Analisi del metabolismo delle cellule dell'assassino naturale umano

Sommario

In questo articolo, descriviamo un metodo per misurare la glicolysi e la respirazione mitocondriale nelle cellule dell'assassino naturale umano primario (NK) isolate dal sangue periferico, a riposo o dopo l'attivazione indotta da IL15. Il protocollo descritto potrebbe essere facilmente esteso alle cellule NK umane primarie attivate da altre citochine o stimoli solubili.

Abstract

Le cellule natural killer (NK) mediano principalmente risposte immunitarie anti-tumorali e anti-virali innate e rispondono a una varietà di citochine e altri stimoli per promuovere la sopravvivenza, la proliferazione cellulare, la produzione di citochine come i programmi di interferone gamma (IFNγ) e/o citotossicità. L'attivazione delle cellule NK mediante stimolazione della citochina richiede un sostanziale ristrutturazione delle vie metaboliche per supportare i loro requisiti bioenergetici e biosintetici. C'è un grande corpo di prove che suggerisce che il metabolismo delle cellule NK alterato è associato a una serie di malattie croniche tra cui l'obesità e il cancro, che evidenzia l'importanza clinica della disponibilità di un metodo per determinare il metabolismo delle cellule NK. Qui descriviamo l'uso di un analizzatore di flusso extracellulare, una piattaforma che consente misurazioni in tempo reale del consumo di glicolisi e ossigeno mitocondriale, come strumento per monitorare i cambiamenti nel metabolismo energetico delle cellule NK umane. Il metodo qui descritto consente anche il monitoraggio dei cambiamenti metabolici dopo la stimolazione delle cellule NK con citochine come IL-15, un sistema attualmente in fase di studio in una vasta gamma di studi clinici.

Introduzione

Le cellule Natural Killer (NK) sono linfociti innati che mediano risposte anti-tumorali e anti-virali. Le cellule NK comprendono il 5-15% di tutti i linfociti nel sangue periferico umano e possono essere trovate anche nella milza, nel fegato, nel midollo osseo e nei linfonodi. Le cellule NK non esprimono recettori polimorfici clonotipici, come i recettori delle cellule T (TCR) o i recettori delle cellule B (BCR). Al contrario, l'attivazione delle loro funzioni citolitiche è stimolata dall'impegno di recettori che riconoscono liganti invariabili sulla superficie di una cella bersaglio^1,2.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con i principi etici di ricerca medica di Helsinki. I campioni di sangue periferico dei donatori sono stati ottenuti dal Dipartimento di Medicina trasfusionale niH nell'ambito del protocollo approvato dall'IRB 99-CC-0168, con il consenso informato scritto del paziente.

1. Preparazione del reagente

1. Reagenti per l'isolamento delle cellule NK
   NOTE: Preparare questi reagenti in una cappa di coltura cellulare.
   1. Preparare il buffer di separazione NK: Supplemento PBS (pH 7.4) con 1 mM EDTA e 2% Fetal Calf Serum (FCS) che in precedenza è stato inattivato t....

Risultati

L'isolamento delle cellule NK dal sangue periferico fornisce una popolazione pura e vitale

L'analisi extracellulare del flusso si basa sulla misurazione^della concentrazione di H e O₂ nel pozzo e non distingue tra le diverse popolazioni di cellule o la loro vitalità. Per questo motivo, ottenere una popolazione altamente pura e vitale della cellula di interesse è stato il passo chiave per avere successo in questi esperimenti.

L'i.......

Discussione

In questo articolo, abbiamo stabilito un protocollo per isolare e cultire in modo efficiente le cellule NK umane primarie pure e vitali dal sangue periferico. Abbiamo anche ottimizzato le condizioni per la misurazione dell'attività metabolica di queste cellule NK valutate dal tasso di consumo di ossigeno e dal tasso di acidificazione extracellulare utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Rispetto ad altri metodi respirometrici, l'analizzatore di flusso extracellulare è veloce, richiede un numero ridotto di .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-Deossi-D-glucosio (2-DG)	MilliporeSigma	D8375-5G	Glicolisi stress test iniettore
composto 2,4-Dinotrofenolo (2,4-DNP)	MilliporeSigma	D198501	ETC disaccoppiatore / mitocondriale stress test iniettore composto
96 pozzetti Piastra per colture cellulari / Fondo rotondo con coperchio	Costar	3799	NK coltura cellulare
Antimicina A	MilliporeSigma	A8674	Complesso III inibitore / glicolisi e test da sforzo mitocondriale composto iniettore
BD FACSDIVA Software	BD Biosciences		Acquisizione dati di flusso
BD LSR Fortessa	BD Biosciences		Acquisizione dati di flusso
Cell-Tak	Corning	354240	Adesivo cellulare
CyQUANT saggio di proliferazione cellulare	ThermoFisher Scientific	C7026	Saggio di proliferazione cellulare per la quantificazione del DNA. Contiene tampone per lisi cellulare e colorante CyQUANT GR
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II	Tecnologie Stemcell	17851	Isolamento di cellule NK da PBMC
Kit di arricchimento di cellule NK umane EasySep Tecnologie	Stemcell	19055	Isolamento di cellule NK da PBMC
Tecnologie EasySep Magnet	Stemcell	18001	Isolamento di cellule NK da PBMC
EDTA 0,5 M, pH 8	Qualità Biologico	10128-446	NK vendere
tampone di separazione Provette FACS	Falcon-Fisher Scientific	352235	Esperimento di citometria a flusso
Falcon 50 ml Provette coniche	Falcon-Fisher Scientific	14-432-22	NK Separazione cellulare
fetale di vitello (FCS)	Gibco	10437-028	NK tampone di separazione cellulare
FlowJo Software	BD Biosciences		Analisi dei dati di flusso
Glucosio	MilliporeSigma	G8270	Componente del mezzo di prova da sforzo mitocondriale. Composto iniettore per test da sforzo di glicolisi
Cocktail di inibitori della proteasi ThermoFisher	Scientific	78429	Inibitore della proteasi 100X. Utilizzare nel tampone di lisi RIPA
Stimolazione cellulare NK	umana	Peprotech	200-15-50ug
Siero umano (HS)	Valley Biomedical	9C0539	Integratore di terreno per colture cellulari
NK IMDM	Gibco	12440053	cellule NK terreno di coltura
L-Glutammina (200 mM)	ThermoFisher Scientific	25030-081	Componente del terreno per test da sforzo
LIVE/DEAD Kit di colorazione per cellule morte Aqua fissabile	ThermoFisher Scientific	L34965	Colorante di vitalità per la colorazione con citometria a flusso
LSM	mpbio	50494X	Separazione di PBMC dal sangue umano
Topo anti-umano CD3 BV711	BD Biosciences	563725	Colorazione con citometria a flusso con cellule T
Topo anti-umano CD56 PE	BD Pharmingen	555516	NK colorazione con citometria a flusso
Topo anti-umano NKp46 PE	BD Pharmingen	557991	NK colorazione con citometria a flusso
Oligomicina	MilliporeSigma	75351	Complesso V inibitore / test da sforzo mitocondriale composto iniettore
PBS pH 7.4	Gibco	10010-023	Cellula NK tampone di separazione
Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCA	ThermoFisher Scientific	23225	Per la determinazione della concentrazione proteica
RIPA Buffer	Boston BioProducts	BP-115	Lisi cellulare
Rotenone	MilliporeSigma	R8875	Inibitore del complesso II / glicolisi e composto iniettore per test da sforzo mitocondriale
Seahorse Software di controllo	Agilent		Controller per l'analizzatore Seahorse XFe96
Seahorse Wave Desktop Software	Agilent		Per l'analisi dei dati
Seahorse XF Base Medium	Agilent	102353-100	Base di saggio del flusso extracellulare Medium
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent		Analizzatore di flusso extracellulare
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	Include 20 piastre per colture cellulari XF96, 18 cartucce per sensori XFe96, guide di caricamento per il trasferimento dei composti nella cartuccia del saggio e 1 flacone di soluzione calibrante (500 ml).
Bicarbonato di sodio	MilliporeSigma	S5761	Per preparare la soluzione Cell-Tak
Piruvato di sodio (100 mM)	ThermoFisher Scientific	11360-070	Componente del terreno per test da sforzo mitocondriale

Siero