Summary
Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare un modello murino di guarigione delle ferite da ustione. Un'ustione termica è stata indotta sulla pelle dorsale dei topi utilizzando un modello di ottone preriscaldato. Il tessuto bruciato è stato disretto e sovrapposto con un innesto cutaneo raccolto dalla coda di un topo donatore geneticamente simile.
Abstract
Le ferite superficiali banali guariscono senza complicazioni dall'intenzione primaria. Ferite profonde, come ustioni a pieno spessore, guariscono per intenzione secondaria e richiedono sconforto chirurgico e innesto cutaneo. La riuscita dell'integrazione dell'innesto del donatore in un letto di ferita ricevente dipende dal reclutamento tempestivo di cellule immunitarie, dalla robusta risposta angiogenica e dalla nuova formazione di matrici extracellulari. Lo sviluppo di nuovi agenti terapeutici, che prendono di mira alcuni processi chiave coinvolti nella guarigione delle ferite, sono ostacolati dalla mancanza di modelli preclinici affidabili con una valutazione oggettiva ottimizzata della chiusura delle ferite. Qui, descriviamo un modello economico e riproducibile di ferita sperimentale di ustione a spessore pieno ricostruita con un innesto di pelle allogenico. La ferita è indotta sulla superficie del dorsum dei topi di tipo selvaggio acuito provenienti dagli sfondi BALB/C e SKH1-Hrhr. L'ustione viene prodotta utilizzando un modello in ottone di 10 mm di diametro, che viene preriscaldato a 80 gradi centigradi e consegnato a una pressione costante per 20 s. Burn eschar viene assolto 24 ore dopo la lesione e sostituito con un innesto di spessore completo raccolto dalla coda di un topo donatore geneticamente simile. Non sono richieste attrezzature specializzate per la procedura e le tecniche chirurgiche sono semplici da seguire. Il metodo può essere implementato e riprodotto senza sforzo nella maggior parte delle impostazioni di ricerca. Alcune limitazioni sono associate al modello. A causa di difficoltà tecniche, la raccolta di innesti cutanei di spessore diviso più sottile non è possibile. Il metodo chirurgico che descriviamo qui permette la ricostruzione delle ferite da ustione utilizzando innesti cutanei a pieno spessore. Può essere utilizzato per effettuare test terapeutici preclinici.
Introduction
Il debridement chirurgico e l'innesto cutaneo sono pratiche cliniche comuni utilizzate nella gestione delle ferite croniche1,ferite da ustione2e ferite acute come ferite traumatiche3. L'innesto cutaneo si riferisce alla procedura chirurgica, che comporta la rimozione della pelle sana da una parte del corpo e il trasferimento ad un'altra. Gli innesti dei donatori sostituiscono il tessuto perduto e forniscono uno scaffold strutturale per la migrazione cellulare e la crescita. In seguito all'integrazione nel sito ricevente, gli innesti cutanei sostituiscono la barriera cutanea persa fornendo protezione dall'invasione microbica, effetti nocivi dell'ambiente esterno e eccessiva perdita di umidità4. Il successo dell'integrazione dell'innesto cutaneo dipende da diversi fattori. Questi includono adeguate risposte immunitarie in presenza di infezioni microbiche e risoluzione tempestiva dell'infiammazione, robusta angiogenesi nel sito della ferita e la creazione di anastomosi vascolari tra il letto ricevente e l'innesto del donatore5. Quando l'innesto inizia a degradarsi, le cellule dermiche residenti devono essere sostituite da cellule in grado di produrre nuova matrice extracellulare. Allo stesso tempo, i cheratinociti epidermimici devono strisciare sulla matrice appena prodotta per formare la neo-epidermide e epiteliolizzano la ferita. È quindi evidente che una migrazione efficiente delle cellule dal letto ricevente all'innesto del donatore è un altro fattore determinante che influenza il successo dell'incorporazione del trapianto. Dato il gran numero di fattori coinvolti nella guarigione delle ferite6, che possono essere impossibili da controllare nelle sperimentazioni umane a causa di limitazioni etiche, sono necessari modelli di innesto sperimentale preclinico della pelle. Lo sviluppo di modelli preclinici di guarigione delle ferite da ustione e innesto cutaneo associato sarà importante per la comprensione di meccanismi complessi coinvolti nella riparazione dei tessuti cutanei ed essenziali per la sperimentazione di nuovi agenti terapeutici. I modelli in vitro della guarigione delle ferite non sono in grado di imitare con precisione la complessità del tessuto cutaneo. I modelli animali in vivo sono un indispensabile strumento investigativo per comprendere i meccanismi coinvolti nella riparazione dei tessuti.
Diversi metodi di tecnica di innesto cutaneo sono stati sviluppati nei roditori per imitare l'escissione chirurgica e bruciare la ricostruzione della ferita7,8,9. Tuttavia, la maggior parte delle procedure descritte in precedenza non è riuscita a indurre una lesione da ustione termica prima dell'innesto cutaneo. Invece della ferita da ustione, è stata indotta una ferita eccisionale a pieno spessore, che è stata poi ricostruita con un allotrapianto di pelle pieno spessore7. Vari punti di riferimento anatomici come l'orecchio, la coda e la schiena sono stati utilizzati per la raccolta della pelle del donatore in roditori7,8. Sono state riportate diverse tecniche di fissazione e stabilizzazione del trapianto, tra cui una "tecnica di non sutura"9, suture7 e colla chirurgica10,11,12.
Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare un modello murino di una ferita da ustione a pieno spessore che riassumesse l'attuale approccio gold standard nel trattamento delle ustioni, che comporta escissione dei tessuti non vitali e innesto cutaneo. Un'ustione termica è stata indotta sulla superficie del dorsum di un topo utilizzando un modello di ottone preriscaldato. L'eschar di combustione è stato asformato e sostituito con un innesto di spessore pieno raccolto dalla coda di un topo donatore. Questo modello sperimentale presenta tre vantaggi fondamentali. In primo luogo, più di una ferita da ustione può essere indotta sul retro del topo ricevente e quattro innesti cutanei del donatore possono essere raccolti da una singola coda del topo donatore. Ciò significa che diversi trattamenti sperimentali e di controllo possono potenzialmente essere confrontati utilizzando lo stesso ricevente e gli stessi animali donatori. A seconda del percorso desiderato di somministrazione, il trattamento di controllo può includere la somministrazione locale o sistemica del veicolo o del controllo del placebo (ad esempio, applicazione topica di unguento, sottocutanea, intraperitale o intravenosa iniezione di soluzione). In secondo luogo, la tempistica del trattamento e l'endpoint dell'esperimento possono essere controllati. In terzo luogo, questo modello dipende dalla ricostruzione delle ferite utilizzando innesti a spessore pieno raccolti dalla coda, che sono noti per avere una maggiore probabilità di incorporazione di successo nel sito donatore rispetto alla pelle raccolta dal retro13. Ciò può essere dovuto al minor numero di cellule epidermiche di Langerhans, che svolgono un ruolo chiave nell'immunobiologia cutanea e sono associate al rigetto dell'innesto cutaneo14.
Il modello proposto di guarigione delle ferite e integrazione dell'innesto può essere applicato ai topi transgenici e knockout. L'uso di topi geneticamente modificati aiuterà a chiarire i ruoli che alcuni geni possono svolgere durante la riparazione delle ferite. Può essere considerata anche l'applicazione esogena di preparati topici o somministrazione sottocutanea di anticorpi terapeutici nel sito della lesione.
A causa di difficoltà tecniche, gli innesti cutanei a spessore diviso costituiti dall'epidermide e parte del derma sono difficili da ottenere nei topi. Gli innesti cutanei a pieno spessore costituiti dall'epidermide e dal derma a pieno spessore richiedono un letto a ferita ben vascolarizzato per una corretta integrazione. L'incapacità di raccogliere innesti cutanei a spessore diviso nei topi può essere considerata una limitazione di questo modello. La fissazione dell'innesto cutaneo al letto della ferita ricevente è stata ottenuta tramite l'applicazione della colla adesiva chirurgica, che è associata a meno traumi e rapida degradazione rispetto ad altri mezzi di fissazione dei tessuti15. Studi precedenti hanno dimostrato che la sutura è associata a una fissazione tissutale più forte rispetto alla colla chirurgica a 24 h dopo la procedura chirurgica15, che può essere considerata come uno svantaggio della procedura. Tuttavia, in tempi successivi, la forza biomeccanica delle ferite trattate con un adesivo chirurgico diventa paragonabile alle suture15 e meglio della fissazione graffetta16. Dopo la fissazione del tessuto con la colla chirurgica, le ferite devono essere coperte con una medicazione della ferita. Anche se le ferite sulla superficie dorsale del topo sono difficili da raggiungere per l'animale, la medicazione della ferita, d'altra parte, è facile per l'animale da manipolare e rimuovere. Possono essere giustificati frequenti cambi di medicazione delle ferite.
L'ipotermia indotta dall'anestesia in piccoli roditori è un fenomeno ben documentato17. L'ipotermia è un effetto collaterale di questa procedura, che causa complicazioni e potenzialmente compromette sia la salute degli animali che la qualità dei dati. Pertanto, questo metodo garantisce l'implementazione di strategie di gestione della temperatura, soprattutto se vengono utilizzati SKH1-Hrhr senza peli.
La limitazione più significativa dell'uso dei topi per imitare la chiusura delle ferite umane è la differenza tra l'anatomia della pelle e la fisiologia. Le ferite dei topi guariscono per lo più attraverso la contrazione, mentre le ferite umane guariscono attraverso la formazione del tessuto granulosa e la riepitelializzazione18. Per tenere conto di questa discrepanza, il modello attuale può essere modificato e utilizzato in combinazione con un anello di stecca strettamente aderente intorno alla ferita per evitare la contrazione della pelle19. Dati alcuni vantaggi e svantaggi di questo protocollo in vivo, questo modello potrebbe servire come strumento per studiare alcuni processi coinvolti nella guarigione delle ferite che sono impossibili da studiare in vitro.
Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Dipartimento francese di istruzione superiore e ricerca (Numero di studio: 122162017116517670v2 e DAP180012). Tutti i topi erano monocasati all'arrivo in gabbie di plastica e sono stati autorizzati un periodo di acclimatazione di 7 giorni prima dello studio. La stanza degli animali è stata mantenuta in un ciclo di luce/buio 12/12 h (luci accese alle 07:00). Cibo e acqua del rubinetto sono stati forniti ad libitum. I topi BALB/c e SKH1-Hrhr sono stati nutriti con una dieta tradizionale a base di grano/soia. La biancheria da letto di segatura è stata fornita insieme al materiale di nidificazione.
1. Preparazione dell'attrezzatura
- Preparare un dispositivo di masterizzazione per la procedura e impostarlo su 80 gradi utilizzando il controller di temperatura (Figura 1A). Verificare la temperatura del modello di ottone (Figura 1B,C) utilizzando la termocamera a infrarossi.
- Assicurarsi che il manometro digitale funzioni correttamente.
- Coprire lo stage con un drappo chirurgico e regolare l'altezza del tavolo (Figura 1A).
2. Cura degli animali preoperatoria e intraoperatoria
- Acquisire BALB/c e SKH1-Hrhr topi, 6-8 settimane di età.
- Aggiungere la sospensione del paracetamolo a 3 mg/mL all'acqua potabile e fornire 12 ore prima e fino a 72 ore dopo la procedura.
- Utilizzando una siringa da 1 mL e un ago da 26 G, somministrare la sottocutanea di buprenorphine a 0,05 g/g 30 min prima della procedura e ogni 6 ore per le prime 72 ore dopo la procedura.
- Utilizzando una siringa da 1 mL e un ago da 26 G, somministrare la lidocaina al dorsum del topo e la distale di 2-3 mm nell'area della ferita ustionati. Iniettare la lidocaina a 0,05 g/g sottocutaneamente 15 min prima dell'induzione della ferita ustione.
- Anestesia topi utilizzando un'iniezione intraperitoneale di xilolazina a 10 mg/kg e chetamina 100 mg/kg. Utilizzare una siringa da 1 mL e un ago da 26 G per somministrare l'iniezione.
- Fase critica: Posizionare il topo affertizzato su un pad riscaldato e tenere il mouse caldo per evitare l'ipotermia per i primi 30 minuti dopo l'induzione dell'anestesia e per almeno 15 minuti dopo il recupero dall'anestesia. Oltre al pad riscaldato, altre modalità tra cui lampade di calore, liquidi caldi circolanti o aria, e serbatoi di calore pre-riscaldati possono essere utilizzati per regolare la temperatura corporea.
- Applicare gel di lubrificazione sugli occhi del mouse per prevenire la disidratazione della cornea.
- Utilizzare il riflesso di ritiro del pizzico della dita dei i per valutare la profondità dell'anestesia.
- L'utilizzo di una siringa da 1 mL e di un ago da 26 G somministrato 200 -L di Soluzione della suoneria latata integrata con 5% di dextrose. Somministrare la sostituzione del liquido subito dopo l'induzione dell'anestesia e 6 ore dopo la procedura per prevenire la disidratazione.
3. Induzione della ferita da ustione a spessore pieno
- Rasare il topo anaprotesi con i tagliacapelli.
- Applicare crema depilante sulla superficie di dorsum del mouse per 1 minuto. Pulire la crema con un po 'di garza sterile e pulire l'area con un pezzo di garza umida. Asciugare la pelle con una garza fino a secco.
- Posizionare il mouse sul palco coperto da un drappo chirurgico e spostare lo stage verso l'alto verso l'alto al modello di ottone preriscaldato.
- Applicare il modello di ottone circolare sul retro del mouse (80 gradi centigradi per 20 s) utilizzando una pressione costante di 0,15 N (Figura 2).
- Passaggio critico: Subito dopo l'induzione della combustione, posizionare l'animale anestesizzato sul pad riscaldato per prevenire l'ipotermia e mantenere il topo caldo durante e dopo la procedura. Una volta recuperato dall'anestesia, rimettere il mouse alla gabbia.
- Passaggio critico: Fornire una dieta purè sul pavimento della gabbia per le prime 72 ore dopo l'intervento chirurgico. I topi sono talvolta riluttanti a raggiungere un tubo sipper per bere acqua dopo una ferita da ustione.
4. Raccolta dell'innesto del donatore
- Fare un'incisione longitudinale con un bisturi nella parte superiore della coda del topo donatore e rimuovere delicatamente la pelle con la pinza chirurgica.
- Mettere la pelle della coda in un piatto Petri sterile riempito con 10 mL di soluzione salina sterile 0,9%. Utilizzare un righello per misurare i singoli innesti e tagliare la pelle della coda a pezzi, ognuno misura 15 mm, utilizzando un bisturi.
- Una volta preparati, conservare gli innesti cutanei in una soluzione salina dello 0,9% a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 ore.
5. Escissione chirurgica e innesto cutaneo
- Ventiquattro ore dopo l'induzione della masterizzazione, preparare il topo per l'anestesia per inalazione di isoflurane. Posizionare il topo nella camera di induzione e indurre l'anestesia utilizzando 5% isoflurane in 100% ossigeno ad una portata di 4 L/min. Per mantenere l'anestesia durante l'intervento chirurgico, utilizzare 2% isoflurane a 2 L/min.
- Posizionare un drappo chirurgico sul mouse e ritagliare una finestra per esporre il campo chirurgico. Utilizzando la tecnica asettica, tamponare la ferita prima con povidone-iodio e poi con 70% alcol.
- Raccogliere delicatamente il tessuto bruciato con un paio di pinzette chirurgiche e accise tutti i tessuti necrotici e non vitali con forbici chirurgiche sterili e pinzette. Rimuovere lo strato panniculus carnosus dell'ipodermide per creare un letto destinatario stabile.
- Posizionare l'innesto cutaneo sul letto della ferita appena preparato. Tirare delicatamente la pelle circostante verso l'innesto cutaneo utilizzando una pinzetta chirurgica. Applicare un po 'di adesivo chirurgico per collegare l'innesto al letto della ferita e premere delicatamente per allineare i bordi della pelle. Fase critica: la dimensione del letto della ferita deve essere leggermente superiore alle dimensioni dell'innesto cutaneo per garantire il successo dell'innesto.
- Lasciare che il mouse si riprenda dall'anestesia. Fase critica: Posizionare il mouse su un pad riscaldato. Mantenere il mouse caldo durante e dopo la procedura per prevenire l'ipotermia.
- Applicare la garza di paraffina inerte e la medicazione secondaria adesiva sulla ferita innestata.
- Posizionare il mouse in una singola gabbia. Fase critica: Fornire un po 'di dieta purè sul pavimento della gabbia per le prime 72 ore dopo la procedura chirurgica e monitorare ogni giorno.
- Fornire giocattoli e arricchire l'ambiente.
6. Imaging digitale e raccolta delle ferite post-mortem
- Fotografa le ferite con una fotocamera digitale posizionando un righello accanto alla ferita (Figura 3).
- Nel punto finale dell'esperimento, eutanasia gli animali per esposizione all'anidride carbonica e alla lussazione cervicale. Fase critica: Un'eccessiva azione di trazione della pelle durante la lussazione cervicale può danneggiare l'innesto.
- A post-mortem, ascisse chirurgicamente le ferite da ustione dorsale alla fascia usando le forbici. Ferite da bisect. Fissare metà nel 10% di formalina e processo tamponato per l'istologia e l'immunoistochimica. Congelare rapidamente l'altra metà in azoto liquido per l'estrazione dell'RNA e la quantificazione delle proteine e mantenere a -80 gradi centigradi.
7. Istologia della pelle, immunohistochimica e visualizzazione del collagene
- Incorporare campioni di pelle in paraffina, tagliare a 4 sezioni m e posizionare su vetrini caricati positivamente.
- Utilizzare vetrini macchiati con ematossialina ed eosina per valutare il tasso di riepitelio (% della ferita originale). L'area della ferita coperta di neo-epidermide può essere espressa come percentuale dell'intera ferita (Figura 4). Utilizzare un'applicazione di microscopio digitale e un software ImageJ per eseguire l'analisi microscopica delle sezioni.
- Utilizzare sezioni istologiche (spessore di 4 m) preparate da tessuto incorporato in formalina e con paraffina e sottoporle a immunohistochimica.
- Per valutare l'espressione di collagene I e fibronectina nelle ferite, applicare anticorpi primari e incubare per 1 h. Il rilevamento può essere eseguito da anticorpi secondari coniugati specifici della specie perossidasi (HRP) o fossacche alcaline (AP).
- Reagire alle sezioni con: (i) HRP,3,3'-diaminobenzidine (DAB) o (ii) AP, Bond Polymer Refine Red (Table of Materials), che produce un colore rosso brillante (Figura 5). Scansiona le sezioni utilizzando uno strumento e analizzalo con l'applicazione digitale al microscopio e ImageJ.
- Per consentire la valutazione istologica della deposizione di collagene, eseguire la colorazione tricromatica sulle sezioni istologiche utilizzando un kit commerciale.
- Per la visualizzazione della fibra di collagene, utilizzare la microscopia multifotonica e la seconda tecnica di generazione armonica (Figura 5). Utilizzare un microscopio multifotone per l'imaging dei tessuti come descritto in precedenza20. Utilizzare un laser Ti:Sapphire con una lunghezza d'onda centrale a 810 nm come sorgente laser per generare segnali di fluorescenza eccitato (TPEF) di secondo grado e a due fotoni.
- Utilizzare un raggio laser dotato di un obiettivo 25x/0.95 W per raccogliere ed eccitare la seconda generazione armonica (SHG) e TPEF. Rileva i segnali come descritto in precedenza21 dai rilevatori PMT NDD. Utilizzare un software per il controllo della scansione laser e l'acquisizione di immagini.
Representative Results
I risultati dimostrano che il protocollo sviluppato è un metodo semplice, che consente l'induzione di una ferita da ustione di spessore pieno nei topi. Le ustioni vengono indotte utilizzando un modello di ottone preriscaldato (Figura 1A-C). L'area bruciata appare come una ferita circolare con un eschar bianco e una zona iperemica. La dimensione della ferita da ustione è leggermente maggiore a 24 ore dopo la lesione da ustione a causa del fenomeno ben descritto noto come progressione della lesione da ustione, che è probabilmente dovuta all'infiammazione acuta22. Dopo l'escissione, le ferite da ustione vengono ricostruite utilizzando l'innesto della pelle allogenica (Figura 3). Il giorno 7 dopo la lesione da ustione, le ferite diventano vascolarizzate5, che è un'indicazione di innesto di successo. I cheratinociti epidermimico migrano dalla pelle ricevente adiacente nel tentativo di chiudere la ferita e colmare il divario tra i due bordi delle ferite. L'analisi microscopica della sezione delle ferite macchiata H ed E ha rivelato che la lunghezza della neo-epidermide diventa significativamente più lunga il giorno 7 dopo la lesione da ustione rispetto al giorno 3 dopo la lesione da ustioni (Figura 4B). Prima di eseguire uno studio di grandi dimensioni, si raccomanda vivamente ai ricercatori di completare uno studio pilota, che consente l'esplorazione di un nuovo intervento, la valutazione della fattibilità, l'identificazione delle modifiche al metodo per garantire la riproducibilità. Gli effetti statisticamente significativi sono difficili da rilevare nei campioni più piccoli, mentre aumentare la dimensione del campione è un modo per aumentare la potenza statistica di un test. Ad esempio, per rilevare una differenza statisticamente significativa (p < 0,05) nella frequenza di riepitelio delle ferite (Figura 4) tra gruppi, la dimensione del campione deve essere compresa tra sei e otto mouse per gruppo. Tutti gli esperimenti devono essere ripetuti almeno due volte. Come le cellule che producono matrici, come i fibroblasti, migrano dal tessuto ricevente nell'innesto, componenti chiave della matrice extracellulare, tra cui collagene I e fibronectina diventano altamente espressi nella matrice appena formata (Figura 5).
Figura 1: Masterizzazione della configurazione del dispositivo. (A) Posizionamento e configurazione del dispositivo di masterizzazione. Il dispositivo di masterizzazione è collegato al regolatore di temperatura ed è collegato al monometro digitale per consentire il monitoraggio della pressione. Il dispositivo di masterizzazione è sospeso sopra uno stadio regolabile – superficie piana su cui vengono posizionati i topi per l'induzione della combustione. (B-C) Un'immagine ravvicinata del modello in ottone usato per indurre ustioni da ferita. (C) Il diametro del modello di ottone è di 1 cm.
Figura 2: Illustrazione schematica dei diversi passaggi necessari per riprodurre il modello sperimentale descritto in questo articolo. Ci sono tre passaggi principali alla procedura: (i) l'induzione della ferita da ustione utilizzando un modello di ottone preriscaldato; ii) escissione chirurgica del tessuto necrotico non vitale a 24 ore dopo la lesione da ustione; iii) ricostruzione chirurgica della ferita con un innesto cutaneo allogenico a tutto spessore raccolto da un topo donatore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La vista macroscopica delle ferite da ustione da topo ricostruite. Immagini digitali rappresentative delle ferite da ustione ricostruite con innesti cutanei allogenici nei giorni 0, 1, 3 e 7 dopo le lesioni da ustione. Il righello delle immagini è in millimetri. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Comparsa microscopica di ferite a 3 e 7 giorni dopo la lesione da ustione. H&E-macchiato sezioni di ferite 3 e 7 giorni dopo la lesione da ustione. La lunghezza della neo-epidermide (linea tratteggiata) è significativamente aumentata nelle ferite del giorno A (A)rispetto alle ferite del giorno 7 diB. In (A) e (B), la barra della scala è 100 m. (C) Rappresentazione grafica della percentuale di riepitelio della ferita. Questo è stato valutato misurando la lunghezza della neo-epidermide al giorno 3 e 7 lesione post-ustione ed espressa come percentuale dell'intera lunghezza della ferita. I risultati rappresentano la media : S.E.M. (n - 6 topi nel giorno 3 gruppo; n - 6 topi nel giorno 7 gruppo, p < 0.05; test t dello studente). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Valutazione della matrice extracellulare e visualizzazione collagene I. Immagini rappresentative dell'analisi dell'immunosofia il giorno 7 ferite da topo macchiate per collagene (A) e(B)fibronectina. Nota intensa colorazione rossa in cellule I-positive a forma di mandrino allungate. Nota colorazione marrone in cellule fibronectin-positive nel derma delle ferite del giorno 7. Barra della scala: 50 m in tutte le immagini. In (A) e (B), e denota epidermide e d denota il derma. (C) Visualizzazione delle fibre di collagene e valutazione istologica della deposizione di collagene. (D) Rappresentante TPEF / SHG collagene immagine del giorno 7 ferite del mouse. L'acquisizione simultanea di TPEF/SHG mediante polarizzazione circolare e segnali SHG è stata elaborata in modo selettivo per ottenere una distribuzione binaria dello SHG dopo l'applicazione di una soglia. Le immagini TPEF (verde) e SHG (bianco) sono state pseudo-colorate e sovrapposte. Barra di scala : 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Secondo la classificazione dello spessore delle lesioni da ustione23, le ustioni a spessore pieno sono caratterizzate da un evidente coinvolgimento dell'intero spessore della pelle e di una certa porzione del tessuto sottocutaneo. Questo tipo di ferita può guarire solo contrazione o con innesto cutaneo2. Una limitazione intrinseca del metodo descritto in questo articolo è che solo gli innesti di spessore pieno, a differenza degli innesti di spessore diviso, che sono spesso utilizzati nell'ambiente clinico, sono stati raccolti dalla coda di un topo. Ciò era dovuto alla difficoltà tecnica, in quanto la pelle del topo è troppo sottile per ottenere innesti di spessore diviso. Va sottolineato che gli innesti a spessore pieno richiedono un letto di ferita ben vascolarizzato, mentre gli innesti cutanei a spessore diviso sono in grado di sopravvivere nei siti donatori con meno vascolarizzazione24. Studi precedenti hanno dimostrato che una ferita da ustione indotta sul dorso del topo era associata a una robusta formazione di nuova vascolatura5. Ciò suggerisce che un'area ben vascolarizzata, come il dorsum del topo, potrebbe essere considerata come il punto di riferimento anatomico per l'induzione di ferite da ustione.
La profondità della ferita da bruciare è un fattore importante da considerare. La profondità della ferita da ustione deve essere coerente tra i singoli topi. La riproducibilità della profondità della ferita da ustione dipende dalla temperatura del modello di ottone, dalla pressione e dalla durata dell'esposizione al calore. La profondità della ferita da ustione deve essere verificata istologicamente. È importante tenere a mente che una pressione eccessiva o un'esposizione prolungata della pelle al modello di ottone preriscaldato può ferire il tessuto sottostante. Il tessuto che circonda la colonna vertebrale, compresi i componenti del sistema nervoso centrale e periferico, è sensibile al calore e, se danneggiato, può provocare la paralisi delle zampe posteriori.
Anche se nessuna mortalità postoperatoria è stata direttamente associata alla procedura chirurgica, un piccolo numero di topi SKH1-Hrhr senza peli, che sono particolarmente sensibili al freddo, all'ipotermia sviluppata e non sono riusciti a recuperare dopo l'anestesia generale. Pertanto, il calore supplementare deve essere fornito durante tutti gli eventi estetici e la sorveglianza costante è necessaria mentre il mouse è anestetizzato.
Il metodo descritto in questo studio non è stato associato all'infezione del sito chirurgico. Tuttavia, la tecnica asettica deve essere utilizzata per impedire il trasferimento di microrganismi nella ferita chirurgica durante il periodo perioperatorio. L'inoculazione della ferita con microrganismi bioluminescenti o fluorescenti può essere incorporata nella procedura. Questa tecnica può essere utile nello studio degli organismi infettivi e della loro patogenesi25. Ad esempio, l'aggiunta o l'iniezione esogena di batteri bioluminescenti può consentire il monitoraggio del carico microbico utilizzando l'imaging animale intero in vivo25. Dato che i peli di topo sono noti per interferire con la fluorescenza animale in vivo e l'imaging a bioluminescenza, i topi SKH1-Hrhr senza peli sono ospiti ideali per gli studi che coinvolgono reporter fluorescenti o bioluminescenti.
I campioni di tessuto della ferita possono essere raccolti in momenti diversi e trattati per l'analisi istologica e immunohistochimica. Proteine e RNA possono essere isolati dalla biopsia cutanea e le tecniche di biologia molecolare possono essere utilizzate per valutare l'espressione delle molecole chiave coinvolte nella guarigione delle ferite.
Nel presente studio, abbiamo descritto un modello sperimentale di guarigione delle ferite da ustione e innesto della pelle allogenico. Questa procedura può essere modificata e fungere da modello per gli studi preclinici.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da La Direction Générale de L'Armement, l'Agence de l'Innovation de Défense e l'Ecole Polytechnique. Ringraziamo il nostro collega Yann Plantier dell'Ecole Polytechnique che ha fornito approfondimenti e competenze che hanno notevolmente contribuito alla produzione del file video. Gli autori ringraziano benoit Peuteman e Charlotte Auriau dell'INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33, Hotel Paul Brousse, Villejuif per il loro benessere animale e la loro competenza nel campo della cura fornita nel corso di questo progetto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringue | Terumo | SS + 01T1 | |
| 26 G needle | Terumo Agani | NN-2613R | 1/2'' - 0,45 X 12mm |
| 96X21 mm Petri Dish | Dutscher | 193199 | |
| Animal Weighing scale | Kern | EMB 5.2K5 | |
| BALB/c mouse | Janvier labs | BALB/cAnNRj | 6-weeks old |
| Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm | Simport | M476-1 | |
| Bond polymer Refine Red | Leica Biosystems | DS9390 | |
| Brass block | BVG | custom-designed | Circular 10 mm in diameter |
| Buprenorphine (BUPRECARE) | Axience | FR/V/6328396 3/2011 | administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
| Burning apparatus Kausistar 400 | TraçaMatrix | 34010 | |
| CaseViewer | 3DHISTECH Ltd. | 3Dhistech, Budapest, Hungary | |
| Collagen I antibody | Abcam | ab34710 | Recommanded concentration 1:50; 1:200 |
| D-(+)- glucose (Dextrose) | Sigma Aldrich | G-8769-100 ml | |
| DAB | Leica Biosystems | AR9432 | |
| Digital camera | NIKON | D3400 | objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45 |
| Depilating cream | Veet | ||
| Disposable scalpels | Swann Morton | 6601 | |
| DPBS | PAN biotech | P04-36300 | |
| Ethanol absolute | VWR chemicals | 20821.310 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | ab23750 | Recommanded dilution 1:1000 |
| Filter 0.22um | Sartorius | 16532 | |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14094-11 | |
| Forceps Dumont | F.S.T. | 11295-10 | |
| Hair clippers | AESCULAP | B00VAQ4KUY (ISIS) | |
| Heating pad | Petelevage | 120070 | |
| Isofluorane | Piramal healthcare | FR/V/03248850/2011 | |
| Ketamine | Imalgene | FR/V/0167433 4/1992 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg |
| Lactated Ringers solution | Flee-Flex | 1506443 | |
| Lamina multilabel slide scanner | Perkin Elmer | ||
| LAS software | Leica | version 2.7.3 | |
| Leica Bond III | Leica Biosystem | 1757 | |
| Leukosilk dressing | BSN medical | 72669-01 | |
| Lidocaine | Aguettant | N01BB02 | local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
| Manometer | Kern | HDB-5K5 | |
| Masson Trichrome Staining kit | Sigma-Aldrich | HT15-1KT | |
| Micromesh Biopsy cassettes | Simport | M507 | |
| Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope | Leica microsystems | DM500 | Scanner 8000Hz NDD PMT detectors |
| Non adhering dressing Adaptic | Systagenix | A6222 | 12.7cm X 22.9 cm |
| Ocrygel | Tvm France | ### | |
| Paracetamol 300mg | Dolliprane | Liquiz | |
| Paraformaldheyde 4% | VWR chemicals | 1169945 | |
| Povidone-iodine | MEDA pharma | D08AG02 | diluted to 1:2 |
| SKH1-Hrhr mouse | Charles river | 686SKH1-HR | 6-weeks old |
| Slides | Thermoscientific | AGAA000080 | |
| Surgical adhesive | BSN medical | 9927 | |
| Sterile Gauze | Hartmann | 418545/9 | 10 X 10 cm |
| Sterile water | Versylene Fresenius | B230521 | |
| Surgical drape | Hartmann | 2775161 | |
| Ti:Sapphire ChameleonUltra | Coherent | DS 16-02-16 F | 690-1040 nm |
| Thermal imaging Camera | Testo | Testo 868 | |
| Xylazine (Rompum 2%) | Bayer | FR/V/ 8146715 2/1980 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg |
References
- Shakir, S., et al. Indications and Limitations of Bilayer Wound Matrix-Based Lower Extremity Reconstruction: A Multidisciplinary Case-Control Study of 191 Wounds. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2019).
- Greenhalgh, D. G. Management of Burns. New England Journal of Medicine. 380 (24), 2349-2359 (2019).
- Bosse, M. J., et al. An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries. New England Journal of Medicine. 347 (24), 1924-1931 (2002).
- Braza, M. E., Fahrenkopf, M. P. StatPearls. , (2019).
- Duchesne, C., Banzet, S., Lataillade, J. J., Rousseau, A., Frescaline, N. Cold atmospheric plasma modulates endothelial nitric oxide synthase signalling and enhances burn wound neovascularisation. Journal of Pathology. 249 (3), 368-380 (2019).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 266 (2014).
- Pakyari, M., et al. Local Expression of Indoleamine 2,3, Dioxygenase Prolongs Allogenic Skin Graft Take in a Mouse Model. Advances in Wound Care. 8 (2), New Rochelle. 58-70 (2019).
- Pakyari, M., et al. A new method for skin grafting in murine model. Wound Repair and Regeneration. 24 (4), 695-704 (2016).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Current Protocols in Immunology. , Chapter 4, Unit 4 4 (2009).
- Cristobal, L., et al. Local Growth Hormone Therapy for Pressure Ulcer Healing on a Human Skin Mouse Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), (2019).
- Melican, K., Aubey, F., Dumenil, G. Humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Larsen, C. P., et al. Migration and maturation of Langerhans cells in skin transplants and explants. Journal of Experimental Medicine. 172 (5), 1483-1493 (1990).
- Leonard, D. A., Kurtz, J. M., Cetrulo, C. L. Vascularized composite allotransplantation: towards tolerance and the importance of skin-specific immunobiology. Current Opinion in Organ Transplantationt. 18 (6), 645-651 (2013).
- Stoikes, N., et al. Biomechanical evaluation of fixation properties of fibrin glue for ventral incisional hernia repair. Hernia: The Journal of Hernias and Abdominal Wall Surgery. 19 (1), 161-166 (2015).
- Foster, K., et al. Efficacy and safety of a fibrin sealant for adherence of autologous skin grafts to burn wounds: results of a phase 3 clinical study. Journal of Burn Care & Research. 29 (2), 293-303 (2008).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (5), 577-583 (2013).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models of Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
- Wang, X., Ge, J., Tredget, E. E., Wu, Y. The mouse excisional wound splinting model, including applications for stem cell transplantation. Nature Protocols. 8 (2), 302-309 (2013).
- Ruzehaji, N., et al. Pan PPAR agonist IVA337 is effective in prevention and treatment of experimental skin fibrosis. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (12), 2175-2183 (2016).
- Ruzehaji, N., et al. Combined effect of genetic background and gender in a mouse model of bleomycin-induced skin fibrosis. Arthritis Research & Therapy. 17, 145 (2015).
- Singer, A. J., Burn Boyce, S. T. Wound Healing and Tissue Engineering. Journal of Burn Care & Research. 38 (3), 605-613 (2017).
- Shakespeare, P. Burn wound healing and skin substitutes. Burns. 27 (5), 517-522 (2001).
- Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds. Science. 346 (6212), 941-945 (2014).
- Miller, R. J., et al. Development of a Staphylococcus aureus reporter strain with click beetle red luciferase for enhanced in vivo imaging of experimental bacteremia and mixed infections. Scientific Reports. 9 (1), 16663 (2019).
