Summary
Dette arbejde præsenterer en mikroskopi metode, der tillader levende billeddannelse af en enkelt celle af Escherichia coli til analyse og kvantificering af stokastisk adfærd syntetiske gen kredsløb.
Abstract
Protokollen udviklet her tilbyder et værktøj til at muliggøre computer sporing af Escherichia coli division og fluorescerende niveauer over flere timer. Processen starter med screening for kolonier, der overlever på minimale medier, idet det antages, at kun Escherichia coli huser den korrekte plasmid vil være i stand til at trives i de specifikke forhold. Da processen med at opbygge store genetiske kredsløb, der kræver samling af mange DNA-dele, er udfordrende, er kredsløbskomponenter ofte fordelt mellem flere plasmider ved forskellige kopinumre, der kræver brug af flere antibiotika. Mutationer i plasmid kan ødelægge transskription af antibiotikaresistens gener og indskyde med ressourcer forvaltning i cellen, der fører til nekrose. Den valgte koloni er sat på en glasbundet petriskål, og et par fokusplaner er udvalgt til mikroskopisporing i både lyse felt- og fluorescerende domæner. Protokollen opretholder billedfokus i mere end 12 timer under indledende forhold, der ikke kan reguleres, hvilket skaber nogle få vanskeligheder. For eksempel begynder døde celler at akkumulere i linsernes fokusområde efter et par timers billeddannelse, hvilket får toksiner til at opbygge og signalet til at sløre og forfalde. Udtømning af næringsstoffer introducerer nye metaboliske processer og hindrer kredsløbets ønskede respons. Eksperimentets temperatur sænker effektiviteten af inducere og antibiotika, hvilket yderligere kan skade signalets pålidelighed. Den minimale mediegel krymper og tørrer, og som følge heraf ændres det optiske fokus over tid. Vi udviklede denne metode til at overvinde disse udfordringer i Escherichia coli, svarende til tidligere værker, der udvikler analoge metoder til andre mikroorganismer. Derudover tilbyder denne metode en algoritme til at kvantificere den samlede stokastiske støj i uændrede og ændrede celler og finder ud af, at resultaterne er i overensstemmelse med flowanalysatorforudsigelser som vist ved en lignende variationskoefficient (CV).
Introduction
Syntetisk biologi er et tværfagligt område, der er opstået i det seneste årti og har til formål at omsætte tekniske designprincipper til rationelt biologisk design1,2,3, i et forsøg på at opnå multisignalintegration og behandling i levende celler til forståelse af grundforskningen4,5, diagnostiske, terapeutiske og bioteknologiske applikationer6,7,8,9,10. Vores evne til at kvantificere input-output respons syntetiske gen kredsløb er blevet revolutioneret af de seneste fremskridt inden for encellet teknologi, herunder flow analysator og levende celle billeddannelse ved hjælp af automatiseret time-lapse mikroskopi11. En flowanalysator bruges ofte til at måle reaktionen fra disse kredsløb i stabil tilstand1,12, og omvendt mikroskopi bruges til at måle den dynamiske respons fra syntetiske genkredsløb på niveau med en enkelt celle3. For eksempel involverede et af de tidlige værker i syntetisk biologi opførelsen af genetiske oscillatornetværk i levende celler ved hjælp af negative feedback-sløjfer med en forsinkelse3. Senere blev de genetiske oscillatorkredsløb anvendt til at forstå metabolisk kontrol i det dynamiske miljø i levende celler4. Automatiseret time-lapse mikroskopi er en metode til at karakterisere sådanne kredsløb. Vi hypotese, at værten celler, Escherichia coli, synkronisere, når der dannes mikrokolonier, så måling af signal og beregning af støj uden at spore nøjagtige mor-datter relationer.
Støj er et grundlæggende, iboende aspekt af biologiske systemer, der ofte stammer fra flere kilder. Overvej for eksempel biokemiske reaktioner, der involverer signaler, der stammer fra transport af diskrete tilfældige bærere som diffusion af proteiner13. Disse signaler spredes med tilfældige udsving14. Andre støjkilder er ressourcetilgængelighed, celledeling og variationer i miljøforhold som temperatur, fugtighed og tryk. Biologiske signaler, der spredes i syntetiske genkredsløb, har ofte et meget lavt signal til støjforhold (SNR), hvilket forstyrrer sådanne kredsløbs ydeevne. Derfor er genetisk kredsløbsdesign fortsat et af de mest udfordrende aspekter af genteknologi15. I modsætning til de fleste metoder, der kun beregner middelgenudtrykket (målt over hele cellepopulationen), overvejes variansen af det målte signal for at konstruere forudsigelig adfærd gennem syntetiske gennetværk12. Som sådan spiller variabilitets- eller støjniveauerne i proteinudtrykket en dominerende rolle i design og ydeevne af analoge og digitale genkredsløb1,16,17.
Der er udviklet mange metoder til at kvantificere celle-til-celle-variabilitet, herunder i Escherichia coli3,7,18. Disse metoder bruges ofte til at studere genaktivering og metaboliske veje, men med mindre fokus på studiet af stokastisk støjdynamik, som måling og disentangling specifikke støjkilder, især for genetiske kredsløb i levende celler, hvor dette er en grundlæggende udfordring19,20,21. Flere faktorer, både arvet til selve kredsløbet (iboende) og afledt af værtscellerne (ydre), kan forstyrre den kontinuerlige ydeevne af genetiske kredsløb. I dette papir udviklede vi en protokol, der har til formål at kvantificere den samlede støj i Escherichia coli-celler, herunder de iboende og ydre støjkilder6,22. Ved at kvantificere den samlede støj og derefter evaluere SNR23kan designet af genkredsløb forbedres. Denne metode kan ændres for at måle uafhængige støjkilder separat ved at overvåge flere fluorescerende proteiner6,20. For den protokol, der er beskrevet her, holder vi miljøforholdene godt kontrolleret og måler løbende cellernes aktivitet uden påvirkning af eksterne faktorer. Vi måler signalet fra fluorescerende proteiner i enkelte celler over tid og samtidig billede dem under en agarose substrat. De resulterende billeder analyseres ved hjælp af laboratoriets brugerdefinerede MATLAB.
Ideelt set vil kontinuerlig måling af realtidsaktiviteten af fluorescerende proteiner inde i en celle producere nøjagtige data gennem cellernes vækst og opdeling. Det er imidlertid en udfordring at erhverve sådanne data. Dette skyldes nedbrydning af fluorescerende proteiner, kendt som fotoblegning7, når de udsættes for stråling i excitationsprocessen. Desuden er Escherichia coli celler også følsomme for excitation, hvilket kan føre til fototoksicitet7. Begge problemer begrænser mængden af fotorammer, der kan erhverves, og tiden mellem erhvervelser. Det substrat og de mellemtyper (f.eks. lysogene bouillon), der bruges til at dyrke cellerne under billeddannelse, spiller også en afgørende rolle. Vi anbefaler på det kraftigste at bruge minimalt medium, hvilket minimerer ikke-fluorescerende baggrund og forlænger celledelingstiden.
Desuden skal prøven fremstilles under hensyntagen til følgende krav (1) Lav celledelingshastighed giver mulighed for mindre hyppige eksponeringer for nøje billeddannelse af opdelingscyklussen og reducerer sandsynligheden for fototoksicitet og fotobleaching. Vi indstiller erhvervelsestiden til omkring halvdelen af den forventede mitosetid (2) Lav celletæthed i begyndelsen af eksperimentet giver mulighed for bedre ensartethed og sporbarhed af division. Celletætheden påvirkes af fortyndingsforholdet for Escherichia coli-cellerne, som er en væsentlig parameter for denne protokols succes og skal bestemmes for hvert laboratorium. For at fastslå forholdet bør hver ny Escherichia coli-stamme eller de anvendte medier være forsynet med vækstratediagrammer (supplerende figur 1). Der er opnået et passende forhold, hvis cellerne kan vokse uden yderligere rysten efter en kort inkubation fra en indledende tæthed på ca. OD600nm = 0,1. Celler i denne fase vil opdeles i henhold til miljøtemperaturen kun (3) Begrænsning af cellebevægelse: cellebevægelse afhænger stærkt af substrat (agarose pad) fasthed. Substratet fasthed afhænger af mængden af total agarose og gel størkning tid. Geler kan ikke overlades til størkne natten over ved stuetemperatur, da Escherichia coli vil gennemgå mitose. Andre faktorer, der påvirker substratstabiliteten, omfatter mængden af vand i prøven og fugtigheden. Yderligere spørgsmål behandles i detaljer i de repræsentative resultater. Denne protokol indeholder mange detaljer og flytter gradvist fra et trin til et andet. Protokollen giver lang stabilitet til billedeksperimenter og giver et grundlæggende billedbehandlingsværktøj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af medier og kultur
- Forbered stamopløsning på 1.000x Carbenicillin (50 mg/mL) eller relevant antibiotikum.
- . Afvejes 0,5 g karburator. Der tilsættes 10 mL steril H2O. Opløses fuldstændigt.
- Karburatorbestanden steriliseres gennem et 0,22 μm sprøjtefilter. Antibiotisk opløsning til aliquot og opbevares ved -20 °C.
- For at tilberede lysogene bouillonplader (LB) blandes 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2,5 g gærekstrakt og 7,5 g Bacto agar med 0,5 L steril H2O. Autoklave opløsningen ved 121 °C i 20 min.
- Den smeltede gelblanding nedsænkes delvist i et vandbad på 50 °C. Der tilsættes 1.000 μL carbenicillin (50 mg/mL).
- Forbered petriskåle i et sterilt miljø. Lad pladerne indstille, før de opbevares i køleskabet.
- Til M9 minimale medier fremstilles separate stamopløsninger af følgende: 5x M9 salte (56,4 g/L), 2 M glukose og 2% biotinfri casaminosyrer. Autoklave opløsningerne ved 121 °C i 20 min.
- For at forberede 5 Petri plader blandes 1125 mg lav smeltende agar og 400 mg agar med 89,2 mL minimale medier (1x M9). Der tilsættes 10 mL 2% casaminosyrer (2% [vol/vol]) i en 250 mL Erlenmeyer kolbe.
BEMÆRK: Sørg for at hælde mediet på kolbens indre læber. - Mikrobølge opløsningen i korte byger på 3 til 4 sekunder. Gentag dette, indtil opløsningen er klar.
BEMÆRK: Sørg for ikke at nå kogepunktet. - 250 mL Erlenmeyer-kolben anbringes i et varmtvandsbad (60 °C) for yderligere blanding ved diffusion, og den afkøles, indtil temperaturen falder til ca. 45-50 °C.
- Tænd flammen på pladen-hældende bænk.
- Tilføj hurtigt alle løsninger i følgende rækkefølge:
800 μL på 50% glycerol (0,4% [vol/vol])
100 μL thiamin (B1)
1100 μL glucose (2M)
100 μL carbenicillin (50 mg/mL). - Hvirvel Erlenmeyer kolben for at sikre jævn fordeling af alle ingredienser i hele agaren.
- Åbn en plade ad gangen ved siden af flammen og begynd at hælde.
- Lad pladerne stå på bænken i et par minutter, indtil den første størkning.
- Vend pladerne på hovedet for at forhindre vandkondensation i at dryppe ned på gelen.
- Lad pladerne størkne ved stuetemperatur i ca. 2 timer.
- Når pladerne er størknet og tørret, kan de opbevares ved 4 °C i ca. 3 måneder.
2. Bakteriestammer og plasmider konstruktion
BEMÆRK:Det genetiske kredsløb indeholder en del; et grønt fluorescerende protein (GFP) drevet af en PtetO-promotor, der resulterer i konstituerende udtryk. Alle plasmider i dette værk blev konstrueret ved hjælp af grundlæggende molekylære kloningsteknikker og blev omdannet til Escherichia coli 10β ved hjælp af en standard varmechokprotokol24. Den endelige konstruktion blev omdannet til Escherichia coli MG1655 vilde type stamme til test.
- Transformer den ønskede plasmid til Escherichia coli MG1655 celler med standard varmechok protokol24.
- Vokse de transformerede celler på en LB agar plade natten over ved 37 °C.
BEMÆRK: Petriskålene kan opbevares fra trin 2.2 op til 3 dage til mikroskopibrug. - Pod en enkelt koloni i 5 mL LB bouillon suppleret med de relevante antibiotika i et glasrør.
- Celler vokses ved 37 °C med 250 omdrejningshastighed i inkubatoren i 2 timer, indtil væsken er overskyet.
- Der fremstilles 1 ml fortyndingsopløsning på følgende måde:
892 μL minimale medier (1x M9)
8 μL på 50% glycerol (0,4% [vol/vol])
100 μL af 2% Casamino-syrer (0,2% [wt/vol])
1 μL thiamin (B1)
11 μL glucose (2 M)
1 μL af relevant antibiotika- Bland og spin ned.
- Cellekulturen (1:30) fortyndes fra trin 2.4 til et 2 ml rør ved at tilsætte 30 μL Escherichia coli-vækst til 1000 μL fortyndingsopløsning (trin 2.5).
- Røret inkuberes i 1 time med omrystning (250 omdrejninger) ved 37 °C.
- Vokse 40 μL - 60 μL på M9 plader tilberedt i trin 1.10. Pladen inkuberes ved 37 °C natten over.
BEMÆRK: Den optiske tæthed (OD600nm)til plating skal være omkring 0,1. - Placer op til tre 35 mm glasbundplader på bænken.
BEMÆRK: Sørg for, at pladens glas har den korrekte tykkelse til de anvendte mikroskoplinser. - Forbered kulturen til såning på gelplader, gentag trin 2.3 til 2.6 for kolonier fra plade tilberedt ved trin 2.9 mikroskopmålinger.
- Forbered følgende opløsning for at lave tre mikroskopplader.
- Forvarm vandbadet til 60 °C.
- Der blandes 112,5 mg lav smeltende agar og 40 mg agar med 8,92 mL minimale medier (1x M9) og tilsættes 1 mL af 2% casaminosyrer (0,2% [vol/vol]) i en 25 mL Erlenmeyer kolbe.
BEMÆRK: Sørg for at hælde mediet på kolbens indre læber.
- Mikrobølge opløsningen i korte byger på 2 til 3 sekunder. Gentag dette, indtil opløsningen er klar.
BEMÆRK: Sørg for ikke at nå kogepunktet. - 25 mL Erlenmeyer-kolben anbringes i et varmtvandsbad (60 °C) for yderligere blanding ved diffusion, og den afkøles på bænken, indtil temperaturen falder til ca. 45-50 °C.
3. Fremstilling af agarose puder
- Ren bænk med 70% ethanol. Stræk tape på den rensede bænk. Sørg for, at båndet er glat og jævnet med jorden.
- Forbered to coverlips: en på båndet og en anden i nærheden. Gør et dæklid klar.
- Kolben (tilberedt ved trin 2.14) fjernes fra vandbadet, ydersiden af kolben tørres af og afkøles, indtil temperaturen falder til ca. 45-50 °C.
- For at lave gelopløsningen blandes hurtigt alle løsningerne i følgende rækkefølge:
80 μL på 50% glycerol (0,4% [vol/vol])
1 mL af 2% casaminosyrer (0,2% [wt/vol])
10 μL thiamin (B1)
110 μL glucose (2 M)
10 μL relevant antibiotika. - Hæld 1,5 mL af gelen på coverlip og dække det med det andet stykke gør en "sandwich".
- Returner Erlenmeyer til varmtvandsbadet. Dæk sandwichen med låget og sæt timeren i 20 minutter.
- Samtidig inkuberes røret fra trin 2.11 i 1 time ved 37 °C med omrystning (250 omdrejninger)
- Efter 20 minutter vende sandwich (trin 3,5), dække det og lad hvile i 1 time.
BEMÆRK: For bedre resultater skal "sandwichen" hvile ved 4 °C i trin 3.8. - Frø Escherichia coli kultur fra trin 3.7 ved at pipettere prøven på 35 mm skålen.
BEMÆRK: Pipettering af 6 μL celler som separate små dråber giver de bedste resultater. - Lad dråberne tørre i mindst 15 minutter og op til 30 minutter.
- Smør sandwichens størkne gel ud fra trin 3.8 ved at skubbe coverlipet væk.
- Skær sandwich i små individuelle puder med biopsi punch eller spids.
- Læn den forsigtigt på prøven (trin 3.9). Lad skålen stå i 20 minutter på bænken.
4. Forberedelse af prøven til mikroskopibilleddannelse
- Kolben tages ud af vandbadet fra trin 3.6. Kolbens yderside tørres af og afkøles til stuetemperatur (25 °C).
BEMÆRK: Kolben tages af ved trin 4.1 ca. 3 minutter, før timeren slutter. - Hæld 3 mL af gelen konstant til pladens omkreds i en cirkulær bevægelse. Lad det størkne i et par minutter.
- Forsegl plader med tape og gennembor flere huller med 25 G nål. Vend alle opvasken for at forhindre, at vandkondensation drypper ned på gelen.
- Alle retterne inkuberes ved 4 °C i 30 minutter for at muliggøre fuld størkning, samtidig med at cellemideose forhindres.
BEMÆRK: Lad prøverne stå ved 4 °C til efterfølgende målinger, højst en dag. - Start mikroskopet pr. producentinstruktion.
- Find den oprindelige fokus ved hjælp af laveste forstærkning linse og engagere automatisk fokus system (AFS).
- Brug olien, hvis det er nødvendigt, drukne linsen med olie og sprede den forsigtigt ved at flytte pladen med en platform controller (ikke manuelt) og AFS kan aktiveres igen.
- Brug relativt tværsnit i Z-retning efter standardforslag til tværsnit i Z-trin.
BEMÆRK: Vi tog lyse feltbilleder hvert 5. minut og fluorescerende billeder hvert 20. minut. Nogle gange skal fokus justeres i løbet af de første 30 minutter. Forvarmning af mikroskop inkubator boks og olie, mens køling prøven tendens til at bidrage til at reducere det oprindelige tab af fokus.
5. Dataanalyse
BEMÆRK: For at kunne behandle mikroskopidata har vi designet en computerbaseret software i MATLAB. Denne software letter identifikationen af cellegrænser fra lyse felt tiff billeder og segmenter og sorterer celler efter område. Outputtet af denne billedanalyse kan bruges som maske på fluorescerende tiff-billeder for at udlede celleintensitetsniveauer og annullere artefakter i det fluorescerende domæne, f.eks. Den udviklede software var inspireret af lignende værker7,25,26,27,28,29,30 og giver en elegant løsning skræddersyet til laboratoriet.
- Definer først følgende parametre i main_code.m.
- Definer mappen med anskaffelsesbillederne.
- Definer billedtidsperioden - trinnet tidstrin for lysfeltkanal i minutter.
- Definer GFP-frekvensen - anskaffelseshastigheden for GFP-billeder.
- Definer mikroskopopløsningen (dvs. hvor mange pixel er lig med 1 μm).
- Definer histogrammets placeringsområde - celleområdeområde.
BEMÆRK: Processen med at klassificere dataene efter celleområde svarer til principperne for gating i flow cytometry dataanalyse. Gates er placeret omkring populationer af celler med fælles karakteristika, som regel fremad spredt og side spredt, at isolere og kvantificere disse populationer af interesse. Mikroskopi gør det muligt at gate, undersøge og kvantificere flere cellegrupper. - Definer convolution kerne (3,3) - denne parameter registrerer cellegrænser ved global tærskelværdi (count_cells.m).
BEMÆRK: Denne opsætning er kun nødvendig, når du skifter laboratorium eller mikroskop. Software kræver, at input lyse felt kanal, der skal mærkes med indeks c1, fluorescens kanal mærket som c2.
- Kør main_code.m, som kører alle andre scripts automatisk (count_cells.m, cell_growth_rate.m).
- Programmet segmenterer automatisk lyse feltbilleder (se Supplerende figur 2-4).
- Kombiner segmenteringsbilledet med fluorescerende billede (GFP) for at udtrække intensitetsniveau pr. celle.
- Beregne grafen over mængden af celler efter tid og passe i henhold til eksponentiel vækst.
- Beregn middel- og standardafvigelsen (STD) for hvert celleområdeområde.
- Beregn signalet til støjforholdet (SNR) for hvert celleområdeområde.
- Plot og passer til fordelingen af mængden af celler efter intensitet.
- Beregn koefficienten for afvigelse (CV), og sammenlign med flowanalysatordata.
BEMÆRK: Software vil give som output den endelige segmentering billeder til justering af conv_kernel i en ny mappe "yourfolder / Segmenteret". Software vil give som output graferne i en ny mappe "yourfolder / Grafer.
- Hvis du vil sammenligne mellem eksperimenter, skal du bruge compare_experiments.m.
- Definer mapper til de gemte grafer og adressen på mappen \CompareResult.
- Kør filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Softwaren analyserer lyse felt domæne billeder, der er off-white og sort. Den Escherichia coli vil ligne sorte aflange former på en off-white baggrund og dynamisk område af luminans bør vise en spike i centrum(Figur 1). I fluorescerende billeder celler kan have en lille glorie, men individuelle celler med aflange former kan stadig løses. En mitosehændelse skal først påvises efter 30 minutter. Mikroskop fokus bør forblive stabil over tid, og selv om cellerne kan bevæge sig langsomt i løbet af disse 30 minutter, er det usandsynligt, at de forlader synsfeltet. Et sådant eksperiment vil blive betragtet som godt og kan ses i figur 2. Celler kan være svære at registrere i det lyse feltdomæne ved lav forstørrelse. Vi anbefaler at etablere den gennemsnitlige fokusafstand med et højt kopinummer (HCN) plasmid, da det er let at bemærke ved lav forstørrelse. Indstil den gennemsnitlige afstand, mens du måler et lavt kopinummer (LCN) plasmid ved den høje forstørrelse på forhånd. Denne fokusafstand afhænger hovedsageligt af pladerne, mikroskopisystemet og olien og ikke tykkelsen af gel eller Escherichia coli-stammen.
Ved tilpasning af denne protokol til andre laboratorier kan følgende problemer opstå (1) Escherichia coli plader (prøver), der er udarbejdet ved et forkert fortyndingsforhold, kan vise uændrede antal celler (figur 3 og figur 4) (2) Prøver tilberedt uden forsegling af pladen kan vise overdreven svind. Dette kan ses som celler afdrift (Figur 3) eller forårsage tab af fokus (Figur 5) (3) Nogle prøver kan udvise langsomt skiftende 'faste' celler (i sort) på en baggrund af svømmeceller (i hvidt). Dette skyldes sandsynligvis en våd prøve, og den stabiliseres normalt, da det overskydende vand absorberes af gelen (Supplerende Video 1) (4) Prøver, der ikke udviser celler efter et par minutters opvarmning, kunne være blevet forberedt forkert, sandsynligvis på grund af: (I) Gel blev hældt, mens den stadig var for varm, (II) beskyttelseshætte blev glemt, (III) minimal medie mangler en ingrediens, (IV) forkert celletæthed, og (V) gel blev forseglet for tæt. Det er vigtigt at slå huller for at tillade gasudveksling på bekostning af gel krympning (Figur 5) og (VI) celler kan også indrykke gelen i søgen efter næringsstoffer, stabling oven på den anden, kompromittere cellen monolayer effektivt forhindre påvisning af celler og måling af pålidelige fluorescerende signal (Supplerende figur 5).
Vi har målt tre kredsløb i dette arbejde. For det første en konstituerende promotor, der regulerer GFP vist i figur 6. For det andet en konstituerende promotor, der regulerer super-fold GFP31 (sfGFP) vist i figur 7. En ssrA nedbrydning tag (AAV) blev føjet til sfGFP at reducere itshalf-levetid til minutter5. Det tredje kredsløb er baseret på et positivt feedback kredsløb1, og er induceret af acyl-homoserine-lactone (AHL). PluxR-promotoren regulerer sfGFP og LuxR, en transskriberingsfaktor, der binder med AHL for at aktivere PluxR som vist i figur 8. Figur 9 viser dynamikken i cellevækst (celletal kontra tid), Figur 10 viser dynamikken i det målte signal (gennemsnitlig fluorescens kontra tid), og figur 11 viser dynamikken i evalueret total støj (standardafvigelse (STD) versus tid).
SNR (eller CV) bruges i vid udstrækning til at designe analoge elektroniske kredsløb til at udtrykke præcisionen og pålideligheden af kredsløbet32. CV vedrører fordelingen af signal mellem enkeltceller og gør det muligt at sammenligne på tværs af metoder og forskelligt udstyr såsom mikroskoper og flowanalysatorer. Beregning af SNR fra mikroskopbilleder giver os mulighed for at sammenligne kredsløb over tid, segmenterede celler måles samtidig med at vi giver et mål for den specifikke opløsning af støjen sammenlignet med signalet eller et støjinterval for en bestemt tids- og inducerkoncentration. Dette kan indikere, om detektorceller vil være i stand til at løse det nøjagtige signalrespons på inducerkoncentrationen. I dette arbejde blev CV'et beregnet ved at overveje alle segmenterede artefakter, som er celler, uanset celleforløb i divisionens cyklus. SNR blev beregnet for specifikke celleområdeområde over tid, og derefter blev det gennemsnit for tre gentagne eksperimenter. Hverken det erhvervede signal eller STD er pålidelige alene, da de er specifikke for det anvendte eksperiment og udstyr. Signalet måles med vilkårlige enheder, som afhænger af udstyrsforøgelsesforudindstilling, fotodetektor og eksponeringstid. De data, der præsenteres i figur 10, tyder på, at cellerstadiet i opdelingscyklussen ikke påvirker støjniveauet, da forskellige områdeområder (punkter i opdelingscyklussen) viser den samme tendens. Denne observation kan understøtte påstanden om, at sporing af eksakt mor - datterrelationer kan undgås til måling af støj, og dette kan forbedre SNR for den præsenterede metode. Der blev ikke observeret nogen væsentlig ændring i SNR mellem GFP og sfGFP som vist i figur 12. Vi beregner SNR (SNR= middelværdi/ STD) og præsenterer den i figur 12 og figur 13.
Derefter beregnede vi variansen og CV'et ud fra følgende ligninger31
1.1
1.2
Hvor λ er protein foldetid, T er celledeling tid, θ og μ er antallet af plasmider før og efter division, plasmid kopi nummer31. Ved hjælp af ovenstående ligninger (1.1 og 1.2) kan vi passe til dataene fra flowanalysatorsignalet til gammafordeling.
Derefter sammenlignede vi mellem CV'et, som måles og beregnes ved flowanalysator (Figur 14) og efter protokollen (Figur 15).
Figur 1: Billede aflysfelteksponering (a) Stabiliseret anskaffelse i lyst felt (b) Segmenteringsbillede, kun farvede celler indtaster beregningerne (c) Pixel lysstyrke kort over erhvervelsen, spike er baggrundsstøj. Tærskler ved det segmenter kun Escherichia coli. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Dette eksperiment viser gode raske celler dividere og reagere efter 120 minutter. Billeder blev erhvervet successivt med 20 minutters mellemrum. Kolonier er i fokus, gel er stabil mellem prøveudtagninger. Kolonier deler sig og producerer stærke signaler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Virkninger af forkert fortyndingsforhold og gelsvind på fluorescerende billede. Billeder blev erhvervet med 20 minutters mellemrum (a) Individuelle Escherichia coli kredsede i rødt (b) Den samme celle driver til højre for synsfeltet (c) Cellen driver videre. Cellerne deler eller ændrer heller ikke positioner, sandsynligvis på grund af et lavt fortyndingsforhold og gelsvind. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: I dette eksperiment blev der ikke påvist nogen aktivitet, og der var næsten ingen celler til stede. Mulige årsager er, at gelen er for varm, at tørringen af prøven er for aggressiv eller ikke har nogen beskyttende hætte (a) Fluorescerende billeder taget ved 40 minutter (b) Fluorescerende billeder taget på 60 minutter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Tab af fokus og fotobleaching. Efterfølgende billeder af (a) til (d) blev erhvervet med 15 minutters tidsintervaller ved hjælp af autofokussystem. Se supplerende video 2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6:Plasmid kort over Pteto, der regulerer GFP. Uden TetR-undertrykkeren fungerer PtetO-initiativtageren som konstituerende initiativtager. Kredsløbet er klonet på lav kopi nummer plasmider. Dette plasmid danner grundlag for SNR-måling for ethvert modificeret kredsløb. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7:Plasmid kort over Pteto, der regulerer sfGFP. SfGFP er smeltet til en AAV nedbrydning tag. Kredsløbet er klonet på lav kopi nummer plasmider. Den sfGFP-AAV er en mere robust variant af GFP, mens AAV tag gør det modtagelige for nedbrydning ved husholdning proteases af Escherichia coli. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8:Plasmid kort over positive tilbagemeldinger kredsløb. Kredsløbet er induceret af en AHL inducer, som binder LuxR transskription faktor. PluxR-promotoren, som er reguleret af AHL-LuxR-komplekset, er aktiv inden for produktion af LuxR og sfGFP-AAV. Kredsløbet er klonet på lav kopi nummer plasmider. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9:Dynamikken i Escherichia coli MG1655 stammevækst i minimale medier omfatter (a)PtetO-GFP, eksponentiel vækst på ca. 35 minutter. Billederne af dette eksperiment er vist i figur 2 ( b) PtetO-sfGFP, eksponentiel vækst på ca. 35 minutter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Fluorescerende intensitetsniveau, normaliseret pr. pixel og anskaffet med 20 minutters mellemrum.
Cellerne er binned efter område, for at minimere artefakter. Cellerne divideres med deres areal i et mikrometer kvadrat (a) Pteto-GFP kredsløbførste gentagelse for intensitet på 210 minutter er 0,004 a.u (b) PtetO-sfGFP kredsløb første gentagelse for intensitet på 210 minutter er 0,022 a.u (c) Målt signal af Pteto-GFP kredsløb (d) Målt signal af PtetO-sfGFP kredsløb. Alle eksperimentelle data repræsenterer gennemsnittet af tre eksperimenter. Softwaren kan sortere celleområdet efter forskellige grupper (a) og (b) viser grafer for fire celleområdeområder, der repræsenterer opdelingscyklussen. Første område på 14 mikrometer repræsenterer celler efter division som mest sandsynligt, at celler efter division vil være den mindste. Det andet område på 21 μm repræsenterer celler før division. Tredje og fjerde område repræsenterer celler i divisionen, da det samlede areal ganges med to (29 og 36 μm) for at tage hensyn til celler, der tog længere tid at opdele. Områderne blev valgt ved manuelt at vurdere de data, der ser på mikroskopibilleder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11:Standardafvigelse (STD) for encellede fluorescensintensiteter for: (a) PtetO-GFP-kredsløb første gentagelse for STD ved 210minutter er 0,001865 a.u (b) P t 0,01477 a.u (c) STD af Pteto-GFP kredsløb (d) STD af PtetO-sfGFP kredsløb. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 12: SNR for encellede fluorescensintensiteter. Vi beregner SNR = Mean / STD (a) PtetO-GFP kredsløb første gentagelse for SNR på 210 minutter er 1,309 a.u (b) PtetO-sfGFP kredsløb første gentagelse for SNR på 210 minutter er 1,29 a.u (c) Tre gentagelser af GFP måling(d) Tre gentagelser af sfGFP måling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 13:SNR for encellede fluorescensintensiteter (a)PluxR-sfGFP-kredsløb SNR for mætningsrespons på AHL (b) PluxR-sfGFP-kredsløb SNR for halv tids respons på AHL. SNR af positiv feedback AHL reguleret kredsløb er højere end SNR for konstituerende sfGFP kredsløb. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 14: Histogrammer af genkredsløbene baseret på flowanalysatoren: eksperimentelle data (blå) og stokastiske modeldata (rød). X-aksen repræsenterer vilkårlige fluorescensenheder fra flowcytometry, og y-aksen repræsenterer hyppigheden af celler, der producerer det tilsvarende fluorescensniveau. Dataene blev målt ved hjælp af en flowanalysator efter tre timer. GFP fluorescens blev kvantificeret ved excitation ved en bølgelængde på 484 nm og emission ved en bølgelængde på 510 nm. PE-TexasRed filterspændinger blev brugt på en høj overførselshastighed sampler til at måle GFP udtryksniveauer. Flowanalysatorspændingerne blev justeret ved hjælp af software, så de maksimale og minimale udtryksniveauer kunne måles med de samme spændingsindstillinger. Således blev konsekvente spændinger brugt på tværs af hvert hele eksperiment. De samme spændinger blev brugt til efterfølgende gentagelser af det samme eksperiment. Montering blev foretaget ved brug af gamma distribution31. Denne metode forudsætter, at signalet hovedsagelig afhænger af tilfældig fordeling af plasmider (a) Måling af Pteto-GFP klon på lav kopi nummer plasmid. Eksperimentel CV=0,46, Model CV=0,32 (b) Måling af Pteto-sfGFP-AAV klonet på lavt kopinummer plasmid. Eksperimentel CV=0,86, Model CV=0,44. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 15: Histogrammer i genkredsløbene baseret på mikroskop: eksperimentelle data (sleben linjer) og stokastiske modeldata (faste linjer). X-aksen repræsenterer vilkårlige fluorescensenheder fra omvendt mikroskop, og y-aksen repræsenterer hyppigheden af celler, der producerer det tilsvarende fluorescensniveau. Monteringen blev foretaget ved hjælp af MATLAB-gammafordelingen31,32 (a) Måling af PtetO-GFP-klon på lavt kopinummer plasmid (b) Måling af PtetO-sfGFP-AAV klonet på lavt kopinummer. Sammenligning viser, at vores protokol opnår lignende CV-værdier som i flowanalysatoreksperiment. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Fire fortyndingsforhold mellem 1:500 og 1:20 for MG1655-stammen. Grafen viser, at hvis den oprindelige tæthed er høj, LB næringsstoffer er rigelige resulterer i celler dividere hurtigere. For en 1:500 fortynding forblev celletætheden konstant. For en 1:100 fortynding steg celletætheden langsomt. Ved en 1:50-fortynding steg celletætheden med moderat divisionshastighed uden væsentlig forsinkelse i 250 RPM-inkubation. For en 1:20 fortynding nåede celletætheden mætning hurtigt. Vi valgte et fortyndingsforhold på 1:30, hvilket giver mulighed for kort inkubation for at nå eksponentiel vækst og betydelig divisionsområde for at opnå høj mætning ved moderat divisionshastighed. Klik her for at downloade dette tal
Supplerende figur 2:Behandling af lyse feltbilleder. (a) Rå dataintensitetsbilleder fra den lyse feltkanal fra mikroskopsystemet. (b) Manipulation af billedets kontrastforbedring for at forbedre adskillelsen af celleobjekter fra baggrunden. c) Cellegrænsegenkendelse baseret på decentraliseringsfilter33 og binariseringsbaseret global tærskel34. d) Morfologiske35 operationer med lukning og paafyldning med henblik paa at identificere cellekoloniens afgrænsninger. Klik her for at downloade dette tal
Supplerende figur 3:Cellekolonibaggrund\forgrundssegmentering. For at minimere virkningen af støjen forsøger vi at identificere cellekolonigrænser og udtrække dem fra gelstøjen. (a) Billedplaceringshandling på kontrastforbedring baseret på tilpasset tærskelværdi for at registrere celleobjekter36. b) Matrixforblypning af matrixer, der præsenteres ved S2d og S3a, filtrerer med succes de fleste lyde fra og adskiller gelstøj fra celler. Nogle grænser er ikke helt løst. c) Identifikation af cellegrænser ved hjælp af en afvandingsalgoritme37 baseret paa afstandstransformation38. d) Matrixforblypning af matrixer, der præsenteres på S3b og S3c, med succes til løsning af enkelte celler. Klik her for at downloade dette tal
Supplerende figur 4:Segmentering af en enkelt celle. (a) Segmenteret produkt af lysfeltbillede. Yderligere rengøring er præformeret baseret på celleområde gating og form, kassere runde bobler. b)Fluorescenssignalbilleder fra mikroskop. c) Matrixforbdosering af matrixer, der præsenteres ved S4a og S4b, med succes udvinding af signalet fra enkelte celler. Klik her for at downloade dette tal
Supplerende figur 5:Tab af monolayer. (a) Lysfeltbillede af et cellelag efter 840 minutter (14 timer) af Pteto, der regulerer GFP-kredsløb vist i figur 2 i artiklen som et godt eksperiment. I højre side af mikroskopi billede tab af monolayer kan påvises. (b) Billede af segmentering af software. På grund af tab af monolayer celler er fragmenteret og vil blive renset base på området gating. (c) Fluorescensbillede, der viser, at ingen celler kan løses i højre side af billedet, og et lavt signal af celler i venstre side af billedet på grund af tab af monolag. d) Segmenteringsbillede kombineret med fluorescensbillede. Klik her for at downloade dette tal
Supplerende video 1. Klik her for at downloade denne video
Supplerende video 2. Klik her for at downloade denne video
Supplerende video 3. Klik her for at downloade denne video
cell_growth_rate_fit.m. Klik her for at hente denne fil
compare_experiments.m. Klik her for at hente denne fil
Count_Cells.m. Klik her for at hente denne fil
main_code.m. Klik her for at hente denne fil
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbejde udviklede vi en protokol, der muliggør computersporing af Escherichia coli levende celler efter division og fluorescerende niveauer over en periode på timer. Denne protokol giver os mulighed for at kvantificere den stokastiske dynamik i genetiske kredsløb i Escherichia coli ved at måle CV'et og SNR i realtid. I denne protokol sammenlignede vi den stokastiske adfærd i to forskellige kredsløb som vist i figur 10. Det har vist sig, at plasmider med lave kopinumre er mere tilbøjelige til stokastiske virkninger og mindre påvirket af celledeling. Det første kredsløb, der konstituerende udtrykkes GFP (Figur 10a), og det andet kredsløb er konstituerende udtrykt sfGFP fusioneret med en ssrA nedbrydning tag (Figur 10b). For at kvantificere fluorescerende proteiners stokastiske opførsel optog vi også de lyse feltbilleder. Resultaterne viser, at udtrykket af GFP, specielt ved modningen39, er den dominerende støjkilde. Det periodiske savtandsadfærdsmønster, der er observeret i figur 10a, kan forklares ved den tilfældige proces med celledeling og den langvarige skala af GFP-modning (~ 50 minutter). I modsætning hertil blev sfGFP-signalet fra det andet kredsløb stabiliseret under målingen, fordi den meget korte modningstid for sfGFP (~ 6 minutter). Vi udviklede en simpel formel, der beskriver niveauet af GFP i begge kredsløb, når vi kun overvejer processen med celledeling og GFP modningstid. På et givet tidspunkt antagervi, at der er x kopinumre af proteiner, og μ kopinumre af plasmider. Proteinkopinummeret kan beskrives ved:
1.3
1.4
Når man kun overvejer division begivenheder; 
efter protein modning og så for de specifikke plasmider får vi:
For GFP ( 
): 1,5
For sfGFP ( 
):1,6
Derefter den udviklede serie af sfGFP:
1.7
I tilfælde af, at 
vi får 
. Dette resultat kan forklares som følger. Når x er lille, sfGFP niveauer stige med en lille mængde. Når x er stort, nedbrydes sfGFP til en stabil tilstand. Tilsvarende, for kredsløbet af GFP, hver celle indeholder omkring 10 enheder af GFP, men da modningstid for GFP er længere end mitose, nedbrydende sav tand mønstre af fluorescens intensiteter observeres. I modellen antog vi, at replikationen af plasmidet er hurtig nok til, at plasmidfordelingen forbliver konstant før og efter divisionen. SSRA nedbrydning tag ofte reducerer protein halveringstid fra timer til mindre end en time5 og fører til en hurtig stabil tilstand. Vi viste, at metoden også giver en fordeling svarende til den, der måles med en høj befolkning flow analysator, og at CV'et for denne fordeling er lig med eller mindre end flow analysator CV.
Mens flere metoder3,7,18 blev udviklet til levende cellebilleddannelse, er den metode, der præsenteres her, skræddersyet specielt til Escherichia coli. Denne bakterie kræver et særligt medie og en lidt anden tilgang. Protokollen har følgende vigtige træk: (1) Etablering af et fortyndingsforhold, der er specifikt for bakterierne og stammen i begyndelsen af eksponentiel vækst snarere end i mellemfasen (Eksponentiel vækst uden rysten) (2) Escherichia coli bedst deler sig ved 37 °C, men ved 37 °C mister den minimale mediegel hurtigt vand, hvilket fører til svind og ustabilitet. Protokollen her overvinder denne udfordring (3) Vi anvender først bakterieprøven og forsegler den derefter med flydende gel. Da prøven er fanget mellem glasbunden og gelen, har vi brug for en gel, der (I) tillader gasudveksling for at undgå at skære luftlommer, (II) forbliver flydende ved lave temperaturer, da Escherichia coli er følsomme over for varme og (III) sørger for, at prøven ikke blandes inde i den flydende gel. Gelen forbliver flydende ved 37 °C, men vi anbefaler brug af en beskyttelseshætte oven på prøven for at undgå overdreven varme og prøveblanding inde i gelen (4) Denne tilgang kræver enkel, generisk udstyr (5) Prøver kan måles direkte uden forvarmning, så der er intet tab af division begivenheder (6) Protokollen, som omfatter våd-lab trin og den tilpassede automatiserede software, kan bruges til at studere stokastiske opførsel af genetiske kredsløb såsom kvantificering af SNR og CV af kredsløbssignaler. Vi sammenlignede mikroskopimetoden med flowanalysatorresultater for at validere brugen af små populationer af celler og etablere en basislinje til sammenligning i henhold til CV (7) Softwaren giver os mulighed for at opdage celler på monolayeren uden menneskelig indgriben og analysere total støj. Softwareværktøjer som ImageJ18 eller Schnitzcells kræver manuel identifikation af celler og er udfordrende for justeringer.
Når du kontinuerligt billeddanner levende cellekolonier, skal du designe eksperimentet, mens du overvejer flere komplekse fysiske parametre, såsom cellulær stress og toksicitet, udtømning af ressourcer, nekrose og nedbrydningstid for inducere og kemikalier. Protokollen giver mulighed for pålidelig måling på op til fem timer. Vores eksperimenter tyder på, at Escherichia coli synkronisere, når dividere i mikro, monolayer kolonier (Supplerende Video 3). Vi antager, at gelen er ensartet med hensyn til ressourcer og sejhed, cellerne har lignende adfærd, og belysningsområdet er lidt større fra synsfeltet. Således skal hver celle producere de samme signal- og statistiske data, som kan indsamles, som vi har vist ved at sammenligne CV opnået på denne måde til måling med en flowanalysator. For at måle støj ved konstante indledende forhold i længere tid vil vi overveje at bruge mikrofluidiske chips i fremtiden. Yderligere fordele ved en sådan anordning er at opretholde faste positioner af celler og stabil fokus10. Alligevel kræver design, fremstilling af mikrofluidiske chips og grunding til eksperimenter træning, specifikt udstyr (specialfremstillet til tider) og tid. Af denne grund er det gavnligt at bruge time lapse mikroskopi som vist i denne protokol for at erhverve en generel forståelse af kredsløbet.
Den foreslåede protokol og den udviklede software tillader reproducerbare målinger, hvorfra det er nemt at udlede grafer. Det giver også mulighed for test og sammenligning af total støj og kan ændres til måling af iboende og ydre støj. Metoden er baseret på generiske eller nemme at bestille materialer, åbent delt, let at bruge software og kræver ikke specifik træning. Vi har vist, at populationen målt ved mikroskopi er stor nok til at opnå meningsfulde data ved at sammenligne metode-CV'et med det, der opnås med en flowanalysator. Derfor kan vi med succes etablere en SNR-basislinje ved hjælp af denne protokol og sammenligne den med mere komplekse genkredsløb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Mr. Gil Gelbert (Fakultetet for Elektroteknik, Technion) for at hjælpe med MATLAB-koden. Vi takker Dr. Ximing Li (Fakultetet for bio-medicinsk Engineering, Technion) for at hjælpe med proofing denne artikel. Denne forskning blev delvist støttet af Neubauer Family Foundation og Israel Ministry of Science, tilskud 2027345.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD - Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD - Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD - Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
References
- Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497, 619-623 (2013).
- Yang, X. S. Y., L, A. B. Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. Harwood, C., Jensen, G. , (2016).
- Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging. Biomedcentral Research Notes. , (2011).
- Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. ChemPhysChem. , (2006).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).
- Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system. Nucleic Acids Research. , (2019).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nature Protocols. , (2012).
- Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. , (2002).
- Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. Synchronized DNA cycling across a bacterial population. Nature Genetics. , (2017).
- Arriaga, E. A. Determining biological noise via single cell analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).
- Nielsen, A. A. K., et al. Genetic circuit design automation. Science. , (2016).
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. Noise propagations in gene networks. Science. , (2005).
- Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. , (2014).
- Aoki, S. K., et al. A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation. Nature. , (2019).
- Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Reviews Genetics. , (2019).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades. Biophysical Journal. , (2002).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Intrinsic noise in gene regulatory networks. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. , (2005).
- Van Der Ziel, A. Noise in Measurements. , Wiley & Sons Inc. (1976).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. , (2006).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. , (2016).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. , (2016).
- Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , Wiley Online Library. (2016).
- Balomenos, A. D., et al. Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology. Biomedcentral System Biology. , (2017).
- Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data. PLoS One. , (2019).
- Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. , (2006).
- Beal, J. Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).
- Marr, D., Hildreth, E. Theory of edge detection. Proceedings of the Royal Society - Biology Science. 207, 187-217 (1980).
- Otsu, N. Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).
- Soille, P. Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).
- Bradley, D., Roth, G. Adaptive Thresholding using the Integral Image. Journal of Graphics Tools. , (2007).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. , (1994).
- Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).
- Millo, R., Phillips, R. What is the maturation time for fluorescent proteins. Cell Biology by Numbers. , (2015).
