После повреждения ДНК, человеческие клетки активируют необходимые пути восстановления для восстановления целостности их генома. Здесь мы описываем метод косвенного иммунофторесценции как средство обнаружения белков восстановления ДНК, анализа их пространственного и временного набора, а также помогаем допросить взаимодействие белково-белкового белка в местах повреждения ДНК.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация взаимодействия белков ДНК по иммунофлюоресценции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Клетки млекопитающих постоянно подвергаются воздействию химических веществ, излучению и естественным метаболическим побочным продуктам, которые создают специфические типы оскорблений ДНК. Генотоксические агенты могут повредить позвоночник ДНК, сломать его или изменить химический характер отдельных оснований. После оскорбления ДНК активируются пути реакции повреждения ДНК (DDR) и набираются белки, участвующие в ремонте. Множество факторов участвуют в зондировании типа повреждения и активации соответствующего ответа на ремонт. Неспособность правильно активировать и набирать факторы DDR может привести к геномной нестабильности, которая лежит в основе многих человеческих патологий, включая рак. Исследования белков DDR могут дать представление о генотоксической реакции препарата и клеточных механизмах лекарственной устойчивости.
Есть два основных способа визуализации белков in vivo:прямое наблюдение, пометки белка интереса с флуоресцентным белком и после него живой визуализации, или косвенные иммунофторесценции на фиксированных образцах. В то время как визуализация флуоресцентно помеченных белков позволяет точно контролировать с течением времени, прямые пометки в N- или C-термине могут помешать локализации или функции белка. Предпочтительнее наблюдение за белками в их немодифицированном эндогенном варианте. Когда белки восстановления ДНК набираются на оскорбление ДНК, их концентрация увеличивается локально, и они образуют группы, или "фоки", которые могут быть визуализированы косвенным иммунофторесценцией с использованием конкретных антител.
Хотя обнаружение белковых очагов не является окончательным доказательством прямого взаимодействия, ко-локализация белков в клетках указывает на то, что они перегруппируются к месту повреждения и могут информировать о последовательности событий, необходимых для сложного образования. Тщательный анализ очагов пространственного перекрытия в клетках, выражаюющих дикий тип или мутантные версии белка, может дать драгоценные подсказки о функциональных областях, важных для функции восстановления ДНК. Наконец, ко-локализация белков указывает на возможные прямые взаимодействия, которые могут быть проверены путем ко-иммунопреципиентации в клетках, или прямого выдвижного использования очищенных белков.
Введение
Клетки человека постоянно подвергаются воздействию различных ДНК-повреждающих веществ различного происхождения. Экзогенные источники в основном состоят из воздействия радиации, химических веществ (включая химиотерапевтические агенты и некоторые антибиотики) и вирусов, в то время как основные эндогенные источники включают ошибки в репликации ДНК и окислительного стресса. Прямые последствия генотоксического воздействия могут варьироваться от модифицированной базы до потенциально смертельного разрыва двойной нити ДНК (DSB), в зависимости от стресса и дозы воздействия. В конечном счете, невосстановимые или неправильно отремонтированные повреждения ДНК могут привести к нак....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Культура клеток HeLa
- Предварительно обработать круглые стеклянные крышки с 1 M HCl при 50 градусов по Цельсию в течение 16-18 часов. Промыть ddH2O и хранить в 100% EtOH.
- Подготовка среды клеточной культуры: добавьте 10% (v/v) FBS к среде DMEM.
- Выращивайте 4,0 х10 4 клетки/ну в стерильной пластине 12-колодец с 18-мм круглым стеклянным крышкой при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 во влажном инкубаторе. Выращиваемые клетки до 80% стечения (примерно 24 часа).
2. Клеточная обработка с радиацией (IR)
- Чтобы вызвать образование двухтяговых разрывов, подвергайте клетки 4 Г....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На второй день, или 24 ч после посева клеток на крышки, клетки претерпели одно деление и 80% стечения. Конкретные нокдауны или мутации в белках восстановления ДНК могут увеличить время удвоения, или сенсибилизировать клетки для генотоксического лечения, и плотность посева, а также дозы лечения должны быть скорректированы соответствующим образом. Для определения наилучших условий труда, сроки реакции повреждения ДНК могут быть установлены путем западного blotting из QH2AX с течением времени, и чувствительность к облучению.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Анализ сроков и эффективности ремонта повреждений ДНК с помощью микроскопии оказался необходимым для понимания того, как функционирует механизм восстановления ДНК, в нормальных клетках и в патологиях человека, таких как рак.
Разработка специфических антител, позволяющих обнаруживать активированные белки в их фосфорилированной версии (например, NOH2AX, pRPA, pRAD50 идр. 10,,23,,39,,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторов нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом Фонда района Сан-Антонио. Онкологический центр Мэйс поддерживается NCI онкологический центр поддержки основной грант P30 CA054174. Мы хотели бы поблагодарить Стивена Холлоуэя за помощь в поиске реагентов, а также лабораторию Sung за предоставление пространства и микроскопии.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 16% (v/v) параформальдегида (PFA) водный раствор | Электронная микроскопия Sciences | 15710 | Микроскопия Качество PFA обеспечивает наилучшие изображения. Если вы используете «самодельный PFA», отфильтруйте перед использованием. |
| Рекомендуется принимать бычий сывороточный альбумин (БСА) | Sigma-Aldrich | A3059 | Фракция теплового шока, чтобы избежать осадков/фона. |
| Покровное стекло #1, 18 мм круглое (покровные стекла) | Покровные стекла Neuvitro | NC0308920 | необходимо очистить и простерилизовать перед использованием с помощью HCl или этанола. |
| DMEM, высокий уровень глюкозы [(+) 4,5 г/л D-глюкозы, (+) L-глутамин, (-) пируват натрия] | Gibco | 11965118 | Отрегулируйте питательную среду в соответствии с потребностями используемой клеточной линии. |
| DPBS, без кальция, без магния | Gibco | 14190144 | PBS для культивирования тканей. |
| Этиленгликоль-бис(&бета;-аминоэтиловый эфир)-N,N,N′,N′-тетрауксусная кислота (EGTA) | Research Products International | E57060 | Ядерный экстракционный буфер. |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Life Technologies | 104370028 | Качество FBS можно оценить путем тестирования формирования очагов gH2AX. Если в партии присутствуют следы генотоксического эндотоксина, gH2AX будет положительным при отсутствии стресса. |
| Хлорид магния (MgCl2) | Research Products International | M24000 | Ядерный экстракционный буфер. |
| Пиперазин-N,N′-бис(2-этансульфоновая кислота) (PIPES) | Research Products International | P40150 | Ядерный экстракционный буфер. |
| крепление SlowFade Diamond Antifade с DAPI | Invitrogen | S36973 | 300 нМ DAPI с монтажной средой VECTASHIELD Antifade |
| Хлорид натрия (NaCl) | Research Products International | S23020 | Ядерный экстракционный буфер. |
| Sucrose | Research Products International | S24060 | Буфер для извлечения ядер. |
| предметные стекла для микроскопа Superfrost Plus | Fisherbrand | 1255015 | полизиновые предметные стекла. |
| TC-обработанные многолуночные пластины, размер 12 лунок | Costar | 3513 | Посев на покровные стекла производится в 12-луночную пластину. |
| Triton X-100 | AmericanBio | AB02025 | Ядерный экстракционный буфер. |
| фермент TrypLE Express (1X), No Phenol Red | Gibco | 12604021 | Trypsin-EDTA. |
| Trypsin-EDTA (0,5%), No Phenol Red | Gibco | 15400054 | TrypLE. |
Ссылки
- Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), 016600(2015).
- Jalan, M., Olsen, K. S., Powell, S. N.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
