阳离子肽载体在软骨内转运特性的表征

摘要

本方案用于测定阳离子肽类载体在软骨中的平衡摄取量、渗透深度以及非平衡扩散速率。表征其转运特性对于确保产生有效的生物学响应至关重要。这些方法可用于设计具有最优电荷的药物载体，以靶向带负电荷的组织。

摘要

体内多种带负电荷的组织（如软骨）由于富含带负电荷的聚集蛋白聚糖，对靶向药物递送形成屏障，因此需要改进的靶向方法以提高其治疗效果。由于软骨具有较高的固定负电荷密度，可通过将药物与带正电荷的药物载体结合，利用静电相互作用增强药物在软骨内的传输。因此，研究药物载体的传输行为对于预测药物诱导生物学反应的效能至关重要。本文展示了三种实验的设计方法，可用于定量测定阳离子肽类载体在软骨组织片中的平衡摄取量、渗透深度以及非平衡扩散速率。平衡摄取实验可测量软骨内部溶质浓度相对于周围溶液的比值，有助于预测药物载体在软骨中提高治疗浓度的潜力。利用共聚焦显微镜进行渗透深度研究，可实现溶质从软骨表层向深层区域一维扩散的可视化表征，这对于评估溶质是否到达其基质及细胞靶点具有重要意义。使用定制设计的传输室进行非平衡扩散速率研究，可通过表征荧光标记溶质在组织中扩散速率的方式，测量其与组织基质结合相互作用的强度，这对设计与软骨具有最佳结合强度的载体具有重要价值。综合这三种传输实验所得结果，可为设计具有最优电荷特性的药物载体提供指导，以利用弱且可逆的电荷相互作用实现药物递送应用。这些实验方法还可用于评估药物及药物-药物载体偶联物的传输特性。此外，这些方法也可拓展应用于其他带负电荷组织（如半月板、角膜和玻璃体）的靶向研究。

引言

将药物递送至体内带负电荷的组织仍然是一项挑战，原因是药物难以深入渗透到组织内部，从而无法到达细胞和基质中的靶向作用位点¹。许多此类组织含有密集排列的带负电荷的聚集蛋白聚糖（aggrecans），在组织内形成高密度的负固定电荷（fixed charge density, FCD）²，从而成为大多数大分子药物递送的屏障^3,4。然而，在带正电荷的药物载体辅助下，这种带负电荷的组织屏障反而可通过静电相互作用转变为药物储库，实现持续性的药物递送^1,5,6,7（图 1）。

方案

已获得大学批准，允许使用死亡组织进行实验。牛关节从屠宰场商业采购。

1. 软骨组织块提取

1. 使用解剖刀（#10 刀片）切开并去除脂肪、肌肉、韧带、肌腱及其他所有结缔组织，暴露牛膝关节股骨髌骨沟处的软骨。
2. 使用 3 mm 和 6 mm 的皮肤打孔器，垂直穿入软骨以获取圆柱形软骨组织块。立即将组织块分别放入含有 500 μL 添加了 1% v/v 抗生素-抗真菌剂的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）的 48 孔板各孔中。
3. 将软骨组织块的表层面向下放入切片装置的孔中（图 2）。使用剃刀刀片沿切片装置表面切割组织块，获得包含表层区域的 1 mm 厚软骨组织片。对每个软骨组织块重复此操作。
4. 将软骨组织片分别储存于含有 500 μL 添加蛋白酶抑制剂的 1× PBS（PBS-PI，每 50 mL 1× PBS 中加入 1 片蛋白酶抑制剂小片）的聚丙烯管中，并于 -20 °C 保存。
5. 在进行以下每一项运输实验前，将含有组织片的管子置于 37 °C 水浴中解冻 30 分钟。

结果

在软骨达到平衡吸收CPCs后，当溶质被组织摄取时，浴液的荧光强度会下降。然而，如果终末浴液的荧光值与初始值相近，则表明溶质几乎没有被摄取。另一个确认溶质摄取的依据是，组织是否明显变为荧光染料的颜色。软骨中溶质的定量摄取通过摄取率（R_U）来确定，首先利用标准曲线将荧光值转换为浓度。根据初始浴液浓度（C_Bath,i）和平衡时浴液浓度（C_Bath），可按以下公式计算软骨内的溶质浓度（C_Cartilage），其中V_Bath=300 μL：

使用 C_Cartilage 和.......

讨论

本文所述方法与实验方案对靶向递送药物至带负电荷组织领域具有重要意义。由于这些组织内含有高密度的带负电荷聚集蛋白聚糖（aggrecans），形成了一道屏障，阻碍药物到达深藏于基质中的细胞靶点。为应对这一突出挑战，可通过改造药物，使其结合带正电荷的药物载体，从而增强药物在组织内的转运速率、摄取效率及结合能力^{1,3,4,14,15,16,17,18,19}。如本研究中所展示的方法所示，可对带正电荷药物载体的转运行为进行表征，以确定其平衡摄取量、穿透.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
316不锈钢SAE垫圈	McMaster-Carr	91950A044	适用于5号螺丝，内径0.14"，外径0.312"
96孔聚苯乙烯板	Fisherbrand	12566620	黑色
厚规格丙烯酸板材	Reynolds Polymer	N/A	用于非平衡扩散和一维扩散传输室
抗生素-抗真菌剂	Gibco	15240062	100倍浓度
牛软骨	Research 87	N/A	2-3周龄，股骨髌骨沟来源
牛血清白蛋白	Fisher BioReagents	BP671-1
CPC+14	LifeTein	LT1524	定制设计肽段
CPC+20	LifeTein	LT1525	定制设计肽段
CPC+8	LifeTein	LT1523	定制设计肽段
精密任务擦拭纸	Kimberly-Clark Professional	34155
皮肤打孔器	MedBlades	MB5-1	3、4和6 mm
经济型普通玻璃显微镜载玻片	Fisherbrand	12550A3
平底细胞培养板	Corning Costar	3595	透明，96孔
柔性包裹膜	Bemis Parafilm M Laboratory	1337412
Gold Seal盖玻片	Electron Microscopy Sciences	6378701	#1.5，18x18 mm
锤击式打孔器	McMaster-Carr	3427A15	1/2"直径
锤击式打孔器	McMaster-Carr	3427A19	3/4"直径
激光器	Chroma Technology	AT480/30m	分光光度计激光光源
低强度钢六角螺母	McMaster-Carr	90480A007	6-32螺纹规格
LSM 700共聚焦显微镜	Zeiss	LSM 700
微型磁力搅拌子	Bel-Art Spinbar	F37119-0007	7x2 mm
多用途氯丁橡胶片材	McMaster-Carr	1370N12	1/32"厚度
脱脂干牛乳粉	Sigma Aldrich	M7409
培养皿	Chemglass Life Sciences	CGN1802145	150 mm直径
磷酸盐缓冲液	Corning	21-040-CMR	1倍浓度
板式振荡器	VWR	89032-088
蛋白酶抑制剂	Thermo Scientific	A32953
剃须刀片	Fisherbrand	12640
薄规格R-Cast丙烯酸板材	Reynolds Polymer	N/A	黑色传输室插件
RTV硅胶	Loctite	234323	环氧型，无腐蚀性，透明
手术刀	TedPella	549-3	#10、#11刀片
信号接收器	Chroma Technology	ET515lp	分光光度计激光信号接收器
带盖微量离心管	Eppendorf	22363204	1.5 mL
刮勺	TedPella	13508
Synergy H1微孔板读数仪	Biotek	H1M
镀锌合金钢内六角螺钉	McMaster-Carr	90128A153	6-32螺纹规格，1"长