여기에 제시된 프로토콜은 대소 또는 마우스 뇌 전체에 걸쳐 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 일시적으로 열어 형광 표지 항체를 전달하고 미세 아교세포를 활성화시키는 프로토콜입니다. 또한 조직학에 의한 항체 전달 및 미세아교세포 활성화를 검출하는 방법이 제시된다.
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이 논문에서
요약
초록
뇌 질환을 표적으로 하는 치료 항체의 단지 작은 부분만이 뇌에 의해 흡수된다. 집중 초음파는 혈액 뇌 장벽 (BBB)의 일시적인 개방을 통해 항체의 흡수와 참여를 증가시킬 수있는 가능성을 제공합니다. 우리 실험실에서는 여러 지점을 대상으로 두개골을 통한 집중 초음파 적용과 함께 마이크로 버블을 사용하여 다양한 형식의 항체가 BBB를 통해 전달되는 신경 퇴행성 질환에 대한 치료 접근법을 개발하고 있습니다.이 접근법은 주사 초음파 (SUS)라고 부릅니다. 혈관에 대한 마이크로버블과 초음파의 기계적 효과는 단단한 접합부를 일시적으로 분리함으로써 BBB를 가로지르는 부세포 수송을 증가시키고 소포-매개 트랜스사이토시스를 향상시켜 항체와 치료제가 효과적으로 교차할 수 있게 한다. 또한, 초음파는 또한 항체가 세포체 전체와 심지어 신경 과정으로 분포하는 뉴런과 같은 뇌 세포로 간질성 뇌에서 항체의 흡수를 용이하게합니다. 우리의 연구에서, 형광 표지 된 항체가 준비되고, 사내에서 준비된 지질 기반 마이크로 버블과 혼합되어 SUS가 뇌에 적용되기 직전에 마우스에 주입됩니다. 그런 다음 뇌에서 증가 된 항체 농도가 정량화됩니다. 정상적인 뇌 항상성의 변화를 설명하기 위해, 미세아교세포 식균작용은 세포 마커로 사용될 수 있다. 생성 된 데이터는 항체의 초음파 전달이 신경 퇴행성 질환을 치료하기위한 매력적인 접근법임을 시사합니다.
서론
치료 초음파는 부분적으로 뇌에 대한 치료제의 접근을 촉진함으로써 비침습적 인 방식으로 뇌 질환을 치료하기위한 새로운 기술입니다1,2,3. 뇌 질환을 표적으로 하는 치료 항체의 극히 일부만이 뇌에 흡수되어 뇌에 유지되기 때문에4, 치료 초음파는 그들의 흡수와 표적 참여를 증가시킬 수 있는 가능성을 제공한다5,6.
우리 실험실에서는 마이크로 버블을 사용하여 다양한 형식의 항체가 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)을 가로 질러 전달되는 신경 퇴행성 질환에 대한 치료 접근법을 개발하고 있습니다. 이를 달성하기 위해 초음파는 두개골을 통해 여러 지점에서 뇌에 적용되며 스캔 모드를 사용하여 초음파 (SUS)7라고 부릅니다. 초음파 에너지, 정맥 주사 마이크로 버블 및 뇌 혈관 구조 사이의 기계적 상호 작용은 주어진 초음파 처리 볼륨에서 BBB의 단단한 접합부를 일시적으로 분리하여 항체 및 치료제를 포함한 다....
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프로토콜
모든 동물 실험은 퀸즐랜드 대학의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었다.
1. 사내 마이크로버블 준비
- 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염)의 9:1 몰비를 계량한다. 마이크로버블 용액 1 mL당 0.5 mg의 지질 혼합물이 요구된다. 대안적으로, 지질은 미리 용해된 지질을 사용하여 단계 1.3으로 진행하는 경우 클로로포름에서 이미 구입될 수 있다.
- 지질을 소량의 클로로포름에 유리 비이커에 녹인다.
- 클로로포름을 증발기 또는 질소 스트림으로 증발시킨다.
- 건조된 지질 필름을 0.22 μm 필터를 통해 여과된 PBS + 10% 글리세롤 + 10% 프로필렌 글리콜 용액 10 mL로 재수화시킨다.
- 재수화된 지질 용액을 55°C(지질의 용융 온도 이상)로 설정된 수조 초음파 처리기에 넣고 완전히 용해될 때까지 초음파 처리한다.
- 분취량 지질 용액을 오토클레이브된 1.5 mL HPLC 바이알에 넣고 셉타 캡 위에 나사로 고정시킨다.
- 바이알 내의 모든 공기를 27 G 바늘이 장착된 5 mL 주사기로 흡인하고 바이알에 진공을....
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결과
이 프로토콜을 사용하여 형광 표지 된 항체가 뇌로 전달되고 미세 아교세포 활성화와 함께 검출 될 수 있습니다. 도출 될 수있는 결론은 집중 초음파와 마이크로 버블을 사용하면 항체의 뇌 흡수를 현저하게 향상시키고 주사 모드에서 사용할 때 마우스의 전체 뇌 또는 반구에 항체를 전달할 수 있다는 것입니다. 그림 1은 BBB를 여는 데 사용되는 TIPS 초음파 응용 장치(레이블이 지정된 여러 구성 요소)를 보여 줍니다. 도 2는 마이크로버블이 올바르게 생성될 때 얻어져야 하는 크기 및 농도의 쿨터 카운터 측정으로부터의 대표적인 결과를 보여준다. 전달을 쉽게 시각화하기 위해, 항체를 원거리 적색 형광 염료로 표지하였다. 뇌에 의한 항체 흡수는 적외선 스캐너를 사용하거나 뇌 절편의 형광 현미경을 사용하여 뇌 전체 또는 절편에서 쉽게 시각화 할 수 있습니다. 뇌 절편은 형광 표지된 항체의 위치를 현미경 수준에서 보여준다. 형광 표지된 .......
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토론
형광 표지된 항체는 주사 모드에서 적용된 마이크로버블과 함께 집중된 초음파를 사용하여 뇌에 전달될 수 있다. 항체 전달, 미세아교세포 형태학 및 리소좀 확대는 초음파 주사 후 형광 현미경에 의해 검출될 수 있다. 미세아교세포는 Fc-수용체-매개 과정4에서 항체가 결합한 그들의 리소좀 항체 및 항원을 흡수할 수 있다.
이 방법을 사용하여 반복가능한 BBB 개방 및 항체 전달을 달성하기 위한 다수의 중요한 단계가 있다. 초음파 변환기와 마우스 머리 사이의 양호한 결합을 보장하는 것이 중요합니다. 마우스 머리의 머리카락을 모두 제거하고 커플링에 기포가 없는지 확인하십시오. 사내에서 준비된 마이크로버블의 특성은 성공에 매우 중요합니다. 마이크로버블은 108마이크로 버블/mL의 충분한 농도와 마이크로버블의 90% 이상이 직경이 10μm 미만이 되도록 크기 분포를 가져야 합니다. 이는 더 큰 마이크로버블이 폐에 의해 순환 밖으로.......
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공개 사항
우리는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 Clem Jones AO 박사, 호주 국립 보건 및 의학 연구위원회 [GNT1145580, GNT1176326], 금속 재단 및 퀸즐랜드 주 정부 (DSITI, 과학, 정보 기술 및 혁신부)의 지원을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 | Avanti | 850365C | |
| 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 항체 라벨링 키트 | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 항체 | AbD Serotec | MCA1957GA | 1:1000 희석 사용 |
| 클로로포름 | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| 염소 안티 토끼 IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | 1:500 희석 |
| 염소 안티 토끼 IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | 1:500 희석 사용 |
| 헤드 홀더 (모델 SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 항체 | Wako | 019-19741 | 사용 1:1000 희석 |
| 이미지 분석 소프트웨어 | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| 근적외선 이미징 시스템 Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| 프로필렌 글리콜 | 시그마 - 알드리치 | P4347 | |
| 팁 (치료 이미징 프로브 시스템) | 필립스 연구 | TIPS_007 | |
| 비트 플레인 |
참고문헌
- Choi, J. J., et al. Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer's double transgenic mice using focused ultrasound. Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).
- Lipsman, N., et al.
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재인쇄 및 허가
