut noodzakelijk om technische fouten tijdens de injectie te verminderen en de tumorgroei in de loop van de tijd nauwkeurig te controleren. De hierin beschreven methode omvat continue doseren van ingeademde gasesthesie, en directe implantatie van tumorcellen in de hersenen parenchyma met behulp van een stereotactische boor en injectie standaard. Het toedienen van gas verdoving zorgt voor het verfijnen van de diepte en lengte van anesthesie en zorgt voor een snel en soepel herstel. Een digitaal gestuurd, geautomatiseerd boor- en naaldinjectiesysteem verbetert de precisie van de injectieplaats en vermindert technische fouten die vaak worden opgelopen door boor- en vrije injectiemethoden. Het gebruik van magnetic resonance imaging (MRI) verhoogt verder de precisie bij het monitoren van tumorgroei, tumorvolume, weefselrespons, tumornecrose en reactie op de behandeling. MRI is de beeldvorming modaliteit van keuze voor zachte weefsels20,21. Deze beeldvormingstechniek maakt geen gebruik van ioniserende straling en heeft de voorkeur boven Computertomografie (CT), vooral voor meerdere beeldvormingssessies in de loop van een studie. MRI heeft een veel groter bereik van de beschikbare zachte weefsel contrast dan CT of echografie (USG) en presenteert anatomie in meer detail. Het is gevoeliger en specifieker voor afwijkingen in de hersenen zelf. MRI kan worden uitgevoerd in elk beeldvormingsvlak zonder het onderwerp fysiek te verplaatsen, zoals het geval is in 2D USG of 2D optische beeldvorming. Het is belangrijk om te vermelden dat de schedel het MRI-signaal niet verzwakt zoals in andere beeldvormende modaliteiten. MRI maakt de evaluatie van structuren die kunnen worden verduisterd door artefacten uit bot in CT of USG. Een bijkomend voordeel is dat er veel contrastmiddelen beschikbaar zijn voor MRI, wat de laesiedetectielimiet verbetert, met een relatief lage toxiciteit of bijwerkingen. Belangrijk is dat MRI monitoring in real-time mogelijk maakt in tegenstelling tot histologische evaluatie op het moment van obductie, die beperkt is in het ontcijferen van tumorvolume. Andere beeldvormingsmodaliteiten, zoals bioluminescente beeldvorming, zijn inderdaad effectief voor vroegtijdige tumordetectie en -monitoring in de loop van de tijd; Deze methode vereist echter genetische manipulatie (bijvoorbeeld luciferase/GFP-tagging) van cellijnen en staat geen volumetrische metingen toe. MRI is verder voordelig als het weerspiegelt patiënt monitoring en downstream volumetrische analyse van de MR beelden is bekend dat sterk gecorreleerd aan histologische tumor grootte bij obductie22. Seriële monitoring met MRI-screening verhoogt ook de klinische monitoring van neurologische stoornissen, mochten ze zich voordoen.
Over het algemeen stelt de gepresenteerde methode van stereotactische intracraniale tumorinjectie, gevolgd door seriële MRI, ons in staat om betrouwbare, voorspelbare en meetbare resultaten te produceren om mechanismen van hersenmetastase bij kanker te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Ohio State University (P.I. Gina Sizemore; Protocol #2007A0120). Alle knaagdier survival chirurgie IACUC beleid worden gevolgd, met inbegrip van het gebruik van steriele technieken, leveringen, instrumenten, evenals bont verwijderen en steriele voorbereiding van de incisie site.
1. Intracraniële injectie van borstkankercellen
OPMERKING: De methode hierin beschreven maakte gebruik van de DB7 murine borsttumorcellijn afgeleid van een primaire MMTV-PyMT tumor23. Eerdere studies hebben vastgesteld intracraniale injectie van DB7 cellen als een model van BCBM met histologie die die van de menselijke ziekte bootst12. Belangrijk is dat immuun-competente FVB /N muizen worden gebruikt voor dit model als DB7 cellen werden afgeleid van deze muis stam. Aangezien dit een borstkankermodel is, worden volwassen vrouwelijke muizen gebruikt voor deze studies.
- Bereid cellen voor.
- In een steriele kap, aspirate media van celkweekplaten met behulp van standaard technieken.
- Was cellen met 1x DPBS en trypsinize met behulp van het protocol van de fabrikant.
- Voeg een geschikt volume FBS-bevattende media toe om de trypsinereactie te stoppen en de concentratie cellen te bepalen met behulp van een hemocytometer of voorkeursmethode.
- Pelletcellen op 300 x g gedurende 4 min bij 4 °C.
- Aspirate media, wassen met 1x DPBS, re-spin op 300 x g gedurende 4 min bij 4 °C.
- Resuspend cellen in 1x DPBS tot een geschikte concentratie, ongeveer 50.000 cellen per injecteerbaar volume van 2 μL.
OPMERKING: Het celnummer is afhankelijk van de agressiviteit van de lijn en moet door de onderzoeker worden bepaald. We gebruiken routinematig 2 μL, maar het gebruik van volumes <6 μL wordt gerapporteerd15,16,17,18,19. Lage volumes zijn cruciaal om precisie te behouden. - Plaats geresuspended cellen op ijs totdat geïnjecteerd om de levensvatbaarheid te behouden.
- Bereid muizen voor op een operatie.
- Voor muizen met bont: verwijder bont uit de schedel, hetzij door ontharingscrème/ lotion, hetzij door te scheren. Doe dit binnen 24-48 uur voorafgaand aan de operatie als het uitvoeren van deze stap te dicht bij een operatie kan interfereren met de kwaliteit van de huid en hechting kracht.
OPMERKING: Vrouwelijke FVB/N muizen met een gewicht van ongeveer 25 g werden gebruikt als gevolg van de studie van uitgezaaide borstkanker, een overwegend vrouwelijke ziekte. - Toediening van pijnstillers zoals bepaald door de IACUC en het bijwonen van dierenarts: een onderhuidse injectie van Buprenorfine SR-LAB (0,05-0,1 mg/kg dosis, Buprenorfine voorraad: 0,5 mg/mL voor een dosering van 0,0025-0,088 mL) ten minste 24 uur voorafgaand aan de operatie tot 72 uur analgesie, die kan worden herhaald 48-72 uur na de eerste dosis, indien nodig. Ook het toedienen van NSAID's (20% ibuprofen in drinkwater bijvoorbeeld, 1 mg/5 mL) ten minste 24-48 uur voor de operatie en blijven gedurende 2-7 dagen na de operatie om een minimum 72 uur postoperatieve analgesie te bieden.
OPMERKING: Op de Ohio State University, Buprenorfine SR-LAB wordt toegediend door de University Lab Animal Resources Veterinair personeel als het is een gereguleerde stof.
- Voor muizen met bont: verwijder bont uit de schedel, hetzij door ontharingscrème/ lotion, hetzij door te scheren. Doe dit binnen 24-48 uur voorafgaand aan de operatie als het uitvoeren van deze stap te dicht bij een operatie kan interfereren met de kwaliteit van de huid en hechting kracht.
- Bereid stereotactische eenheden voor op een operatie.
- Schakel alle anesthesiemachines, digitale Vernier-weegschalen en digitale injectoren in.
OPMERKING: Alle chirurgische hulpmiddelen moeten voorafgaand aan de operatie adequaat worden gereinigd en gesteriliseerd. - Gebruik verdovingsmachines met een inductiekamer in een biologische veiligheidskast(figuur 1A).
- Zorg ervoor dat alle buizen van anesthesiemachines zijn aangesloten op de stereotactische frames(figuur 1B, inzet 1C) en dat de klemmen op de buizen open staan voor alle eenheden die worden gebruikt. Sluit eventuele klemmen op buizen naar stereotactische frames die niet zullen worden gebruikt voor de operatie.
- Stel anesthesiemachines in op de aanbevolen neuskegelstroomsnelheid van de fabrikant op basis van het muisgewicht (bijvoorbeeld 25 g diergewicht: neuskegelstroomsnelheid 34 mL/min).
LET OP: De hoofdhouder in deze stereotactische opstelling wordt alleen aanbevolen voor volwassen muizen. Zorg ervoor dat de aanbevelingen van de fabrikant die bij de stereotactische opstelling zijn opgenomen, worden opgevolgd. - Zorg ervoor dat de juiste verdoving (bijvoorbeeld isoflurane) voorgevuld in de spuit aan de anesthesiemachine(figuur 1B)is bevestigd.
OPMERKING: Overpriming de spuit kan leiden tot te veel anesthesie te worden geleverd aan de muizen tijdens de operatie en resulteren in een verdoving overdosis. - Bereid de boren voor door het podiumslot te draaien, een boorbitadapter en een boorbit van 1 mm in elke boor te plaatsen en vergrendel de boor door de bit-lock handmatig aan te draaien.
- Bevestig boren op de stereotactische frames(figuur 1C).
- Clean Hamilton spuiten met 5 wisselwassingen van 1x DPBS, dan 70% ethanol, dan weer in 1x DPBS. Plaats opzij totdat het dier is voorbereid voor injectie.
- Stel de digitale injector in om te leveren met een snelheid van 0,4 μL/min en een doel van 2 μL. Deze snelheid en het volume zorgen voor een langzame introductie van tumorcellen in de hersenen, die de druk en de bijbehorende schade vermindert.
- Schakel alle anesthesiemachines, digitale Vernier-weegschalen en digitale injectoren in.
- Plaats muizen op stereotactische frames.
- Verdoof muizen (bijvoorbeeld isoflurane) met behulp van de eerder genoemde inductiekamer.
- Onderhoud muizen gedurende de hele procedure op een diep verdovingsvlak. De % anesthesie die door de machine wordt toegediend, is afhankelijk van een aantal factoren, waaronder: debiet, de mate van stimulatie en de lichaamstemperatuur. Controleer de muizen vaak tijdens de procedure voor diepte van anesthesie door te evalueren op ritmische ademhalingen (dier hijgt niet); gebrek aan palpebral reflex (fladderen van de oogleden wanneer gestimuleerd met een katoenen tip applicator); en gebrek aan teen knijpen (terugtrekking van de ledematen op de schadelijke prikkel van knijpen de tenen).
OPMERKING: Verschillende muizenstammen zullen een andere respons hebben op anesthesie. - Nadat muizen zich op een geschikt, diep verdovingsvlak bevinden, breng je de muizen over naar de stereotactische eenheid. Gebruik een verwarmingskussen terwijl de muis zich op de stereotactische machine bevindt om de lichaamstemperatuur en een geschikt verdovingsvlak te behouden.
LET OP: Om een laag profiel te bereiken gebruiken we luchtgeactiveerde handwarmers die in een omgekeerde pipettipbox zijn geplaatst (muishefbak in figuur 1D). - Open de mond van de muis en plaats tanden in de trog van de mondbalk op het neusstuk op het stereotactische frame(figuur 2A). Schuif de neuskegel over de neus/mond van de muis(figuur 2B).
- Plaats muizen met hun hoofd niveau aan de mond bar. Open de mond voorzichtig met het stompe uiteinde van een katoenen tip applicator en schuif op zijn plaats. Zorg ervoor dat de neuskegel volledig over de neus van de muis zit of anesthesie niet goed wordt geleverd. De neuskegel zal niet met de neus in gaan als de tanden niet in deze groef zitten (Inset Figuur 2A).
- Met behulp van een steriel wattenstaafje, plaats oogsmeermiddel op elk van de ogen van de muis. Toepassing van oogsmeermiddel vermindert het drogen van het hoornvlies en vermindert de kans op hoornvliesschade en postoperatieve complicaties in verband met hoornvliestrauma.
- Stabiliseer de schedel van de muis door de linkeroorbalk tegen de mediale canthus van het linkeroor te drukken en op zijn plaats te vergrendelen met behulp van de schroef op het stereotactische frame. Schuif vervolgens de rechteroorbalk tegen de mediale canthus van het rechteroor en schroef strak op het stereotactische frame(figuur 2B).
LET OP: Zorg ervoor dat het hoofd van de muis vlak en recht is bij het plaatsen van oorbalken. Als het hoofd krom of schuin is, zal de injectie op de verkeerde plaats in de hersenen zijn. De oorbalken moeten alleen worden aangedraaid totdat de schedel is geïmmobiliseerd bij stimulatie met matige handmatige indringende.
- Maak een calvarial venster.
- Bereid en reinig de hoofdhuid met 3x afwisselend passeert elk van een betadine oplossing en 70% ethanol. Vanwege de nabijheid van de chirurgische site aan de ogen, gebruik maken van de betadine oplossing over de chirurgische scrub.
- Met behulp van een steriele scalpel, maak een 3 mm incisie door de huid langs de centrale mediaan aspect van de schedel (na de sagittale hechting lijn). Bloeden bij de incisie moet minimaal zijn. Als dit gebeurt, breng dan consistente, stevige druk op de plaats van bloeden met een steriele katoenen tip applicator voor >30 seconden.
- Identificeer en oriënteer de boor loodrecht op de bregma (Figuur 2C), ervoor te zorgen dat de digitale Vernier schaal resetten naar nul.
- Verplaats de boor 2 mm laterale naar de sagittale hechting en 1 mm voorste naar de coronale hechting (figuur 2C). Zorg er voor dat de locatie links of rechts van de sagittale hechtingslijn consistent blijft voor alle dieren.
- Zet de boor op de hoogste snelheid. Zorg ervoor dat de huid wordt verwijderd van de boor om weefselschade veroorzaakt door de roterende bit te voorkomen en voorzichtig initiëren van de boor op de schedel. Boor een gat van ongeveer 0,5 mm diep door de calvaria, wat resulteert in het calvariale venster. Wees voorzichtig niet te verlagen van de boor te ver of het zal boren in de hersenen. Het laten vallen van steriele zoutoplossing op de boorplaats terwijl de boor in beweging is, kan elke warmte die door de machine wordt gegenereerd compenseren die thermische schade aan het omliggende weefsel kan veroorzaken.
- Zodra het calvarial venster is gemaakt, voorzichtig verhogen van de boor en verwijder het uit het stereotactische frame.
- Reinig de boorbits met 70% ethanol en zet apart als ze opnieuw worden gebruikt. Zo niet, verwijder boorbits en dompel in 70% ethanol.
- Het injecteren van kankercellen in de hersenen
- Bevestig de automatische injectorunit aan het stereotactische apparaat (figuur 1D).
- Trek >2 μL cellen grondig opnieuw op in 1x DPBS in een schone Hamilton spuit. Zorg ervoor dat u cellen onmiddellijk voor het vullen van de spuit opnieuw opschort om de vorming van klonteren te verminderen en een homogene celdrijfmest te garanderen. Het is ideaal om 6-8μL celvolume op te trekken om ervoor te zorgen dat er geen luchtzakken/bellen zijn.
- Plaats de Hamilton spuit op de injector apparaat, en prime de naald voor injectie door het verstrekken van een kleine hoeveelheid volume op een wegwerp steriele gordijnen om ervoor te zorgen dat de injector goed werkt. Veeg de spuit met 70% ethanol met een katoenen tip applicator(Figuur 1D, inzet). Dit verwijdert tumorcellen uit het buitenste vat van de naaldschacht waardoor het risico van tumorcel zaaien langs het injectiekanaal.
- Lijn de naaldpunt uit op het midden van het calvariale venster, bijna het aanraken van de blootgestelde cerebrum.
- Stel de digitale Vernier-schaal terug op nul.
- Steek de naald langzaam in een diepte van 3 mm in de hersenen en laat de naald ten minste 60 seconden in de hersenen blijven voordat u verdergaat. Dit tijdsbestek kan de hersenen parenchyma te voldoen rond de naald, die de druk van de rug en de mogelijke uitzetting van tumorcellen langs het naaldkanaal vermindert.
- Selecteer Uitvoeren op het injectorscherm om te beginnen met de levering van cellen naar de injectieplaats. Het duurt ongeveer 5 minuten om dit volume te injecteren. De langere tijd voor deze stap is het verminderen van secundaire schade veroorzaakt door injectiekracht op de hersenen parenchyma.
- Zodra de injectie protocol is voltooid, laat de naald te rusten in de hersenen voor ten minste 3 min, opnieuw waardoor de hersenen parenchyma te acclimatiseren aan de injectie.
- Na ten minste 3 min, de naald te verhogen uit de hersenen met een snelheid van 0,75 mm/min. Doe dit op een uiterst langzame en consistente manier om de tegendruk en tumor tracking van de naald darmkanaal te verminderen.
- Zodra de naald de hersenen heeft verlaten, verwijder voorzichtig de Hamilton spuit uit de injector en schoon zoals beschreven in stap 1.2.8.
- Breng warme beenwas aan op het calvariale venster met behulp van een steriel wattenstaafje. De beenwax fungeert als een fysieke barrière om de tumor in de schedel te houden.
- Sluit de incisie (bijvoorbeeld 5-0 PDS oplosbare hechtingen in een eenvoudig onderbroken patroon OF hechtclips, wat het meest comfortabel is voor de chirurg).
- Stop de toediening van anesthesie en verwijder de muis uit het apparaat door de oorbalken te ontgrendelen en uit te glijden, de neuskegel van de muis te schuiven en de tanden los te maken van de mondbalk.
- Plaats de muis in een schone kooi die zich op een warmere set op 37 °C voor herstel. Monitor muizen tijdens het herstel, wat meestal 10-15 minuten na anesthesie is gestaakt.
- Controleer na het terughalen van de muis op criteria voor vroegtijdige verwijdering, zoals bepaald door de IACUC van de gastinstelling.
2. Beeldvorming van magnetische resonantie
- Beheer gadolinium-gebaseerd contrastmiddel (100 μL/20 g lichaamsgewicht muis van 0,1 M MultiHance) aan muizen door standaard intraperitoneale injectie24 10-20 minuten voor beeldvorming. Verdoven vervolgens met behulp van een inductiekamer met een ingeademde verdovingsmiddel (bijvoorbeeld isoflurane) gemengd met 95% O2 en 5% CO2 (d.w.z. geleverd ruimteluchtgas).
- Plaats de muis op een verwarmde houder om de lichaamstemperatuur te behouden. Zet het hoofd vast met oorschelpen en een bijtbalk en plaats de houder in de 9.4 T magneet uitgerust met een muis brain surface coil. Handhaven anesthesie tijdens de beeldvorming tijd, een studie duurt meestal ongeveer 20 minuten per muis. Monitor de ademhalingsfrequentie en hartslag (~ 70 bpm) gedurende de hele procedure met behulp van een pneumatisch kussen en een klein dierbewakingssysteem.
- Verkrijg een localizerafbeelding en beeld de muishersenen aan met behulp van een T2-gewogen ZELDZAME sequentie (TR = 3500-4228 ms, TE=12 ms, RARE Factor = 8, FOV=2,0 x 2,0 cm, matrixgrootte = 256 x 256, 1 mm of 0,5 mm snijdikte, NA=2-4, 15-30 aaneengesloten plakjes) en contrast op basis van Gadolinium T1-gewogen ZELDZAME reeks (TR = 1200 ms, TE=7,5 ms, RARE Factor = 4 , FOV=2,0 x 2,0 cm, matrixgrootte = 256 x 256, 1 mm of 0,5 mm plakdikte, NA=2-4, 15-30 aaneengesloten plakjes).
- Post-imaging, plaats de muis in een kooi op een warmere set op 37 °C voor herstel.
3. Volumetrische tumormetingen
- Het verkrijgen van het totale tumorvolume
- Open MRI DICOM databestand in ImageJ, een beeldverwerkingssoftware die beschikbaar is als gratis download via de National Institutes of Health (https://imagej.nih.gov/ij/)25.
OPMERKING: ImageJ maakt het mogelijk om DICOM-bestanden te bekijken, die nodig zijn om de ingesloten pixelafmetingen te gebruiken voor tumorvolumeberekeningen (zie Afbeelding, Eigenschappen waar "eenheid van lengte" naar wens kan worden ingesteld (bijvoorbeeld mm)). - Gebruik de Freehand Selections tool om een overzicht rond de tumor te tekenen. Voer deze selecties uit in een donkere ruimte om de zichtbaarheid te verbeteren. Pas de helderheid/het contrast niet aan om de consistentie tussen de sessies te behouden.
- Selecteer onder het tabblad Analyseren de optie Meten om het gebied van het geselecteerde gebied te verkrijgen. Als in stap 3.1.1. een eenheid van millimeters is gekozen, wordt het gebied in kubieke millimeters gegeven. Sluit desgewenst de selectie uit de vrije hand in door ctrl+D teselecteren. De uitvoerkleur wijzigen door naar Bewerken | Opties | Kleur. De afbeelding converteren naar een RGB-afbeelding(afbeelding | Type | RGB-kleur) voordat het bestand wordt opgeslagen als .tif.
- Ga verder met het meten van alle tumorbevattende segmenten voor een individuele muis en kopieer waarden in een geschikt softwareprogramma voor gegevensanalyse (bijvoorbeeld Microsoft Excel of GraphPad Prism).
- Som de gebieden van elk segment om het totale tumorvolume te krijgen. Zorg ervoor dat u het gebied te corrigeren op basis van de dikte van de plak (gebied / dikte).
- Voer stap 3.1.1.-3.1.5. totdat alle muizen een totaal tumorvolume hebben. Gezien de enigszins subjectieve aard van het schetsen van de tumoren, is het ideaal als dezelfde methode meerdere keren wordt herhaald en gemiddeld technische fouten te verminderen.
- Als u schaalbalken wilt instellen, opent u DICOM-gegevensbestand en gaat u naar Analyseren | Hulpmiddelen | Schaalbalk. Aangezien de afmetingen al zijn ingebed in het DICOM-bestand, kiest u gewoon de gewenste lengte/breedte. Heimste naar een RGB-afbeelding(Afbeelding | Type | RGB-kleur) voordat het bestand wordt opgeslagen als .tif.
- Open MRI DICOM databestand in ImageJ, een beeldverwerkingssoftware die beschikbaar is als gratis download via de National Institutes of Health (https://imagej.nih.gov/ij/)25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 3 geeft een overzicht van de tumorvolumekwantificering voor een enkele muis op twee tijdstippen (dag 7 en dag 10) na de injectie van tumortumorcellen met murine. Voor dit experiment werden 50.000 DB7-cellen geïnjecteerd en de hersenen van het dier werden beoordeeld door MRI. Voor elke scan werden 30 plakjes (0,5 mm dikte) vastgelegd. Evaluatie van de 30 plakjes per scan bleek dat op dag 7 na de injectie, 5 plakjes tentoongesteld tumorlast (Figuur 3A) en op dag 10 na de injectie, 9 plakjes tentoongesteld tumorlast (Figuur 3B). Elk beeld werd geëvalueerd op tumorgebied zoals beschreven en het gebied voor elk frame is afgebeeld in figuur 3C. Het totale tumorvolume wordt bepaald en aangepast voor de dikte van de schijf. Figuur 4 toont de representatieve gegevens in publicatieformaat, waaronder representatieve afbeeldingen (figuur 4A) en een histogram van tumorvolume in de loop van de tijd (figuur 4B).
Figuur 1: Stereotactische en anesthesiesystemen. (A) Anesthesie inductiekamer opstelling in een biologische veiligheidskast. (B) Stereotactische verdovingsinstallatie die anesthesiebuizen van de verdovingsmachine tot de neuskegel op het stereotactische apparaat benadrukt (zie inzet in (C)). Groene pijlen geven geleverde verdovingsgas buizen, en blauwe pijlen geven gesooide gasbuizen. (C) Stereotactische standaard met boorbevestiging. Inzet toont verdovingsbuizen (groene en blauwe pijlen), mondbalk en oorbalken. (D) Stereotactic standaard met geautomatiseerde spuitpomp en muishefdoos. De doos is een omgekeerde pipet tip box met handwarmers gebruikt om de muis te verheffen tot de juiste hoogte en de lichaamstemperatuur te handhaven. Inzet toont de oriëntatie van de Hamilton spuit in het geautomatiseerde injectieapparaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Picturale weergave van de tandplaatsing op een stereotactisch apparaat, locatie van oorbalken en calvarial venster ten opzichte van Bregma. (A) De afbeelding van de maxillaire snijtanden in de tandinkeping op de neuskegel. (B) De locatie van de linker- en rechteroorbalken in de mediale canthus van de respectievelijke oren. (C) Een pijl geeft de bregma aan en een rode stip geeft de plaats aan waar het calvariale venster moet worden gemaakt (2 mm lateraal aan de bijspattaalhechting en 1 mm voorste aan de coronale hechting). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Voorbeeld van tumorvolumekwantificering voor een enkele muis over twee tijdstippen na injectie. Beelden van de plakjes met tumor op (A) dag 7 en (B) dag 10 na injectie. Geel duidt tumorgebied gekwantificeerd in ImageJ. (C) Slicegebied en totale volumetrische kwantificering zoals bepaald in ImageJ (*=correctie voor plakdikte (0,5 mm)). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Representatieve tumorvolumekwantificering in publicatieformaat. (A) Representatieve afbeeldingen met schaalbalken (=2 mm). (B) Histogram beeltenis van tumorvolume (mm3) voor de twee tijdstippen. Fold verandering wordt opgemerkt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van intracraniale injectie gevolgd door seriële monitoring met MRI biedt de unieke mogelijkheid om tumorgroei te visualiseren met tumor volume nauwkeurigheid na verloop van tijd. De toepassing van digitale beeldvormingsanalyse maakt interpretatie van hersenletsels voor tumorvolume, bloeding, necrose en reactie op de behandeling mogelijk.
Zoals bij elke procedure, zijn er belangrijke stappen die moeten worden gevolgd voor succes. Ten eerste, zorgvuldige setup van de stereotactische apparaten is noodzakelijk om het succes van deze techniek. Door de kleine omvang van de murine cranium kunnen lichte incongruencies leiden tot dramatisch verschillende effecten op de tumorgroei en het opnemen van proefdieren. Daarom is een goede opleiding over het gebruik van deze instrumenten noodzakelijk. Ten tweede zorgt een verwarmingsbron er tijdens de procedure voor dat het verdovingsvlak niet te laag valt. Lage lichaamstemperaturen plaatsen de dieren die plotseling onder narcose sterven als gevolg van een verminderde drugstofwisseling en een onbedoelde overdosis anesthesie en/of hersteltijden kunnen verlengen. De geprefabriceerde verwarmingskussens kunnen omvangrijk zijn en moeilijk te manoeuvreren op de stereotactische machine, maar kleine, luchtgeactiveerde handwarmers gekocht via een commerciële leverancier handhaven temperatuur en zijn klein genoeg om te worden geplaatst in de omgekeerde pipette tip box gebruikt om de muizen te verheffen tot het juiste niveau voor de stereotactische setup. Ten slotte, kwantificering is eenvoudig, maar vaak bepalen wat is tumor versus wat niet tumor kan een uitdaging zijn. Het wordt aanbevolen dat onderzoekers overleggen met imaging personeel om een nauwkeurige beoordeling te garanderen. Het is ook nuttig om tumor volume metingen meerdere keren te herhalen om fouten te verminderen. Ook moet elke studie worden geanalyseerd door dezelfde persoon voor alle beelden.
Het gepresenteerde protocol kan worden gewijzigd, afhankelijk van de voorkeuren van de gebruiker. Ten eerste is het gebruik van injecteerbare anesthesie (bijvoorbeeld ketamine/xylazine) gebruikelijk en kan zeker worden gebruikt in plaats van een ingeademde anesthesie (bijvoorbeeld isoflurane) afhankelijk van de voorkeur van de onderzoeker. Het is echter belangrijk om rekening te houden met de voordelen van een ingeademde anesthesie: (1) geen gereguleerde stof, (2) het niveau van anesthesie kan in de loop van de tijd worden aangepast (in vergelijking met een dosis ketamine vooraf bepaald door het gewicht van dieren), en (3) het herstel is relatief snel in vergelijking met ketamine/xylazine. Ten tweede biedt het gebruik van de automatische boor een hoge mate van nauwkeurigheid, maar voegt tijd toe aan de procedure, gezien de tijd die nodig is om het apparaat op te zetten en af te breken. Het is zeker redelijk om een vrije handtechniek te gebruiken indien gewenst.
Dit protocol maakt gebruik van zowel een stereotactische setup als het gebruik van MRI, beide worden geassocieerd met hogere kosten. Alternatieve methoden voor intracraniale injectie zijn eerder beschreven15,16,17,18,19. Sommige van deze methoden maken ook gebruik van het gebruik van bioluminescente beeldvorming om tumorgroei te controleren gedurende de studie indien gewenst.
Zoals hierboven vermeld, is het belangrijk om het juiste celnummer voor injectie te bepalen, afhankelijk van het modelsysteem dat wordt bestudeerd. Injectie van murinecellen in een immunocompetent gastheer heeft de neiging om minder cellen nodig dan injectie van menselijke cellen in een immunodeficiënte gastheer. Post-injectie tumor last monitoring door MRI helpt bepalen of het aantal geïnjecteerde cellen geschikt is als het mogelijk is om te zien wanneer tumoren een bepaald volume te bereiken en op welk punt muizen beginnen met het bereiken van vroege verwijdering criteria.
Het nut en de brede toepassing van MRI voor niet-invasieve monitoring is gebruikt door anderen in kleine dieronderzoek studies26. Terwijl MRI biedt verschillende voordelen zoals reeds besproken, er zijn inderdaad beperkingen vermeldenswaard. Ten eerste is het gebruik van de machine afhankelijk van het personeel van de kernservice en de beschikbaarheid van de machine. Ten tweede kan gebruik kostbaar zijn. Als dit betreft, het gebruik van bioluminescente beeldvorming is een geldig alternatief voor tumor monitoring17,19. Ten derde kan het contrast tussen tumor en het omringende weefsel (d.w.z. hersenen) variëren tussen verschillende cellijnen; deze methode biedt echter de grootste kans om tumor in vivo te identificeren zonder celetikettering. Ten slotte is MRI beperkt in zijn resolutie, die tumorvolumegegevens kan scheeftrekken naar waar het lijkt alsof er sprake is van exponentiële groei terwijl de groei in feite lineair is. Er is ook een maximaal tumorvolume dat kan worden verkregen via MR-beeldvorming, maar dit is minder een punt van zorg omdat het onwaarschijnlijk is dat een muis een tumor aan de bovenkant kan overleven. De tumor detectie limiet hangt af van het type en de locatie van de tumor in de hersenen, of er bloed-hersenbarrière lekkage, en of de tumor is goed omschreven of is infiltreren in het omliggende weefsel. Het is ook afhankelijk van de vraag of het een contrastverbeterende tumor is en welk type mr-beeldvormingsprotocol wordt gebruikt. In onze ervaring, met een in-plane voxel grootte van 78x78 μm en een 0,5 mm slice dikte, kunnen we een 0,5 mm diameter tumor routinematig observeren met een minimum limiet rond 0,3 mm.
Met betrekking tot intracraniale injectie, zijn er verschillende beperkingen te overwegen. Ten eerste weerspiegelen intracraniale injecties de gemetastaserende cascade niet in die zin dat ze de ontwikkeling van uitgezaaide eigenschappen binnen de primaire tumor, intravasatie in de bloedbaan en penetratie door de bloedhersenbarrière11volledig omzeilen. Ten tweede, door direct te injecteren in de hersenen deze methode veroorzaakt ontsteking, die bevindingen geassocieerd met neuro-ontsteking kan verstoren. Ten slotte kan directe injectie op deze locatie resulteren in een snelle groei over een korte periode van tijd. Het is cruciaal om muizen te controleren op neurologische symptomen, waaronder verlamming van de achterpoot, lethargie en ataxie.
Alle overwogen, injectie direct in de hersenen zorgt voor monitoring van tumor nemen tarief, die de onderzoeker kan informeren over de groei specifiek binnen deze gemetastaseerde site evenals interactie met de hersenen gemetastaseerde micro-omgeving. Bovendien stelt het monitoren van tumorlast in de loop van de tijd de onderzoeker in staat om veranderde tumorfenotypen, veranderde micro-milieufenotypen en reactie op experimentele therapeutische strategieën direct te vergelijken. Gezien de relatief lage incidentie van zowel spontane als experimentele hersenmetastase in muismodellen, is de intracraniale techniek inderdaad een waardevol hulpmiddel.
Kanker metastase naar de hersenen is een catastrofale diagnose met een slechte respons op de huidige behandeling strategieën1,11,27. Terwijl borstkanker is de belangrijkste oorzaak van de hersenen metastase bij vrouwen en de focus hierin, longkanker is de meest voorkomende oorzaak van hersenmetastase bij alle kankerpatiënten2. Verder, hersenmetastasen zijn gemeld bij patiënten gediagnosticeerd met een scala van vaste tumor types, en de verwachting is dat de incidentie zal blijven toenemen als therapieën blijven verbeteren voor de behandeling van extracraniële ziekte. Dus, terwijl de focus van dit voorstel ligt op BCBM, intracraniale kanker injectie en MRI-analyse is van toepassing op het bestuderen van hersenmetastasen van andere vaste tumor types evenals primaire hersentumoren. Met behulp van het intracraniale injectiemodel van hersenmetastase kunnen onderzoekers ziekten recapituleren in grote cohorten van dieren om een verscheidenheid aan onderzoeksvragen te testen in de hoop betere patiëntenzorg te krijgen. Door dit model te koppelen aan digitale beelden met hoge resolutie verkregen door MRI, is het mogelijk om het tumorvolume op meerdere tijdstippen te monitoren en tumorrespons op therapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen.
Acknowledgments
Representatieve gegevens werden gefinancierd via het National Cancer Institute (K22CA218472 tot G.M.S.). Intracranial injecties worden uitgevoerd in de Ohio State University Comprehensive Cancer Center Target Validation Shared Resource (Directeur - Dr Reena Shakya) en MRI is voltooid in de Ohio State University Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource (Directeur - Dr Kimerly Powell). Beide gedeelde middelen worden gefinancierd via de OSUCCC, de OSUCCC Cancer Center Support Grant van het National Cancer Institute (P30 CA016058), partnerschappen met de Ohio State University hogescholen en afdelingen, en gevestigde chargeback systemen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Materials | |||
| Betadine | Purdue Products | 19-027132 | Povidone-iodine, 7.5% |
| Bone Wax | Surgical Specialities | 903 | Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate |
| Buponorphine SR-Lab | ZooPharm | N/A | Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation |
| Cotton tip applicators | Puritan | 25-806 10WC | Sterile long stemmed cotton tip applicators |
| Eye Ointment | Puralube | 17033-211-38 | Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment |
| Handwarmers | Hothands | HH2 | Air-activated heat packs |
| Ibuprofen | Up & Up | 094-01-0245 | 100mg per 5mL in liquid suspension |
| Isoflurane | Henry Schein INC | 1182097 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| Scalpels | Integra Miltex | 4-410 | #10 disposable scalpel blade |
| Skin Glue | Vetbond | 1469SB | Skin safe wounds adhesive |
| Sterile Dressing | TIDI Products | 25-517 | Individually packed sterile drapes |
| Suture | Covidien | SP5686G | 45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture |
| Stereotaxic Unit | |||
| High Speed Drill (Foredom) | Kopf | Model 1474 | Max of 38,000 RPM |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | Mouth bar with teeth hole and nosecone |
| Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 922 | Ear bars suitable for mouse applications |
| Stereotaxic Instrument | Kopf | Model 940 | Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor |
| Injector | |||
| Injector Needle and syringe | Hamilton | 80366 | 26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe |
| Legato 130A automated Syringe Pump | KD Scientific | P/N: 788130 | Programmable touch screen base with automated injector |
| Anesthesia Machine | |||
| SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer | Kent Scientific | SS-01 | Digital anesthesia machine |
| SomnoSuite Starter Kit for mice | Kent Scientific | SOMNO-MSEKIT | Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters |
References
- Lin, X., DeAngelis, L. M. Treatment of Brain Metastases. Journal of Clinical Oncology. 33 (30), 3475-3484 (2015).
- Ostrom, Q. T., Wright, C. H., Barnholtz-Sloan, J. S. Brain metastases: epidemiology. Handbook of Clinical Neurology. 149, 27-42 (2018).
- Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 8 (6), 344-356 (2011).
- Steeg, P. S., Camphausen, K. A., Smith, Q. R. Brain metastases as preventive and therapeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 352-363 (2011).
- Valiente, M., et al. The Evolving Landscape of Brain Metastasis. Trends in Cancer. 4 (3), 176-196 (2018).
- Wang, H., et al. The prognosis analysis of different metastasis pattern in patients with different breast cancer subtypes: a SEER based study. Oncotarget. 8 (16), 26368-26379 (2017).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- Gong, Y., Liu, Y. R., Ji, P., Hu, X., Shao, Z. M. Impact of molecular subtypes on metastatic breast cancer patients: a SEER population-based study. Scientific Reports. 7, 45411 (2017).
- Kim, Y. J., Kim, J. S., Kim, I. A. Molecular subtype predicts incidence and prognosis of brain metastasis from breast cancer in SEER database. Journal of Cancer Researchearch and Clinical Oncology. 144 (9), 1803-1816 (2018).
- Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
- Meisen, W. H., et al. Changes in BAI1 and nestin expression are prognostic indicators for survival and metastases in breast cancer and provide opportunities for dual targeted therapies. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (1), 307-314 (2015).
- Russell, L., et al. PTEN expression by an oncolytic herpesvirus directs T-cell mediated tumor clearance. Nature Communications. 9 (1), 5006 (2018).
- Thies, K. A., et al. Stromal platelet-derived growth factor receptor-beta signaling promotes breast cancer metastasis in the brain. Cancer Research. , (2020).
- Kramp, T. R., Camphausen, K. Combination radiotherapy in an orthotopic mouse brain tumor model. Journal of Visualized Experiments. (61), e3397 (2012).
- Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. (91), e52017 (2014).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Donoghue, J. F., Bogler, O., Johns, T. G. A simple guide screw method for intracranial xenograft studies in mice. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Fink, J. R., Muzi, M., Peck, M., Krohn, K. A. Multimodality Brain Tumor Imaging: MR Imaging, PET, and PET/MR Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (10), 1554-1561 (2015).
- Borges, A. R., Lopez-Larrubia, P., Marques, J. B., Cerdan, S. G. MR imaging features of high-grade gliomas in murine models: how they compare with human disease, reflect tumor biology, and play a role in preclinical trials. American Journal of Neuroradiology. 33 (1), 24-36 (2012).
- Prabhu, S. S., Broaddus, W. C., Oveissi, C., Berr, S. S., Gillies, G. T. Determination of intracranial tumor volumes in a rodent brain using magnetic resonance imaging, Evans blue, and histology: a comparative study. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 47 (2), 259-265 (2000).
- Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical & Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
- Journal of Visualized Experiments. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2020).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Lee, D., Marcinek, D. Noninvasive in vivo small animal MRI and MRS: basic experimental procedures. Journal of Visualized Experiments. (32), (2009).
- Shah, N., et al. Investigational chemotherapy and novel pharmacokinetic mechanisms for the treatment of breast cancer brain metastases. Pharmacological Research. 132, 47-68 (2018).
