Summary

Analisi del metabolismo delle cellule dell'assassino naturale umano

Published: June 22, 2020
doi:

Summary

In questo articolo, descriviamo un metodo per misurare la glicolysi e la respirazione mitocondriale nelle cellule dell’assassino naturale umano primario (NK) isolate dal sangue periferico, a riposo o dopo l’attivazione indotta da IL15. Il protocollo descritto potrebbe essere facilmente esteso alle cellule NK umane primarie attivate da altre citochine o stimoli solubili.

Abstract

Le cellule natural killer (NK) mediano principalmente risposte immunitarie anti-tumorali e anti-virali innate e rispondono a una varietà di citochine e altri stimoli per promuovere la sopravvivenza, la proliferazione cellulare, la produzione di citochine come i programmi di interferone gamma (IFNγ) e/o citotossicità. L’attivazione delle cellule NK mediante stimolazione della citochina richiede un sostanziale ristrutturazione delle vie metaboliche per supportare i loro requisiti bioenergetici e biosintetici. C’è un grande corpo di prove che suggerisce che il metabolismo delle cellule NK alterato è associato a una serie di malattie croniche tra cui l’obesità e il cancro, che evidenzia l’importanza clinica della disponibilità di un metodo per determinare il metabolismo delle cellule NK. Qui descriviamo l’uso di un analizzatore di flusso extracellulare, una piattaforma che consente misurazioni in tempo reale del consumo di glicolisi e ossigeno mitocondriale, come strumento per monitorare i cambiamenti nel metabolismo energetico delle cellule NK umane. Il metodo qui descritto consente anche il monitoraggio dei cambiamenti metabolici dopo la stimolazione delle cellule NK con citochine come IL-15, un sistema attualmente in fase di studio in una vasta gamma di studi clinici.

Introduction

Le cellule Natural Killer (NK) sono linfociti innati che mediano risposte anti-tumorali e anti-virali. Le cellule NK comprendono il 5-15% di tutti i linfociti nel sangue periferico umano e possono essere trovate anche nella milza, nel fegato, nel midollo osseo e nei linfonodi. Le cellule NK non esprimono recettori polimorfici clonotipici, come i recettori delle cellule T (TCR) o i recettori delle cellule B (BCR). Al contrario, l’attivazione delle loro funzioni citolitiche è stimolata dall’impegno di recettori che riconoscono liganti invariabili sulla superficie di una cella bersaglio1,2.

Le cellule NK umane a riposo isolate dal sangue periferico possono sopravvivere per diversi giorni in una coltura media integrata con siero umano. L’attivazione delle cellule NK da parte di citochine come IL-15 o IL-2 spinge le cellule alla proliferazione e ad un aumento della loro capacità diuccidere, tragli altri effetti 3,4,5. Diversi studi hanno dimostrato una correlazione diretta tra l’attivazione delle cellule NK e i cambiamenti nella loro attivitàmetabolica 6. Questi cambiamenti metabolici sono destinati a soddisfare i particolari requisiti delle cellule in termini di energia e biosintesi.

Le cellule e gli organismi aerobici ottengono energia attraverso una serie di reazioni chimiche che coinvolgono il catabolismo e l’ossidazione di carboidrati, grassi e proteine. Attraverso una combinazione di glicolisi, ciclo di acido tricarboxylico (TCA) e fosforilazione ossidativa, le cellule eucariotiche soddisfano la maggior parte della loro domanda ATP e ottengono gli intermedi necessari come elementi costitutivi per le macromolecole essenziali per la crescita e la proliferazione delle cellule. Il processo di glicolysis (Figura 1A) inizia con l’immissione di glucosio nella cella. Nel citosol, il glucosio viene fosforiato e trasformato in piruvato (con una produzione netta di 2 molecole di ATP per molecola di glucosio), che può essere ridotto a lattato o trasportato nei mitocondri per essere trasformato in Acetil-CoA ed entrare nel ciclo TCA. Il ciclo TCA continua a pedalare alimentato con più molecole di Acetil-CoA e produce CO2 (che alla fine si diffonderà al di fuori della cellula e, reagendo con H2O nel mezzo, genererà acido carbonico che porterà all’acidificazione del mezzo) e NADH, la molecola incaricata di donare elettroni alla catena di trasporto elettronico (ETC). Gli elettroni viaggiano attraverso diversi complessi proteici e sono finalmente accettati dall’ossigeno. Questi complessi (I, III e IV) pompano anche H dalla matrice mitocondriale nello spazio intermembrana. Come conseguenza del gradiente elettrochimico generato,l’H – entreranno di nuovo nella matrice attraverso il complesso V (ATP-synthase), investendo l’energia potenziale accumulata nella generazione di ATP.

Sia la glicolysis che la respirazione mitocondriale possono essere bloccate in punti diversi utilizzando inibitori. La conoscenza e l’uso di questi inibitori è stata la base per lo sviluppo del flusso extracellulare. Misurando due semplici parametri in tempo reale come il pH e l’ossigeno, l’analizzatore di flusso extracellulare deduce il tasso di glicolysi e respirazione mitocondriale in una piastra a 96 ben. Il test di stress della glicolysi viene eseguito in un mezzo basale senza glucosio (Figura 1B)7. Le prime misurazioni del tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) sono indicative dell’acidificazione indipendente dalla glicosisi. Si riferisce come acidificazione non glicolicotica e correla con CO2 prodotto dal TCA che, come spiegato in precedenza, si combina con H2O nel mezzo pergenerare H (ECAR collegato alla TCA). La prima iniezione è glucosio per indurre l’utilizzo del glucosio e aumentare la glicolysis. La seconda iniezione combina sia rotenone, un inibitore I complesso, e antimicina A, un inibitore Complex III insieme, per bloccare l’ETC. Le cellule rispondono a questa drammatica diminuzione della produzione di ATP mitocondriale attivando la glicolysis per mantenere i livelli di ATP cellulare, e questo rappresenta la quantità di glicolisi che non viene utilizzata dalla cellula nello stato basale, ma potrebbe essere potenzialmente reclutata in risposta agli aumenti della domanda di ATP (compensatore). La terza iniezione è il glucosio analogico 2-Deoxyglucose (DG), che compete con il glucosio come substrato per l’esochinasi enzimatica. Il prodotto di questa fosforilazione, 2-deossiglucosio-6-fosfato non può essere trasformato in piruvato, e quindi la glicolysis è bloccata, che abbassa l’ECAR al suo minimo. L’ECAR misurato a questo punto comprende altre fonti di acidificazione extracellulare che non sono attribuite alla glicoolisi o all’attività respiratoria, nonché qualsiasi glicolisi residua non completamente inibita da 2-DG (post 2-DG-acidificazione).

Il test di stress mitocondriale viene eseguito in un mezzo con glucosio (Figura 1C) 8. Le prime misurazioni del tasso di consumo di ossigeno (OCR) corrispondono alla linea di base della respirazione mitocondriale (respirazione basale). La prima iniezione è l’oligomicina, che inibisce il ritorno dei protoni attraverso la sintesi ATP (V complesso), bloccando la sintesi ATP e quindi iperpolarizzare rapidamente la membrana mitocondriale, che impedisce un ulteriore pompaggio di protoni attraverso complessi respiratori e porta ad una diminuzione dell’OCR. Il confronto tra la respirazione di base e il valore dato dall’aggiunta di oligomicina rappresenta la respirazione collegata all’ATP. Il rimanente tasso di consumo di ossigeno insensibile all’oligomicina è chiamato perdita di protoni, che rappresenta il flusso di protoni attraverso il bistrato lipidico o le proteine nella membrana mitocondriale interna come il translocase adenina nucleotide9. La seconda iniezione è il disaccoppiatore 2,4-dinitrophenol (DNP), un ionoforo che induce un ingresso massiccio di H nella matrice mitocondriale, che porta alla depolarizzazione della membrana mitocondriale e interruzione della sintesi ATP mitocondriale. Le cellule rispondono alla dissipazione della forza protone-motivo aumentando il tasso di trasporto di elettroni e consumo di ossigeno ai livelli massimi nel tentativo inutile di recuperare il potenziale della membrana (capacità respiratoria massima). La differenza tra la capacità respiratoria massima e la respirazione basale è la capacità respiratoria di riserva della cellula, che rappresenta la quantità di respirazione che non viene utilizzata dalla cellula per generare ATP nello stato basale, ma potrebbe essere potenzialmente reclutata in risposta all’aumento della domanda di ATP o in condizioni di stress8. La terza iniezione è una combinazione di rotenone e antimicina A. Questa iniezione ferma completamente l’ETC e l’OCR diminuisce al suo livello più basso, con il consumo rimanente di ossigeno non mitocondriale (causato da NADPH-oxidasi, ecc.).

I cambiamenti nelle vie metaboliche potrebbero in qualche modo prevedere il funzionamento delle cellule NK, in quanto è stato suggerito che l’attivazione continua delle cellule NK con citochine in vitro potrebbe portare all’esaurimento delle cellule NK dallo studio di diverse vie metaboliche10,11. La correlazione tra lo stato metabolico delle cellule NK e la funzione è molto importante dal punto di vista dell’immunoterapia del cancro. In questo campo, l’attivazione di cellule NK con infusione di IL-15, da solo o in combinazione con anticorpi terapeutici monoclonali sono stati testati al fine di migliorare l’uccisione delle cellule tumorali12,13,14. La conoscenza dello stato metabolico delle cellule NK in risposta a queste strategie di trattamento fornirebbe un valido predittore dello stato di attivazione delle cellule NK e della funzione di uccisione.

Lo studio delle vie metaboliche in altre cellule mieloidi e linfoidi come monociti, cellule T e B è statodescritto 15 e sono stati pubblicati metodi ottimizzati16. In questo protocollo forniamo un metodo che combina sia un protocollo di isolamento NK che produce un numero elevato di cellule NK pure e vitali sia un protocollo ottimizzato per misurare l’attività metabolica utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Qui mostriamo che questo è un metodo valido per lo studio dei cambiamenti metabolici nel riposo e IL-15 attivato cellule NK umane. Per il test del flusso extracellulare, sono stati testati e ottimizzati parametri come il numero di cellule e le concentrazioni di farmaci. Rispetto ad altri metodi respirometrici, l’analizzatore di flusso extracellulare è completamente automatizzato e in grado di testare in tempo reale, con quantità molto basse di cellule, fino a 92 campioni contemporaneamente, e quindi consente screening ad alta velocità effettiva (con più campioni e repliche) in modo relativamente rapido17.

Questo metodo può essere utilizzato da ricercatori interessati a valutare la funzione cellulare NK studiando il metabolismo delle cellule NK. Potrebbe essere applicato anche alle cellule attivate da altre citochine, anticorpi o stimoli solubili.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con i principi etici di ricerca medica di Helsinki. I campioni di sangue periferico dei donatori sono stati ottenuti dal Dipartimento di Medicina trasfusionale niH nell’ambito del protocollo approvato dall’IRB 99-CC-0168, con il consenso informato scritto del paziente. 1. Preparazione del reagente Reagenti per l’isolamento delle cellule NKNOTE: Preparare questi reagenti in una cappa di coltura cellulare.<o…

Representative Results

L’isolamento delle cellule NK dal sangue periferico fornisce una popolazione pura e vitale L’analisi extracellulare del flusso si basa sulla misurazionedella concentrazione di H e O2 nel pozzo e non distingue tra le diverse popolazioni di cellule o la loro vitalità. Per questo motivo, ottenere una popolazione altamente pura e vitale della cellula di interesse è stato il passo chiave per avere successo in questi esperimenti. L…

Discussion

In questo articolo, abbiamo stabilito un protocollo per isolare e cultire in modo efficiente le cellule NK umane primarie pure e vitali dal sangue periferico. Abbiamo anche ottimizzato le condizioni per la misurazione dell’attività metabolica di queste cellule NK valutate dal tasso di consumo di ossigeno e dal tasso di acidificazione extracellulare utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Rispetto ad altri metodi respirometrici, l’analizzatore di flusso extracellulare è veloce, richiede un numero ridotto d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano il Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) per il sostegno e la discussione. Questo studio è stato sostenuto dai programmi di ricerca intramurali del National Institutes of Health, National Cancer Institute e National Heart, Lung, and Blood Institute. JT è supportato dal programma Ramon y Cajal (grant RYC2018-026050-I) di MICINN (Spagna).

Materials

2-Deoxy-D-glucose (2-DG) MilliporeSigma D8375-5G Glycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) MilliporeSigma D198501 ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid Costar 3799 NK cell culture
Antimycin A MilliporeSigma A8674 Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA Software BD Biosciences Flow data acquisition
BD LSR Fortessa BD Biosciences Flow data acquisition
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assay ThermoFisher Scientific C7026 Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II Stemcell technologies 17851 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment Kit Stemcell technologies 19055 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Magnet Stemcell technologies 18001 NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8 Quality Biological 10128-446 NK sell separation buffer
FACS tubes Falcon-Fisher Scientific 352235 Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubes Falcon-Fisher Scientific 14-432-22 NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10437-028 NK cell separation buffer
FlowJo Software BD Biosciences Flow data analysis
Glucose MilliporeSigma G8270 Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78429 Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15 Peprotech 200-15-50ug NK cell stimulation
Human serum (HS) Valley Biomedical 9C0539 NK cell culture medium supplement
IMDM Gibco 12440053 NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030-081 Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit ThermoFisher Scientific L34965 Viability dye for flow cytometry staining
LSM mpbio 50494X PBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711 BD Biosciences 563725 T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PE BD Pharmingen 555516 NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PE BD Pharmingen 557991 NK flow cytometry staining
Oligomycin MilliporeSigma 75351 Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4 Gibco 10010-023 NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225 For determination of protein concentration
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115 Cell lysis
Rotenone MilliporeSigma R8875 Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller Software Agilent Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop Software Agilent For data analysis
Seahorse XF Base Medium Agilent 102353-100 Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent Extracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonate MilliporeSigma S5761 To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360-070 Component of mitochondrial stress test medium

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Cite This Article
Traba, J., Waldmann, T. A., Anton, O. M. Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (160), e61466, doi:10.3791/61466 (2020).

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