Ein automatisierter Differential-Nuklearfärbungstest zur genauen Bestimmung der Mitocan-Zytotoxizität

Summary

Das Protokoll beschreibt einen schnellen, hohen Durchsatz, zuverlässigen, kostengünstigen und unvoreingenommenen Test zur effizienten Bestimmung der Zelllebensfähigkeit. Dieser Test ist besonders nützlich, wenn die Mitochondrien der Zellen geschädigt wurden, was andere Assays stört. Der Test verwendet die automatisierte Zählung von Zellen, die mit zwei Kernfarbstoffen – Hoechst 33342 und Propidiumiodid – befleckt sind.

Abstract

Der Beitrag der Mitochondrien zur onkogenen Transformation ist ein Thema von großem Interesse und aktiver Studie. Da das Feld des Krebsstoffwechsels komplexer wird, wird das Ziel, Mitochondrien mit verschiedenen Verbindungen anzugreifen, die mitochondriale Schäden verursachen (sogenannte Mitocans), immer beliebter. Leider benötigen viele bestehende Zytotoxizitätstests, wie z. B. solche, die auf Tetrazoliumsalzen oder Resazurin basieren, funktionelle mitochondriale Enzyme für ihre Leistung. Der Schaden, der durch Verbindungen verursacht wird, die auf Mitochondrien abzielen, beeinträchtigt oft die Genauigkeit dieser Assays. Hier beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll, das auf Differentialfärbung mit zwei fluoreszierenden Farbstoffen basiert, von denen einer zellpermeant (Hoechst 33342) und der andere nicht (Propidiumiodid) ist. Der Unterschied in der Färbung ermöglicht es, lebende und abgestorbene Zellen zu diskriminieren. Der Assay ist für die automatisierte Mikroskopie und Bildanalyse zugänglich, was den Durchsatz erhöht und Verzerrungen reduziert. Dies ermöglicht auch die Verwendung des Assays in High-Throughput-Manier mit 96-Well-Platten, so dass es eine praktikable Option für Drogenentdeckungbemühungen, vor allem, wenn die betreffenden Medikamente haben ein gewisses Maß an Mitotoxizität. Wichtig ist, dass die Ergebnisse des Hoechst/PI-Färbetestes eine erhöhte Konsistenz aufweisen, sowohl mit Trypan-Blau-Ausschlussergebnissen als auch zwischen biologischen Replikationen, wenn der Test mit anderen Methoden verglichen wird.

Introduction

Der erste Schritt zur Identifizierung wirksamer Krebsbehandlungen ist die Auswahl eines robusten, unvoreingenommenen Zytotoxizitäts-Assays, der verwendet werden kann, um die Wirkung der Behandlung zu untersuchen. Eine häufige Wahl für Versuche mit niedrigem Durchsatz ist der Ausschluss von Trypan-Blaufarbstoff enthäupfen zellendes. Diese Methode wird bevorzugt, weil sie eine relativ unvoreingenommene Methode zur Quantifizierung des Zellüberlebens ermöglicht. Trypan blau diffundiert passiv in Zellen, deren Membranen kompromittiert sind, aber es wird effektiv daran gehindert, in gesunde Zellen einzudringen¹. Der Quotient der lebenden Zellen und d....

Protocol

1. Zytotoxizitätstest: Setup

1. Herstellung von Lösungen von Verbindungen von Interesse bei gewünschten Konzentrationen in den entsprechenden Medien (serumfrei oder 1, 2,5 oder 5% FBS RPMI-1640).
   1. Zur Messung der Zytotoxizität einer einzelnen Verbindung (z. B. zur Bestimmung der effektiven Dosen) bereiten Sie Verbindungen in 2x Endkonzentration vor.
   2. Zur Messung der Zytotoxizität von zusammengesetzten Kombinationen, bereiten Sie Verbindungen in 4x Endkonzentration vor.
   3. Bereiten Sie nur Lösungsmittelsteuerungen vor, indem Sie die gleiche Menge Lösungsmittel mit dem entsprechenden Medium mischen. Wenn z. B. in DMSO und Methanol gelöste....

Results

Das oben genannte Protokoll wurde mit OCI-AML2-Zellen entwickelt, die als repräsentative akute myeloische Leukämie-Zelllinie genommen wurden. AML ist durch abnorme Proliferation undifferenzierter und nicht-funktioneller hämatopoetischer Zellen im Knochenmark^{gekennzeichnet 26}. Trotz der jüngsten Entwicklungen in der AML-gezielten Therapie, ist der Standard der Pflege seit mehreren Jahrzehnten unverändert geblieben, und besteht aus Induktionstherapie (in der Regel bestehend aus drei Tagen Anthracycl.......

Discussion

Obwohl das Protokoll für Hoechst/PI Cytotoxizität-Assay robust ist und vergleichsweise wenig Hands-on-Zeit erfordert, gibt es mehrere experimentelle Details, die sehr wichtig sind, um genaue Ergebnisse zu gewährleisten. Zunächst ist darauf zu achten, dass die DMSO-Konzentration unter 0,5 % (v/v) bleibt. Es ist allgemein vereinbart, dass die Exposition gegenüber selbst niedrigen Dosen von DMSO die Morphologie und Anhaftung von Zellen wesentlich verändern und die Zellzyklusprogression signifikant verzögern kann

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Deoxy-D-Glucose/2-DG	Chem-Impex	50-519-067
3-Brom-Pyruvat	Alfa Aesar	1113-59-3
96-Well-Platten	Greiner Bio-One	655090	96-Well-Platten mit schwarzem oder klarem Flachboden
Alamar Blue HS Reagenz für die Zellviabilität (100 ml)	Thermo Fisher	A50101
Countess II automatisierter Zellzähler	Thermo Fisher
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader	BioTek
Hoechst 33342	Thermo Fisher	62249	20 mM Lösung; Endkonzentration 1:1.000
HyClone fötales Rinderserum	GE Healthcare	#25-514
m-Chlorphenylhydrazon/CCCP	Sigma Aldrich	C2759
PBS Tabletten	Thermo Fisher	BP2944100	1 Tablette + 200 mL steriles Wasser = 1x PBS Lösung
Penicillin-Streptomycin-Glutamin (100X)	Gibco	10378016
Pierce LDH Assay Kit	Thermo Fisher	50-103-5952
Propidiumiodid	Thermo Fisher	50-596-072	Trockenes Pulver; Bestand 1 mg/mL in PBS; Endkonzentration 5 & Mikro; g/ml (Leukämiezellen), 1 & Mikro; g/mL (normale PBMCs)
Rotenon	Ark Pharm	AK115691
RPMI-1640 Medium Mit L-Glutamin und Natriumbicarbonat, flüssig, sterilfiltriert, geeignet für Zellkultur	Sigma Aldrich	R8758-500ML
Thiazolylblau-Tetrazoliumbromid	ACROS Organics	AC158990010
Trypanblau-Färbung (0,4%)	Gibco	15250-061
Zelllinien
K562	ATCC	CCL-243	CML-Zelllinie
MOLM-13	ATCC		AML-Zelllinie
MOLT-4	ATCC	CRL-1582	ALL-Zelllinie
OCI-AML2	ATCC		AML-Zelllinie