Summary
We tonen de automatisering van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcelculturen (hiPSC) culturen en neuronale differentiaties die compatibel zijn met geautomatiseerde beeldvorming en analyse.
Abstract
Handmatige cultuur en differentiatie protocollen voor de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) zijn moeilijk te standaardiseren, tonen een hoge variabiliteit en zijn gevoelig voor spontane differentiatie in ongewenste celtypes. De methoden zijn arbeidsintensief en zijn niet gemakkelijk vatbaar voor grootschalige experimenten. Om deze beperkingen te overwinnen, ontwikkelden we een geautomatiseerd celkweeksysteem gekoppeld aan een beeldvormingssysteem met hoge doorvoer en implementeerden we protocollen voor het onderhouden van meerdere hiPSC-lijnen in parallelle en neuronale differentiatie. We beschrijven de automatisering van een korte-termijn differentiatie protocol met behulp van Neurogenin-2 (NGN2) over-expressie om hiPSC-afgeleide corticale neuronen te produceren binnen 6\u20128 dagen, en de uitvoering van een lange termijn differentiatie protocol om hiPSC-afgeleide midbrain dopaminergische (mDA) neuronen te genereren binnen 65 dagen. Ook hebben we de NGN2-benadering toegepast op een kleine molecuul-afgeleide neurale precursorcellen (smNPC) die met GFP lentivirus werden getransduced en een live-cel geautomatiseerde neuriet-uitgroeitesten hebben vastgesteld. We presenteren een geautomatiseerd systeem met protocollen die geschikt zijn voor routinematige hiPSC-cultuur en differentiatie in corticale en dopaminerge neuronen. Ons platform is geschikt voor lange termijn hands-free cultuur en high-content / high-throughput hiPSC-gebaseerde compound, RNAi en CRISPR / Cas9 screenings om nieuwe ziekte mechanismen en drug doelen te identificeren.
Introduction
Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) zijn zelfvernieuwend en kunnen zich onderscheiden in bijna elk volwassen celtype. Deze kenmerken maken hiPSC een nuttig hulpmiddel voor ziektemodellering in fundamenteel onderzoek en medicijnontdekking1. Het menselijk iPSC behoudt de donorgenetische achtergrond die het mogelijk maakt ziekterelevante celtypen af te leiden die het meest worden aangetast/betrokken bij het ziekteverloop, bijvoorbeeld verschillende neuronale subtypen voor neurodegeneratieve ziekten2,3. Ook, hiPSC overwint een aantal van de beperkingen van dierlijke en cellulaire over-expressie modellen door het modelleren van ziekten in een menselijke context en fysiologische eiwit expressie niveaus, en hebben bewezen een waardevolle troef in het modelleren van ziekten, variërend van monogene, complexe en epigenetische aandoeningen, evenals late ziektes4.
Ondanks deze voordelen en mogelijkheden, verschillende beperkingen van hiPSC nog steeds moeten worden aangepakt. De huidige hiPSC cultuur- en differentiatieprotocollen zijn niet kosteneffectief, moeilijk te standaardiseren en arbeidsintensief. Handmatige cultuurstappen kunnen leiden tot een hoge variabiliteit in de opbrengsten en fenotypes als gevolg van verschillen in groei en spontane differentiatie van hiPSC. Daarom moet de variatie op experimenten worden verminderd door meer gestandaardiseerde verwerkingstechnieken te implementeren en protocollen te vereenvoudigen die met automatisering kunnen worden bereikt5. De invoering van geautomatiseerde hiPSC-cultuur- en differentiatieprotocollen zal gemeenschappelijke normen vaststellen voor zowel academische als industriële onderzoeksprojecten, en zal het mogelijk maken biologisch relevante ziektemodellen en meer reproduceerbare resultaten te genereren.
Eerder werk heeft geprobeerd automatisering van hiPSC culturen6,7,8, maar hun protocollen zijn beperkt tot specifieke cel cultuur plaat formaten afhankelijk van het systeem en gebrek aan aanpassingsvermogen aan verschillende test formaten. Dergelijke systemen zijn nuttig bij het ophopen van cellen, maar zijn mogelijk niet geschikt voor geautomatiseerde differentiatie in gewenste celtypen, ziektefenotypering en screeningsdoeleinden. Bovendien is een grootschalig geautomatiseerd platform voor fibroblast afleiding, hiPSC-generatie en -differentiatie beschreven9, maar op een schaal die alleen kan worden bereikt door laboratoria met een hoge doorvoer die zich toeleggen op de productie van lijnen die aantrekkelijk lijken, maar voor veel academische laboratoria onbetaalbaar kunnen zijn.
We ontwikkelden een volledig geautomatiseerd celkweeksysteem op basis van een vloeistofbehandelingsstation in een high-efficiency particulate air (HEPA)-gefilterde omgeving in combinatie met een CO2-incubator met grote capaciteit, een brightfield imaging cytometer en een robotarm voor plaattransport. Deze componenten vormen de basis voor stabiele en reproduceerbare hiPSC cultuur en differentiatie. We hebben het systeem aangevuld met een geautomatiseerd -20 °C opslagsysteem voor samengestelde of virusopslag en een high-speed draaiende schijfconfocale live-cel imager. Er werden op maat gemaakte protocollen gegenereerd die geautomatiseerde celzaaien, mediawijzigingen, samenvloeiingscontroles, celexpansie en het genereren van testplaats met monsterbehandeling en plaatbeeldvorming mogelijk maakten, waardoor het systeem compatibel is met screenings met een hoog inhoud/hoge doorvoer. Het geautomatiseerde celcultuur- en beeldverwerkingssysteem wordt bediend met behulp van de besturingssoftware en de op maat gemaakte grafische gebruikersinterface (GUI). Met de GUI kunnen gebruikers CSV-bestanden importeren die cellijnspecifieke parameters bevatten die nodig zijn voor de uitvoering van de methode. Bovendien maakt de GUI het mogelijk om tal van experimenten in elke reeks te plannen met behulp van de ingebouwde kalenderweergave, waardoor volledige controle over de tijd wanneer elke methode wordt gestart.
Ons geautomatiseerde celkweeksysteem maakt gebruik van gestandaardiseerde pipettingsnelheden, doorlooptijden, samenvloeiingsdrempels, zaaidichtheid en middelgrote volumes met de flexibiliteit om cellen te kweken in verschillende plaatformaten (96-, 48-, 24-, 12-, 6- of 1-well plaatformaat). We hebben een recent gepubliceerd protocol voor differentiatie op korte termijn aangepast voor het omzetten van hiPSC in neuronen die TUBB3-positieve neuronen kunnen opleveren in 6 dagen10,11. We hebben ook de geautomatiseerde differentiatie en beeldvorming van kleine molecuul neurale precursor cellen (smNPC) in neuronen constitutief uitdrukken GFP onder EF1a promotor12 en iPSC in midbrain dopaminergische (mDA) neuronen, aanpassing van een eerder gepubliceerde dual-SMAD remming protocol13 dat mDA neuronen levert binnen 65 dagen.
Protocol
1. Basisprocedures voor het automatiseren van celculturen en beeldvorming
- Laad nieuwe cultuurplaten en tips
- Open de GUI en klik op de knop Resource/Instrument-procesweergave. Als u een resource/instrumentproces wilt uitvoeren, selecteert u het resource/instrumentproces en klikt u op de knop Instrument-proces uitvoeren.
- Voer het resourceproces RunHepaHood en Reloading uit (zie stap 1.1.1). Open de deur, laad de celkweekplaten en wegwerptips in de overeenkomstige positie zoals aangegeven in de pop-up afbeelding op de controlerende pc.
- Veeg de deur af met 70% ethanol voor ontsmetting en sluit deze. Voer het instrumentproces Ontsmetting uit de GUI uit (zie stap 1.1.1). Het systeem wordt gesteriliseerd door UV-straling gedurende 30 min.
- Navulcultuurmedia en/of dissociatiereagens
- Voer de instrumentstap RunHepahood uit (zie stap 1.1.1). Open de voordeur van het vloeistofbehandelingsstation. Ontsmetting reservoirs (met media, PBS en / of dissociatie reagens) met 70% ethanol en leg ze op het dek naar de toegewezen positon (zoals gedefinieerd in cfg.csv bestand). De reservoirs de deksel afdekken.
- Ontsmet de deur met 70% ethanol en sluit deze. Power down de HEPA kap door het uitvoeren van de resource / instrument proces "InitHepaHood" van de GUI.
- Een nieuwe "Cellijn" maken en projecteren in de GUI
- Maak/wijzig de door de gebruiker gedefinieerde "Celregel"-bestanden bestaande uit de Config (*.cfg.csv), de import (*.imp.csv), de bron (*.rsv.csv) en de werkstroom (*.wfl.csv) bestanden.
- Open de GUI en maak een nieuwe 'Celregel' door op de knop Celregel toevoegen in de weergave 'Cellijneditor' te klikken. Er wordt een wizard geopend waar het Config-bestand moet worden geselecteerd en een projectnaam met een korte beschrijving moet worden ingevoerd.
- Navigeer door deze wizard met de groene pijlpunt en bevestig de instellingen door op het groene vinkje te klikken. Maak een nieuw project voor de gegenereerde 'Celregel' door op de knop Project toevoegen te klikken.
- Voer een projectnaam en -beschrijving in en definieer een projectkleur die zichtbaar is in de agendaweergave van de GUI. Navigeer naar de volgende pagina van de wizard door op de pijlpunt te klikken.
- Maak een nieuwe batch door op de knop Batch toevoegen te klikken en een korte naam en beschrijving te geven in het pop-upvenster. Selecteer alle processtappen en plan de begintijd voor elk van de processtap. Sluit het venster door op OKte klikken.
- Een geautomatiseerde methode uitvoeren met de GUI
- Ga naar de agendaweergave van de GUI en klik op de knop Processtap toevoegen.
- Selecteer de celregel en kies na het navigeren naar de volgende pagina van de wizard het project. Markeer de te gebruiken batch en klik op de pijlpunt die naar rechts wijst. Afhankelijk van de gebruikte methode moeten de batches leeg zijn (voor het ontvangen van nieuwe platen), of kweekplaten of testplaten bevatten (alle andere processen).
- Navigeer naar de volgende pagina van de wizard en selecteer de processtap die wordt uitgevoerd. Ga naar de laatste pagina van deze wizard en plan het experiment. In de sectie 'Parameterdetails' kunnen variabelen die nodig zijn om de methode uit te voeren, worden gewijzigd. Bevestig dit door op OKte klikken.
- Laden van cultuur- en testplaten in de CO2-incubator
OPMERKING: 1-well platen worden gedefinieerd als kweekplaten, omdat ze vaak worden gebruikt om bulkcellen. Alle multi-well platen zijn gedefinieerd als testplaten.- Voer het instrumentproces "RunHepaHood" uit vanuit de GUI zoals beschreven in stap 1.1.1. en open de deur voor de robotarm.
- Veeg de onderkant van de testplaten af met 70% ethanol en een pluisvrij weefsel als platen worden geladen voor geautomatiseerde beeldvorming. Plaats cultuur of testplaten op de linkerplank. Zorg ervoor dat de oriëntatie van de plaat correct is. Voor testplaten moet A1 naar de robotarm wijzen, terwijl de randen van cultuurplaten naar rechts moeten wijzen.
- Veeg de deur af met 70% ethanol voor ontsmetting en sluit deze.
- Voer de methode "Loading Of Culture Plates" uit voor het importeren van 1-well platen of "Loading Of Assay Plates" voor het importeren van multi-well platen zoals beschreven in stap 1.4. Gebruik een lege batch om beide methoden uit te voeren. Als er al barcodes op de plaat aanwezig zijn in deze batch, schakelt u deze uit door op de selectievakjes te klikken.
- Transporteert afzonderlijke platen van het schap naar het CO2 incubatorplatform met behulp van de robotarm. Het ingebouwde plaatshuttlestation haalt de plaat op en slaat ze op in een van de rekken van de CO2-incubator. De cellen worden gehandhaafd op 37 °C en 5% CO2.
- Lossen van platen uit de CO2-incubator
- Voer de methode "Platen lossen" uit (zie stap 1.4). Selecteer de partij met de platen die moeten worden geëxporteerd. Individuele platen kunnen worden geselecteerd door hun barcodes.
- Transporteren van de platen uit de CO2 incubator naar de linker plank met behulp van de robotarm.
- Start de HEPA-kap met behulp van het instrumentproces "RunHepaHood" zoals beschreven in stap 1.1.1. en open de deur voor de robotarm. Verwijder de platen, ontsmet de deur met 70% ethanol voordat u deze sluit en de HEPA-kap uitstuurt.
2. Automatiseringsprotocollen
- Zaaien van platen uit buizen
- Start de HEPA-kap door het instrumentproces RunHepaHood uit te voeren (zie stap 1.1.1). Open de deur voor het vloeistofbehandelingsstation. Voer de buis van 50 mL in met de celsuspensie en de-deksel van de buis.
- Open de deur voor de robotarm en laad gecoate kweekplaten voor het ontvangen van cellen op de plank. Ontsmetten en sluit beide deuren. Voer de methode "Zaaien van platen uit buizen" uit (zie stap 1.4).
- Tel cellen op de brightfield imaging cytometer met behulp van direct cel tellen functie. Voor het tellen van cellen, gebruik 16 putten als replica's in een 384-well plaat formaat.
- Transporteer de 384-goed telplaat van het dek naar de brightfield imaging cytometer via de draaitafel met behulp van de robotarm en start het beeldvormingsproces. De cytometer bepaalt automatisch het celnummer per milliliter. Breng de telplaat terug naar zijn oorspronkelijke positie met behulp van de robotarm.
- Vervoer een gecoate cultuur of testplaat van de plank naar het pipettingdek met behulp van de robotarm. Verwijder coating- en zaadcellen in het door de gebruiker gedefinieerde getal en volume dat geschikt is voor het plaatformaat (zie tabel 1). Verplaats de plaat naar de on-deck shaker voor 10 s bij 500 rpm voor celdistributie en breng over naar de CO2 incubator.
- Geautomatiseerde samenvloeiingsbeoordeling
- Voer de methode "Confluency controleren" uit zoals beschreven in stap 1.4. Selecteer een batch die ten minste één kweekplaat en geen testplaten bevat. In de sectie "Parameterdetails" voert u "iPSCf_2020" in voor instellingen voor het verwerven van afbeeldingen en beeldanalyse.
- Transporteer de eerste plaat van de CO2 incubator naar de brightfield imaging cytometer via de draaitafel met behulp van de robotarm.
- Uitvoeren van beeldvorming van cellen in de brightfield imaging cytometer voor samenvloeiingscontrole van hiPSC kolonies. Gebruik "samenvloeiings"-toepassing en afbeelding 13 velden van de 1-bron paté en bereken automatisch het gemiddelde gebied bezet door cellen.
- Breng de plaat terug naar de CO2 incubator met behulp van de robotarm. Herhaal stap 2.2.2. tot 2.2.4. voor de overige platen.
- Media verandering van cultuur platen of test platen
- Voer de methode "Media Change Of Culture Plates" uit zoals beschreven in stap 1.4. en selecteer een batch met alleen kweekplaten. Stel de variabele in die aangeeft of tips of naalden worden gebruikt voor de pipetstappen in de sectie "Parameterdetails". Voor mediaverandering van een multi-well plaat voert u de methode "Media Change Of Assay Plates" uit en selecteert u een batch met testplaten.
- Transporteren van de individuele platen van de CO2 incubator naar het dek met behulp van de robotarm en de-deksel van de platen. Kantel de platen automatisch en activeer oude media en gooi ze weg in de afvalinzamelmodule. Voeg 12 mL verse media toe. De plaat opnieuw dekselen en de platen met behulp van de robotarm terug naar de CO2-incubator brengen.
- Subteelt
OPMERKING: Voer het instrumentproces "RunHepaHood" uit vanuit de GUI zoals beschreven in punt 1.1.1. en open de voordeur van het vloeistofbehandelingsstation. Beladingsmedia en dissociatiereagens op de vereiste posities (zie stap 1.2). Als tips opnieuw moeten worden ingevuld, gebruikt u de "Herladen" zoals beschreven in stap 1.1. Voer een buis van 50 mL in voor het ontvangen van de celopening en de-deksel van de buis.- Voer de methode "Subcultivatie van aanhangende cellen" uit (zie stap 1.4). Selecteer de batch met kweekplaten die subteelt nodig hebben.
- Transporteren van de platen van de CO2 incubator naar het dek met behulp van de robotarm en de-deksel van de platen. Kantel de platen automatisch en verwijder oude media en gooi ze weg in de afvalinzamelmodule. Was cellen eenmaal met 8 mL PBS. Voeg 8 mL van 0,5 mM EDTA toe voor clump based passaging. Incubeer op het dek voor 8 min.
- Haal de EDTA-oplossing uit de platen en gooi deze weg in de afvalinzamelmodule. Voeg 12 mL vers medium toe en transporteer de platen naar de shaker. Schud bij 2000 tpm gedurende 1 min om de kolonies te verjagen.
- Triturate de cel suspensie voor vijf cycli van pipetting om de iPSC kolonies te breken in een kleiner formaat (~ 50\u201280 μm). Breng de celsuspensie over in een buis van 50 mL op het dek. Zaadcellen automatisch zoals beschreven in stap 2.1.5 met een gesplitste verhouding van 1 op 7.
OPMERKING: Optioneel, eencellige passaging. Een enkele celsuspensie genereren met eencellig dissociatiereageagens (zie tabel met materialen). In plaats van 0,5 mM EDTA in stap 2.4.2., gebruik 8 mL enkelcellig dissociatiereage en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C. Verzamel de celsuspensie in een buis van 50 mL en voeg evenveel media toe. Dissociatie met behulp van de eencellige dissociatie reagens vereist een handmatige stap om de cellen pellet. Centrifugecellen op 300 x g gedurende 3 minuten. Verwijder de supernatant en resuspend de celpellet in 12 mL van de vereiste media en ga verder met "Zaaien van platen uit buizen" (zie stap 2.1). Vul de media aan met 2 μM thiazovivin op de dag van zaaien bij het gebruik van eencellige suspensie van hiPSC's.
- Geautomatiseerde high-content, hoge doorvoer beeldvorming
LET OP: De meetinstelling moet beschikbaar zijn (zie Aanvullend dossier 1: stap 1.1). De te beelden platen zijn verkrijgbaar in de couveuse.- Voer de methode "Imaging" uit (zie stap 1.4). Selecteer een batch die ten minste één testplaat en geen kweekplaat bevat. Voer in de sectie "Parameterdetails" het plaattype, de plaatdefinities (voor standaard 96-well beeldplaten: "Plaat-96-20170918113842") en de naam van de meetinstelling in.
- Transporteer de testplaat via de draaitafel naar de geautomatiseerde confocale microscoop met behulp van de robotarm om het beeldvormingsproces te starten. Recupereer de plaat aan het einde van de beeldvorming uit de microscoop en transporteer deze terug naar de CO2-incubator. Herhaal het proces van de resterende platen in de batch.
3. Geautomatiseerd onderhoud en uitbreiding van hiPSC
-
De volgorde van geautomatiseerde samenvloeiingscontroles, mediawijzigingen en subteelt
- Zaadcellen op 1-well platen met behulp van "Zaaien van platen uit buizen" methode (zie stap 2.1). U ook handmatig ingezaaide 1-well platen importeren met behulp van de methode Laden van kweekplaat (zie stap 1.5).
- Plan dagelijks geautomatiseerde samenvloeiingscontroles om de groei van kolonies van dag 1 tot dag 6 van de cultuur voor iPSC te monitoren (zie stap 2.2).
- Vernieuw de media elke tweede dag met behulp van de methode "Media change of culture plates" (zie stap 2.3). Per plaat wordt 12 mL medium gebruikt.
- Start op dag 6 het proces "Subcultivatie" (zie stap 2.4.).
4. Automatische differentiatie
- Menselijke iPSC naar corticale NGN2 neuronen
OPMERKING: Handmatige hiPSC-voorbereiding. Het protocol omvat overexpressie van NGN2 met behulp van lentivirale vectoren voor levering. Transduce hiPSC met NGN2 naar rTTA3 lentivirus in een 1:2 ratio (> ~107 TU/mL). Cellen worden vervolgens geselecteerd voor één passage met 0,5 μg/mL puromycine. Een gedetailleerd protocol voor het genereren van stabiele hiPSC-NGN2-lijnen bevindt zich in het aanvullende bestand 1: stap 2.- Ga verder met het proces "Subcultivatie" zoals beschreven met behulp van het dissociatiereagensagemiddel met één cel beschreven in noot 2.4.4. wanneer hiPSC 70\u201280% samenvloeiing bereikt
- Verwijder de supernatant en zet de celpellet opnieuw op in 12 mL NGN2-media (Tabel van materialen) met 2,5 μg/mL doxycycline (dox) en 2 μM thiazovivin.
- Start differentiatie met behulp van de methode "Het zaaien van platen uitbuizen" (zie stap 2.1). Stel de gewenste zaaidichtheid van iPSC in op 30.000/cm2 (zie tabel 1). De iPSC is verguld op voorgecoate platen met 0,1 mg/mL poly-L-ornithine (PLO) en 5 μg/mL laminine.
OPMERKING: 1-well platen hebben de voorkeur voor RNA en proteomics-gebaseerde studies, terwijl de 96-well plaat formaat heeft de voorkeur voor imaging experimenten. Andere testplaatformaten zoals 48-, 24-, 12- of 6-putplaten kunnen ook worden gebruikt. - Op dag 1 van differentiatie vernieuwt u de media met behulp van de "Media change of assay plates (zie stap 2.3) met behulp van NGN2 medium, aangevuld met 2,5 μg/mL dox en 10 μM N-[2S-(3,5-difluorophenyl)acetyl]-L-alanyl-2-fenyl-glycine, 1,1-dimethylethylester (DAPT). Ga elke 2\u20123 dagen verder met mediawijzigingen tot de gewenste dag van differentiatie (zie stap 2.3).
- Voer op dag 4 van differentiatie een andere mediaverandering uit (zie stap 2.3.) met behulp van NGN2-medium aangevuld met 10 ng/mL neurotrofe factor (BDNF), 10 ng/mL glial cell-derived neurotrofie factor (GDNF) en 10 ng/mL neurotrofe factor 3 (NT-3) om de rijping te verbeteren. Exporteer aan het einde van het experiment de kweekplaten uit het systeem voor downstream-experimenten (zie stap 1.6).
- Kleine molecuul neurale precursorcellen (smNPC) naar NGN2-neuronen
LET OP: Ontlenen smNPC volgens de aangepaste versie van gepubliceerd protocol12 (zie Aanvullend bestand 1: stap 5). Wijzig de smNPC met NGN2 en rTTA3 virus (zie Aanvullend bestand 1: stap 2). Een ronde NGN2 en rTTA transductie is voldoende om een stabiele populatie te genereren. Verder wijzigen smNPC met pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus waardoor live-cel monitoring uit te voeren. Een veelheid van infectie (MOI) van 10 wordt gebruikt voor GFP lentivirale transductie.- Passage smNPC bij het bereiken van samenvloeiing met behulp van single cell dissociatie reagens zoals beschreven in stap 2.4. Opmerking.
- Zaadcellen met behulp van het geautomatiseerde celkweeksysteem bij een celdichtheid van 50.000/cm2 met behulp van de methode "Zaaien van platen uit buizen" (zie stap 2.1.) op vooraf gecoate platen met 0,1 mg/mL PLO, en 5 μg/mL laminine in NGN2 medium aangevuld met 2,5 μg/mL dox.
- Voer op dag 3 een mediawijziging uit (zie stap 1.3.) met behulp van een nieuw NGN2-medium met 2,5 μg/mL dox en 10 μM DAPT. Na dag 3 voert u elke derde dag mediawisselingen uit met een nieuw NGN2-medium met 2,5 μg/mL dox, BDNF, GDNF en NT-3 op elk 10 ng/mL.
- Beeldcellen dagelijks met behulp van de "Automated high content, high throughput imaging" methode (zie stap 2.5) voor het monitoren van differentiatie status met behulp van GFP als uitlezing voor neurite uitgroei. Stel het laservermogen in op 80% en gebruik een belichtingstijd van 30 ms. Een groot aantal velden (bijvoorbeeld 25 velden) verwerven met 20x doelstelling.
- Batchafbeeldingsanalyse
- Voer beeldanalyse uit met beeldanalysesoftware 1, met behulp van de neurite-uitgroeisjabloon.
- Open de software. Selecteer de optie Gegevens en blader naar de map met beeldgegevens en klik op ok om gegevens te laden die moeten worden geanalyseerd. Klik op openen en selecteer protocol in de bovenste menubalk en selecteer in het toepassingsmenu neurite-uitgroei. Ga naar "algoritmen" en gebruik het kanaal "488" om de kern, het cellichaam en de neurite te definiëren. Pas de drempelparameters voor elke.
- Selecteer de putten die moeten worden gebruikt voor beeldanalyse. Klik rechtsonder op de koppeling en selecteer functies die moeten worden geanalyseerd, zoals het gemiddelde aantal cellen, de totale totale skeletlengte totaal. Ga verder met "pre-analyseren" gevolgd door "preview".
- Controleer of de preview-instellingen acceptabel zijn en start de analyse in de batchmodus. De resultaten zijn beschikbaar in de bovenliggende map onder 'rapporten' in .csv bestandsindeling die in excel kan worden geopend.
OPMERKING: Het script voor beeldanalyse is op aanvraag beschikbaar. - Plot gemiddelde neuriet lengte verkregen door de totale neurite lengte genormaliseerd naar celnummer.
5. Geautomatiseerde differentiatie van hiPSC in midbrain dopaminerge (mDA) neuronen
- Handmatige hiPSC-voorbereiding
- Dissociate 70\u201280% confluent hiPSC in enkele cellen met behulp van de single cell dissociatie reagens. Kortom, incubeercellen met eencellig dissociatie reagens (100 μL/cm2) gedurende 30 minuten bij 37 °C, celsuspensie verzamelen in een conische buis, centrifuge op 200 x g gedurende 5 min en resuspend cell pellet in iPSC cultuurmedium.
- Zaad 200.000 cellen/cm2 op extracellulaire matrixgecoate 1-well platen en iPSC cultuurmedium aangevuld met 10 μM Y-27632. Kweekcellen 's nachts bij 37 °C en 5% CO2.
- Geautomatiseerde differentiatie: Fase 1
- Bereid het geautomatiseerde cultuursysteem voor zoals beschreven in stap 1.1\u20121.2.
- Laad kweekplaten met cellen in de CO2-incubator van het geautomatiseerde kweeksysteem (zie stap 1.5).
- Bereid KSR-medium (zie Tabel van materialen)en vul aan met kleine moleculen (zie tabel 2) die nodig is voor aanvang dag 0 van differentiatie. Gebruik alleen vers bereide media met kleine moleculen en groeifactoren.
- Voer mediaveranderingen uit van de kweekplaten zoals beschreven in stap 2.3 op dag 0 en 1 van differentiatie en vervolgens elke tweede dag tot dag 25.
- Vanaf dag 5 verschuift de formulering van de media geleidelijk zoals in tabel 3in detail beschreven .
- Voeg op dag 11 het mDA-neuron differentiatiemedium toe aangevuld met CHIR (tot dag 13), BDNF, AA1, GDNF, db-cAMP, TGFß3 en DAPT (zie de tabel met materialen).
- Op dag 25 lossen platen (zie stap 1.6.)
- Handmatig opnieuw repliceren 1
- Dissociate dag 25 mDA precursoren in enkele cellen met behulp van de eencellige dissociatie reagens. Kortom, incubeercellen met eencellige dissociatie reagens (100 μL/cm2) gedurende 40 min bij 37 °C, celsuspensie verzamelen in een conische buis, centrifuge op 200 x g gedurende 5 min en resuspend cell pellet in mDA neuron differentiatie medium.
- Zaad 400.000 cellen/cm2 in 1-well kweekplaten voorgecoat met 0,1 mg/mL PLO, 10 μg/mL laminine en 2 μg/mL fibronectine in mDA neuron differentiatie medium aangevuld met 10 μM Y-27632 (tot dag 26) en kleine moleculen en groeifactoren beschreven in tabel 2. Kweekcellen 's nachts bij 37 °C en 5% CO2.
- Geautomatiseerde differentiatie: Fase 2
- Belast kweekplaten met mDA-neuronen in de CO2-incubator van het geautomatiseerde kweeksysteem zoals beschreven in stap 1.5
- Bereid het medium mDA-neurondifferentiatie voor (zie Tabel van materialen)en vul aan met kleine moleculen en groeifactoren die nodig zijn voor de uiteindelijke differentiatie vanaf dag 26 (zie tabel 2).
- Voer mediaveranderingen uit van cultuurplaten zoals beschreven in stap 2.3 op dag 26 van differentiatie en vervolgens elke 3\u20124 dagen tot dag 65.
OPMERKING: Voor hoge-doorvoer beeldvorming doeleinden, wordt aanbevolen om de mDA neuronen replate in 96-put platen bij lage dichtheid op dag 32 van differentiatie, zoals beschreven in stap 5.5.
- Handmatig opnieuw repliceren 2
- Ontlaad cultuurplaten zoals beschreven in stap 1.6. Dissociate dag 32 mDA neuronen in enkele cellen zoals beschreven in stap 5.3.1.
- Zaad 100.000 cellen/cm2 in 96-well platen voorgecoat met 0,1 mg/mL PLO, 10 μg/mL laminine en 2 μg/mL fibronectine in mDA neuron differentiatie medium aangevuld met 10 μM Y-27632 (tot dag 33) en kleine moleculen en groei en groei (zie tabel 2). Kweekcellen 's nachts bij 37 °C en 5% CO2.
- Op dag 33, vervang medium door vers voorbereide DA neuronen differentiatie medium aangevuld met kleine moleculen en groeifactoren (zonder Y-27632). Verander medium handmatig om de 3\u20124 dagen tot dag 65.
6. Immunostaining, geautomatiseerde high-throughput image acquisition en analyse
-
Fluorescentie kleuring
- Uitvoeren fluorescerende immunostaining zoals beschreven in het aanvullende bestand 1: stap 4.
- Afbeeldingscellen zoals beschreven in het aanvullende bestand 1: stap 1.2.
- Upload beeldbestanden die door het beeldverwerkingssysteem worden gegenereerd naar de beeldanalysesoftware 2 (zie Tabel van materialen)voor verdere beeldanalyse, zoals beschreven in stap 6.2.
-
Beeldanalyse met behulp van de software voor beeldanalyse 2
- Zodra imaging bestanden worden geüpload in beeldanalyse software 2, ga naar de "image analysis" functie en bouwen van de analyse algoritme met behulp van de drop down menu.
- Selecteer kernen met behulp van de taak "kernen zoeken", die gebieden detecteert op de afbeelding die behoort tot celkernen (hier gekleurd met Hoechst). Sluit kernen uit dode cellen (pyknotische kernen) door een drempel voor kerngebied of diameter vast te stellen.
- Selecteer het celcytoplasma met de taak "zoek cytoplasma". Deze taak detecteert regio's rond kernen die behoren tot celcytoplasma. Neem alleen goed gesegmenteerde cellen op. Sluit mitotische, apoptotische en slecht gesegmenteerde cellen uit. Verwijder cellen die de rand van de afbeelding raken.
- Voeg de taken toe "morfologie-eigenschappen berekenen" en 'intensiteitseigenschappen berekenen'. De morfologieparameters omvatten de berekening van morfologie-eigenschappen, zoals het gebied voor een gebied van belang. De intensiteitsparameters omvatten de berekening van intensiteitseigenschappen, zoals gemiddelde intensiteit voor een gebied van belang (bijvoorbeeld cytoplasma van neuronen).
- Selecteer een subpopulatie (bijvoorbeeld TH-positieve neuronen) van de invoerpopulatie (alle cytoplasma's geselecteerd) met behulp van een of meer voorwaarden, morfologie en/of intensiteit.
OPMERKING: Meestal wordt intensiteit gekozen voor neuronen. Op basis van negatieve controles is het mogelijk om te definiëren boven welke intensiteitsdrempel de neuronen als positief worden beschouwd voor TH. - Definieer de uitvoerresultaten. Dit is de laatste bouwsteen van elke analyse. Het definieert de test uitlezing waarden voor elke put van een cultuur plaat (resultaten per goed).
- Voer de batchanalyse uit en exporteer de resultaten. Normaliseer het aantal positieve cellen naar het totale aantal kernen en vertegenwoordig gegevens als het percentage positieve cellen.
7. Kwantitatieve real-time polymerase kettingreactie (qRT-PCR)
- Voer het qRT-PCR-protocol uit zoals beschreven in het aanvullende bestand 1: stap 3.
Representative Results
Onze geautomatiseerde celcultuur en beeldvorming systeem is ontworpen om menselijke interventie waardoor we de teelt van hiPSC en differentiatie standaardiseren in verschillende celtypes zoals corticale of midbrain dopaminerge (mDA) neuronen te minimaliseren. Een schematisch overzicht van ons geautomatiseerde celkweeksysteem met geïntegreerde beeldvormingsapparaten is afgebeeld in figuur 1. De eerste introductie van celculturen in dit geautomatiseerde celkweeksysteem kan worden gedaan door cellen automatisch uit een buis van 50 mL te zaaien of door de methode "Loading Of Culture Plates" of "Loading Of Assay Plates" te gebruiken voor de invoer van kweek- of testplaten. Een centraal onderdeel van ons systeem is het vloeistofbehandelingsstation waar alle vloeibare overdrachtsstappen zoals mediawijzigingen of subcultivaties worden uitgevoerd. De op maat gemaakte decklay-out van de vloeistofafhandelaar is vertegenwoordigd in figuur 2. Het vloeistofbehandelingsstation is uitgerust met vier standen. Er kunnen maximaal vier platen van de couveuse naar het dek worden overgebracht, waardoor parallelle mediaveranderingen mogelijk zijn. Aangezien in de subteeltmethode, zowel de moeder als de dochtercultuurplaten op het dek moeten worden aangepast, is het maximumaantal cultuurplaten dat parallel wordt verwerkt beperkt tot twee. Een belangrijk kenmerk van het vloeibare behandelingsstation is de mogelijkheid om de platen tijdens mediaverandering voor volledige verwijdering van celkweeksupernatant te kantelen. Ook is het vloeistofbehandelingsstation uitgerust met shakers voor het bevoordelen van enzymatische dissociatie van cellen tijdens de uitvoering van het subteeltprotocol. Ons geautomatiseerde cultuursysteem is ook uitgerust met twee beeldvormende systemen: een brightfield imaging cytometer voor het uitvoeren van celtellings- en samenvloeiingscontroles en daarom het monitoren van de celgroei in de tijd, en een dubbele draaiende schijfconfocale microscoop voor snelle, hoge inhoud en hoge resolutie beeldvorming van cellen.
De hiPSC culturen worden dagelijks gecontroleerd op groei op de brightfield imaging cytometer en geanalyseerd voor percentage van de samenvloeiing. De brightfield afbeelding in het linker paneel en in het rechterpaneel een groen masker uit de analyse van de brightfield beeld verkregen met de cytometer (Figuur 3A). In de loop der tijd wordt een homogene hiPSC-groei waargenomen, zoals blijkt uit de samenvloeiingspercentages van twee hiPSC-lijnen (n = 4 platen) die parallel worden gekweekt en van dag 1 tot en met dag 6 aan samenvloeiingscontroles worden onderworpen (figuur 3B). Bij het bereiken van de ingestelde drempel, de hiPSC worden doorgang. De cellijnen werden handmatig gekweekt (m) of door het automatiseringssysteem (a) en waargenomen voor het onderhoud van typische stamcelmorfologie voor ten minste twee passages, representatieve brightfield-beelden(figuur 4A). De hiPSC gekweekt handmatig (niet getoond) of in het geautomatiseerde systeem vertoonde de typische stamcelmarkering OCT4 (rood) en SSEA4 (groen), zoals blijkt uit de immunofluorescentietest(figuur 4B). De expressie van de pluripotentiemarkers OCT4, NANOG en REX1 werd ook op mRNA-niveau beoordeeld door qRT-PCR (figuur 4C). Relatieve kwantificeringen werden uitgevoerd met monsters verzameld uit één cellijn die handmatig (m) en in het geautomatiseerde kweeksysteem (a) in duplicaten (repliceert 1 en 2) werden gekweekt. De expressieniveaus van alle drie de pluripotentiemarkeringen in de replica's die in het geautomatiseerde cultuursysteem worden gecultiveerd, zijn vergelijkbaar met merkexpressie na handmatige cultuur. Op dag 8 (D8) was de expressie van pluripotentiemarkeringen afwezig in corticale neuronen gedifferentieerd (Diff) van hiPSC.
Een belangrijke toepassing van het geautomatiseerde cultuursysteem is de differentiatie van hiPSC in verschillende celtypen, waaronder neuronen. Hier tonen we de differentiatie van hiPSC in neuronen met behulp van de NGN2-strategie, die een zuivere corticale neuroncultuur produceert in een zeer korte tijd (ongeveer 6 dagen). Neuronen gedifferentieerd in het geautomatiseerde kweeksysteem (a) presenteerden vergelijkbare morfologie en neuronale netwerkorganisatie als de neuronen die handmatig (m)(figuur 5A)werden gecultiveerd. Geautomatiseerde gedifferentieerde corticale neuronen waren positief voor TUBB3 (neuron-specifieke klasse III β-tubuline, red) en BRN2 (bovenste corticale laagmarker, groen)(figuur 5B),vergelijkbaar met handmatig gedifferentieerde neuronen (niet getoonde gegevens). De expressie van neuronale markers, waaronder het microtubuli-geassocieerde eiwit 2(MAP2),het neurale celadhesiemolecuul(NCAM1)en Synapsin-1(SYN1),evenals de corticale neuronmarkers BRN2 en CUX1 (bovenste corticale laag) werden verrijkt in neuronen op dag 8 (D8) van differentiatie(figuur 5C). Zeer lage of geen expressie van deze markers werd waargenomen in hiPSC. Relatieve kwantificeringen werden uitgevoerd met monsters verzameld uit één cellijn die handmatig (m) en in het geautomatiseerde kweeksysteem (a) in duplicaten (repliceert 1 en 2) werden gekweekt. De expressieniveaus in replica's vertonen vergelijkbare verschillen tussen handmatige en geautomatiseerde differentiaties.
De geïntegreerde beeldvormingscapaciteit van het geautomatiseerde cultuursysteem maakt handsfree gegevensverzameling mogelijk voor de gezondheid van culturen, waardoor op lange termijn geautomatiseerde acquisitie van fenotypische uitlezingen mogelijk is. Met behulp van de NGN2-benadering van een kleine molecuul afgeleide neurale precursor (smNPC) lijn getransduceerd met GFP lentivirus, hebben we een live-cel geautomatiseerde neuriet ontgroeitest in welke neurite lengte werd gemeten over 11 dagen van differentiatie zonder handmatige interventie. De complexiteit van de neuriet nam in de loop van de tijd toe, zoals blijkt uit het gebied dat op dag 1, 3 en 11 met neurites is bezet, de GFP-expressie en gemaskerde beelden uit de analyse(figuur 6A, B). De toename van de neurietlengte van dag 1 tot 11 van de differentiatie werd gekwantificeerd en vertoonde een vergelijkbare ontwikkeling in verschillende putten. Omwille van de eenvoud, gegevens van slechts 3 kolommen met 6 putten elk van een 96-put plaat wordt afgebeeld in de representatieve grafiek, hoewel alle binnenste 60 putten werden geanalyseerd (Figuur 6C).
Een andere toepassing van het hier getoonde geautomatiseerde cultuursysteem is de differentiatie van hiPSC in mDA neuronen. De differentiatie is gebaseerd op mediawijzigingen naar aanleiding van een vooraf vastgesteld protocol en werd uitgevoerd op het geautomatiseerde cultuursysteem van dag 0 tot 65. Geautomatiseerde mediawijzigingen hebben geen celloslating of andere visueel detecteerbare veranderingen in de differentiatie veroorzaakt. Aan het einde van de differentiatie, op dag 65, tonen mDA-neuronen cellulaire organisatie en morfologie (sferische soma, lange en stekelige dendrites) vergelijkbaar met handmatige differentiatie(figuur 7A, B). Op mRNA-niveau tonen mDA-neuronen die in het geautomatiseerde kweeksysteem zijn gedifferentieerd de expressie van respectievelijk neuronale en mDA-markers, MAP2 en TH (tyrosine hydroxylase)(figuur 7C). Beide differentiaties genereerden aanzienlijke hoeveelheden TH en MAP2 positieve neuronen(figuur 7D).
Figuur 1: Schematisch overzicht van het geautomatiseerde celcultuur- en beeldvormingsplatform.
Het systeem is ontworpen met een polycarbonaat behuizing en twee HEPA kappen (A en B) uitgerust met vier UV-lampen zorgen voor een steriele omgeving voor celcultuur toepassingen. Celkweekplaten worden geladen op planken voor de robotarm die toegankelijk is via de voordeur (C). De platen worden geladen in de CO2 incubator (D) met een capaciteit van 456 platen. Een brightfield cell cytometer (E) wordt gebruikt voor samenloopcontroles en celtelling tijdens subteeltroutines. Het vloeistofbehandelingsstation bevindt zich onder een van de HEPA-kappen (B). De deklay-out van de vloeistofafhandelaar wordt beschreven in figuur 2. De pipetting arm van de vloeistof handling station draagt een 96 kanaal pipetting hoofd, acht 1 mL pipetting kanalen en vier 5 mL pipetting kanalen. In het geval van de 1 mL pipetting kanalen, kunnen uiteinden of naalden worden gebruikt voor vloeistofoverdrachten. Voor screeningsdoeleinden kunnen cellen die in testplaten zijn gezaaid, worden behandeld met monsters die bij -20 °C zijn opgeslagen in het geautomatiseerde opslagsysteem -20 °C (F) nadat deze monsters in een tweede couveuse (G) zijn ontdooid. Hoge doorvoerbeeldvorming wordt uitgevoerd in de geautomatiseerde confocale microscoop (H) die aanbiedt om beelden in confocale modus te verkrijgen met behulp van twee draaiende schijven of in epifluorescentiemodus. Een live-cel kamer geïntegreerd in de microscoop maakt het uitvoeren van lange termijn beeldvorming van gekweekte cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: De deklay-out van het vloeistofbehandelingsstation.
Tipposities worden aangeduid met "50 μL" voor 50 μL-tips, door "standaard" voor 300 μL-tips, door "hoog" voor 1 mL-tips en met "5 mL" voor 5 mL-tips. Dekcomponenten: (A) Vier verwarmde shakerposities (maximumsnelheid: 2500 tpm) die kunnen worden gebruikt voor elke kweekplaat of testplaatformaat. De shakerposities zijn uitgerust met klembare grijpers die ook worden gebruikt voor plaatuitlijning na transporten naar het dek. Bovendien fungeren de shakerposities als een dekselparkeerpositie voor platen tijdens vloeibare overdrachtsstappen. Voor representatieve doeleinden worden alle shakerposities bezet door 96 goed testplaten. (B) Aan de bovenkant worden vier kantelmodules geplaatst voor de verwerking van vier platen van elk formaat. De laagste positie markeert de afvalinzamelkamer voor cultuur- en testplaten en de 96-kanaals pipettingkop. Voor representatieve doeleinden worden alle kantelmodules bezet door 96-well assay platen. (C) Op de bovenste positie bevindt zich de 384-putplaat voor celtelling. Hieronder zijn twee posities voor platen die worden bezet door 96-well platen voor representatieve doeleinden en een rek voor vier 50 mL en vier 15 mL buizen. De laagste positie wordt ingenomen door 5 mL-tips. (D) Drie medialijnen met posities voor mediareservoirs. De medialijnen beschikken over vloeistofniveausensoren die het mogelijk maken om het mediareservoir automatisch te vullen met maximaal 250 mL media. (E) Twee vloeibare afvalmodules met actieve afvoer zijn gebaseerd op de bovenkant, onder een temperatuurgestuurde module met een positie voor één container (wit) en een 5 mL puntrek bevinden zich. (F) Vijf posities voor 1 mL tips. (G) Aan de onderkant zijn twee temperatuurgestuurde modules geplaatst en een positie voor het parkeren van een van hun deksels aan de bovenkant. (H) Posities voor twee 50 μL geneste tip racks (NTR) in de top, gevolgd door twee posities voor single-channel en 96-kanaals pick-up van 300 μL tips en een 5 mL tip rack aan de onderkant. (I) Een stacker voor 384-goed tellen platen aan de bovenkant, gevolgd door drie 300 μL NTR en een 5 mL tip rack aan de onderkant. (J) Opslag- en wasstation voor drie sets van acht herbruikbare metalen 1 mL-naalden. (K) Afvalpositie voor 1 mL en 5 mL pipettingkanalen en lege NTR (grijs) evenals een grijperblok voor 1 en 5 mL kanalen (wit) die worden gebruikt voor opdektransportstappen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Geautomatiseerde samenvloeiingscontrole van hiPSC.
a) representatieve brightfield (BF) beelden van hiPSC genomen door de celcytometer (links) en na geautomatiseerde samenvloeiingsanalyse (rechts) met vermelding van het proportionele gebied bezet door cellen in het groen; (B) Samenvloeiingspercentages geregistreerd uit twee hiPSC-lijnen (iPS #1 en #2) van dag 1 tot en met 6 van de cultuur, n = 4 1-bronplaten per cellijn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Passaging van hiPSC.
(A) BF beeld van een hiPSC lijn handmatig gegroeid (links) en met behulp van de geautomatiseerde cultuur systeem (rechts). Beelden werden genomen 6 dagen na de tweede passaging; (B) Representatieve afbeeldingen van hiPSC gekleurd voor de pluripotentie markers OCT4 en SSEA4, en tegengehouden met Hoechst 33342 (Kernen); (C) Resultaten van qRT-PCR voor de pluripotentiemarkers OCT4, NANOG en REX1 in één hiPSC-lijn die op dag 8 (D8) handmatig (m) en in het geautomatiseerde kweeksysteem (a) wordt gekweekt, en de respectievelijke hiPSC-afgeleide corticale neuronen (Diff) op dag 8 (D8) van differentiatie. De gegevens worden weergegeven als de relatieve hoeveelheid (RQ) met iPS_a_1 als referentiemonster. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie (SD) van 3 technische replicaties van qRT-PCR-reactie. GAPDH, RPL13A1 en RPLPO werden gebruikt als huishoudgenen. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Door de mens afgeleide corticale neuronen van menselijke iPSC.
(A) Brightfield beelden van dag 6, handmatig (m) en geautomatiseerde (a) gedifferentieerde corticale neuronen met vergelijkbare neuronale netwerken; (B) Representatieve afbeeldingen van cellen die zijn gekleurd voor TUBB3 (panneuronaal), BRN2 (corticale neuronen) en Hoechst 33342 (kernen) op dag 8 van differentiatie; c) Resultaten van qRT-PCR voor markergenen van corticale neuronen(MAP2, BRN2, CUX2, NCAM1 en SYN1) verrijkt in dag 8 (D8) van differentiatie. De gegevens worden weergegeven als de relatieve hoeveelheid (RQ) met iPS_a_1 als referentiemonster. Foutbalken vertegenwoordigen de SD uit 3 technische replica's van qRT-PCR-reactie. GAPDH, RPL13A1 en RPLPO werden gebruikt als huishoudgenen. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Een hoge doorvoertest voor neurite-uitgroei.
a) representatieve afbeeldingen van GFP die cellen uitdrukken op de dagen 1, 3 en 11 van de differentiatie; (B) Representatieve binaire afbeeldingen van neurites op de dagen 1, 3 en 11 van differentiatie. De neuriet uitgroei werd gekwantificeerd met behulp van de hoge inhoud beeldanalyse software 1 en wordt vertegenwoordigd als neurite lengte; (B) De afbeelding toont de toename van de neurietlengte in NPC-afgeleide NGN2-neuronen en de vorming van een dicht netwerk. Drie 96-well platen met cellen in de binnenste 60 putten zijn afgebeeld. Voor de eenvoud worden slechts drie kolommen putten per 96-putplaat als voorbeeld weergegeven met n = 6 putten per kolom. Gemiddeld werden 1308 cellen per put geanalyseerd. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (S.E.M.). Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Menselijke iPSC-afgeleide mDA neuronen.
Midhersend DA neuronen handmatig gedifferentieerd (m) en in de geautomatiseerde (a) cultuur systeem. (A, B) Representatieve fluorescerende beelden van mDA-neuronen bevlekt voor tyrosine hydroxylase (TH, mDA neuron marker; groen), MAP2 (neuronale marker; rood) en Hoechst 33342 (kernen; blauw); (C) Representatieve qRT-PCR resultaten voor marker genen van mDA neuronen handmatig gedifferentieerd en in het geautomatiseerde kweeksysteem. TH- en MAP2-expressieniveaus worden weergegeven als relatieve hoeveelheid (RQ) genormaliseerd naar huishoudgenen(OAZ1 en GAPDH); (D) Percentages van TH en MAP2 positieve neuronen gegenereerd door handmatige en geautomatiseerde differentiatie. Foutbalken vertegenwoordigen de SD van twee onafhankelijke differentiaties die worden uitgevoerd met twee verschillende iPSC-lijnen (#1 en #2). Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Celtype | Purpose | Protocolstap | Celdichtheid | Plaatformaat | Celnummer/goed |
| NGN2 differentiatie | |||||
| Ipsc | NGN2 stabiele lijn generatie | S.2.3. | 30.000 cellen/cm2 | 12-goed | 1,17,000 |
| Ipsc | NGN2 neuron differentiatie | 3.1.3. | 30.000 cellen/cm2 | 1-goed | 25,20,000 |
| Ipsc | NGN2 neuron differentiatie | 3.1.3. | 30.000 cellen/cm2 | 96-put | 9,600 |
| smNPC-generatie | |||||
| smNPC | Replating dag 12 en 16 | S5.9. en S5.11. | 70.000 cellen/cm2 | 6-goed | 6,72,000 |
| smNPC | Replating van passage 5 | 5.11. | 50.000 cellen/cm2 | 6-goed | 4,80,000 |
| smNPC | smNPC naar NGN2 neuronen | 3.2.2 | 50.000 cellen/cm2 | 96-put | 16,000 |
| mDA-differentiatie | |||||
| Ipsc | mDA neuron differentiatie | 4.1.2. | 200.000 cellen/cm2 | 1-goed | 1,68,00,000 |
| DA neuronen | Dag 25 replating | 4.3.2. | 400.000 cellen/cm2 | 1-goed | 3,36,00,000 |
| DA neuronen | Dag 25 replating | 4.5.2. | 100.000 cellen/cm2 | 96-put | 32,000 |
| Coating | Purpose | Protocolstap | Concentratie/ Verdunning |
Plaatformaat | Details van de coating |
| iPS-cultuur | |||||
| Extracellulaire matrix | iPSC, NGN2-lijn, mDA neuronen |
1.5.7. en S2.3. | 1 aliquot*; 25 mL DMEM/F-12 |
1-/12-put | 8/0,5 mL/put; 1 uur bij RT |
| NGN2 differentiatie | |||||
| Poly-L-Ornithine | NGN2 neuron differentiatie | 3.1.3. en 3.2.2. | 0,1 mg/mL; Pbs | 1-/96-put | 8/0,1 mL/put; 12 uur bij 37°C; 3x PBS wassen |
| Laminin | NGN2 neuron differentiatie | 3.1.3. en 3.2.2. | 5 μg/mL; Pbs | 1-/96-put | 8/0,1 mL/put; 4 uur bij 37°C |
| smNPC-generatie | |||||
| Extracellulaire matrix | smNPC generatie en cultuur | S5.6., S5.9., S5.11. |
1 aliquot*; 25 mL DMEM/F-12 |
6-goed | 1 mL; 2 uur bij RT |
| mDA-differentiatie | |||||
| Extracellulaire matrix | mDA-differentiatie | 4.1.2. | 1 aliquot*; 25 mL DMEM/F-12 |
1-goed | 12 mL; 12 uur bij 37°C |
| Poly-L-Ornithine | mDA-differentiatie | 4.3.2. en 4.5.2. | 0,1 mg/mL; Pbs | 1-/96-put | 12/0,1 mL/put; 12 uur bij 37°C; 3x PBS wassen |
| Laminin | mDA-differentiatie | 4.3.2. en 4.5.2. | 10 μg/mL; Pbs | 1-/96-put | 12/0,1 mL/put; 12 uur bij 37°C |
| Fibronectin (Fibronectin) | mDA-differentiatie | 4.3.2. en 4.5.2. | 2 μg/mL; Pbs | 1-/96-put | 12/0,1 mL/put; 12 uur bij 37°C |
| *Een extracellulaire matrix aliquot wordt gedefinieerd als de verdunningsfactor (in μL) die aanwezig is in het analysecertificaat van dit product. | |||||
Tabel 1: Zaaiceldichtheid en coating respectievelijk aan het plaatformaat.
| Dag | Reagens | ||
| Dag 0 - 1 | 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542 | ||
| Dag 1 - 3 | 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mL FGF-8b |
||
| Dag 3 - 5 | 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mL FGF-8b, 3 μM CHIR99021 |
||
| Dag 5 - 7 | 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mLFGF-8b, 3 μM CHIR99021 |
||
| Dag 7 - 9 | 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM CHIR99021 | ||
| Dag 9 - 11 | 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM CHIR99021 | ||
| Dag 11 - 13 | 3 μM CHIR99021, 20 ng/mL BDNF, 0,2 mM L-ascorbinezuur (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT |
||
| Dag 13 - 65 | 20 ng/mL BDNF, 0,2 mM L-ascorbinezuur (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT |
||
Tabel 2: Kleine molecuul toevoeging voor dopaminerge neuron differentiatie.
| Dag | KSR-medium | N2 medium | Differentiatiemedium |
| Dag 0 - 1 | 100% | 0 | 0 |
| Dag 1 - 3 | 100% | 0 | 0 |
| Dag 3 - 5 | 100% | 0 | 0 |
| Dag 5 - 7 | 75% | 25% | 0 |
| Dag 7 - 9 | 50% | 50% | 0 |
| Dag 9 - 11 | 25% | 75% | 0 |
| Dag 11 - 13 | 0 | 0 | 100% |
| Dag 13 - 65 | 0 | 0 | 100% |
Tabel 3: Media gradiënt voor dopaminerge neuron differentiatie.
Aanvullend dossier 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
We introduceren een geautomatiseerd celkweeksysteem met geïntegreerde beeldvormingsmogelijkheden voor de standaardisatie van de hiPSC-cultuur en neuronale differentiatie. Als gevolg van minimale gebruikersinterventie is de experimentele variatie laag en zorgt het voor reproduceerbaarheid van cellulaire fenotypes tijdens differentiatie. De kalender-gebaseerde planner ondersteunt de organisatie en parallelisatie van experimenten en maakt een hoge mate van flexibiliteit op welk moment de experimenten worden uitgevoerd. Bestaande methoden kunnen eenvoudig worden aangepast en het spectrum van beschikbare methoden kan worden vergroot. Bovendien kan een groot aantal testplaatformaten worden gebruikt om de flexibiliteit van dit systeem te behouden. Het minimale systeem bestaande uit een CO2-incubator, een robotarm, een brightfield celcytometer en een vloeistofbehandelingsstation vormen de basiseenheid die nodig is voor hiPSC-cultuur en -differentiatie, met betaalbare kosten voor academische onderzoekslaboratoria. De combinatie van het geautomatiseerde celcultuursysteem met een geautomatiseerd -20 °C-opslagsysteem voor de opslag van verbindingen, RNAi-bibliotheken of CRISPR/Cas9-bibliotheken, en de integratie van een hoog-inhoud/hoge-doorvoermicroscoop maken de uitvoering van fenotypische screenings mogelijk.
In de huidige studie, de geautomatiseerde cel cultuur systeem gebruikt wegwerp tips en de cultuur media werd handmatig bijgevuld in het reservoir, waardoor het gebruik van de vloeibare handling station voor media veranderingen en andere cultuur processen vooral 's nachts te beperken. Om deze beperking te omzeilen, kunnen de methoden worden aangepast aan naaldgebruik in plaats van wegwerptips en na het installeren van buisverbindingen tussen medialijnen en mediazakken die in een koelkast zijn opgeslagen, kunnen mediareservoirs automatisch worden bijgevuld met verse media die voorverwarmd worden door verwarmingselementen. Dit zou gebruikersinterferenten verminderen die worden veroorzaakt door handmatige bijvullen van tips, cultuurmedia en reservoiruitwisselingen.
Ons geautomatiseerde celcultuursysteem biedt verschillende voordelen. Een daarvan is de barcode tracking systeem. De platen geladen in het systeem worden geïdentificeerd door een unieke barcode die wordt gelezen en opgeslagen door het systeem waardoor het bijhouden van monsters tijdens en na de uitvoering van de methode. Een ander voordeel is de mogelijkheid om gebruikersspecifieke projecten te maken. Hier kunnen cultuurplaten die in het systeem worden geladen, aan een specifiek project worden toegewezen en in batches worden gegroepeerd. De structurering in batches vereenvoudigt de uitvoering van dezelfde procedure op alle platen van een bepaalde partij, aangezien er geen afzonderlijke platen hoeven te worden geselecteerd. Bovendien, een vloeibare klasse editor maakt het mogelijk om de pipetting snelheid en hoogte aan te passen, evenals de aspiratie en het verstrekken van parameters voor elke vloeibare overdracht stap. Elk proces wordt gedocumenteerd in logbestanden waardoor kan nagaan welke taken zijn uitgevoerd voor een bepaalde cultuur of testplaat.
Neuronen en andere celtypen afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) zijn nuttige in vitro-instrumenten voor het bestuderen van de mechanismen van neurodegeneratieve ziekten bij specifieke patiëntenpopulaties (bijvoorbeeld dopaminerge neuronen voor de ziekte van Parkinson) die de mogelijkheid bieden voor gepersonaliseerde geneesmiddelenscreenings. Culturing hiPSC is zeer tijd intensief en vraagt opgeleide mensen om complexe differentiatie protocollen uit te voeren, meestal beperkt tot lage schaal productie. We pasten de feedervrije cultuur van hiPSC aan een geautomatiseerde cultuur aan en implementeerden twee neuronale differentiatieprotocollen, een snel corticale neuron differentiatieprotocol op basis van NGN2 overexpressie onder een tet-on promotor10,11, en een langdurig protocol op basis van kleine moleculen voor het genereren van midbrain dopaminergische (mDA) neuronen13. De eenvoudige overdracht en reproduceerbaarheid van handmatige cultuur en differentiatie protocollen maakt het geautomatiseerde cultuursysteem zeer nuttig. Menselijke iPSC gekweekt in de geautomatiseerde cel cultuur systeem toonde consistente stamcelmorfologie en uitgedrukt belangrijke pluripotentie markers, reproduceerbaar tussen onafhankelijke experimenten. Bovendien gaf de automatisering van het hiPSC-cultuurprotocol de voorkeur aan de cultuur en uitbreiding van een groter aantal cellijnen parallel. Geautomatiseerde samenvloeiingscontroles die 's nachts moeten worden uitgevoerd, besparen tijd, zodat het systeem gedurende de dag vrij is voor downstreamprocesstappen die worden uitgevoerd toen de gebruiker zich in het laboratorium bevond (bijvoorbeeld het oogsten van cellen of handmatige replating voor differentiaties). Bij het bereiken van de door de gebruiker gedefinieerde samenvloeiingsdrempel worden cellen doorgegangerd en opnieuw gedeplateerd in extracellulaire matrixgecoate platen die beschikbaar zijn op de stacker van het geautomatiseerde celkweeksysteem. Elke passage ronde duurt ongeveer 70 minuten en genereert vier 1-well platen van een bovenliggende plaat, wat zich vertaalt naar een capaciteit van 20 passages in een dag.
De automatisering van het NGN2-differentiatieprotocol werd met succes uitgevoerd en maakte het mogelijk een homogene populatie van neuronale cellen over verschillende passages te genereren en vergelijkbaar met handmatige differentiaties. Bovendien zouden de experimentele kosten voor grootschalige screeningsstudies met meerdere cellijnen of screeningsexperimenten met duizenden testomstandigheden/verbindingen worden verlaagd als gevolg van snelle differentiaties. Kosteneffectieve en hoge doorvoer uitlezingen met inbegrip van live-cel neurite uitgroei metingen kunnen gemakkelijk worden ontwikkeld, geïmplementeerd en gebruikt als fenotypische uitlezingen voor ziekte modellering, zoals eerder aangetoond14,15,16. Zo hebben we verder aangepast de NGN2 protocol met behulp van kleine molecuul afgeleid neurale precursor (smNPC) cellen die constitutief over-express GFP. De smNPC-cellen bieden verdere voordelen, waaronder lagere kosten met cultuurmedia (een derde van de kosten met iPSC-cultuur) en tijd die nodig is om experimenten op te schalen. De celopbrengsten van smNPC zijn 7 tot 10 keer hoger dan die van iPSC. De differentiërende neuronen werden met succes gecontroleerd en afgebeeld voor meerdere dagen met behulp van een volledig geautomatiseerd beeldvormingsproces zonder de noodzaak van handmatige antilichaam vlekken of chemische etikettering, bespaart kosten en tijd die nodig zijn voor handmatige procedures met inbegrip van de beeldvorming zelf. De huidige beeldvorming van de binnenste 60 putten van een 96-put plaat duurt ongeveer 16 min per plaat wanneer 25 velden per put zijn afgebeeld, wat betekent dat de gegevens voor een imaging-gebaseerde screening voor 1000 verbindingen, kan worden verworven en geanalyseerd in een dag. In de toekomst, deze uitlezing kan worden gebruikt in samengestelde screening studies voor de redding van neurite uitgroei gebreken.
Verder tonen we ook de overdracht van een handmatig differentiatieprotocol voor het genereren van midbrain dopaminerge (mDA) neuronen uit iPSC. Deze kleine molecule-gebaseerde differentiatie protocol duurt 65 dagen en is arbeidsintensief vanwege de meerdere replating stappen en frequente media veranderingen, meestal om de 2 dagen, die de productie van mDA neuronen beperkt tot enkele iPSC lijnen op hetzelfde moment. Het geautomatiseerde mDA-differentiatieprotocol heeft als groot voordeel dat de differentiatie wordt opgeschaald naar tientallen iPSC-lijnen. Tot 30 cellijnen zouden parallel kunnen worden onderscheiden. Aangezien de differentiatie meestal gebaseerd is op veranderingen in de media, kan bijna het hele differentiatieproces worden uitgevoerd zonder menselijke inmenging. Met behulp van de agenda-gebaseerde planner van het geautomatiseerde systeem, kunnen we de media wijzigingen plannen op basis van de differentiatie stappen. Een beperking van het werken met zo'n groot aantal cellijnen en cultuurplaten was de onmogelijkheid om nachtelijke mediaveranderingen uit te voeren. De belangrijkste reden is het feit dat ons systeem is opgezet voor het gebruik van wegwerptips en het handmatig bijvullen van cultuurmedia waarbij een gebruiker in het laboratorium deze handmatige stap moet uitvoeren. Om het proces van mediaverandering te vergemakkelijken, werden platen die in het systeem werden geladen, toegewezen aan een project en gegroepeerd in batches. De batchgrootte werd vervolgens aangepast aan het aantal beschikbare wegwerptips en het volume van de beschikbare kweekmedia. Zoals hierboven besproken, kan deze beperking gemakkelijk worden overwonnen door de implementatie van herbruikbare / wasbare naalden en geautomatiseerde bijvullen van de media. Geautomatiseerd doorgeven/herberijzen van cellen, zoals aangetoond voor iPSC, is een van de gemakken aangeboden door onze geautomatiseerde cel cultuur systeem. We hebben getest de geautomatiseerde replating van mDA neuronen op dag 25 van differentiatie. Echter, de dissociatie van mDA neuronen vereist langere (40 min) incubatie met de dissociatie enzym dan iPSC (8 min) uitbreiding van de geautomatiseerde replating proces tot meer dan 1 h per cel lijnen. Als gevolg hiervan werd het geautomatiseerd herbewijden van 30 cellijnen op dezelfde dag onmogelijk. Het versnellen van andere stappen tijdens het geautomatiseerd herladen (transport van platen, pipetting) en het aanpassen van het systeem aan het gebruik van naalden en medialijn die een nachtelijk werk mogelijk maakt, zou deze beperking oplossen. Ondanks de nadelen konden we met succes het handmatige protocol overbrengen naar een geautomatiseerde differentiatie van mDA-neuronen die culturen produceren met aanzienlijke hoeveelheden MAP2 (neuron) en TH (mDA-neuronen) positieve cellen.
Het parallel onderscheiden van tientallen iPSC-cellijnen is van groot belang voor projecten die de moleculaire mechanismen van neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson, onderzoeken. Echter, om taken sneller te voltooien met minder fouten en tegen lagere kosten is een grote uitdaging. Door de automatisering van de hier gepresenteerde protocollen (iPSC, smNPC en mDA neuron), kunnen we de kosten versnellen, verlagen en de reproduceerbaarheid in onze projecten verhogen. De ontwikkeling van projecten zoals FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) met honderden patiëntcellijnen toont behoefte aan geautomatiseerde cultuur- en differentiatieprotocollen. Onze toekomstperspectieven omvatten de overdracht van handmatige 3-dimensionale (3D) celcultuurmodellen naar het geautomatiseerde systeem. Kleine aanpassingen in de plaatdefinitie-instellingen en het gebruik van adapters zullen het gebruik van commerciële of op maat gemaakte platen en microfluïde kamers die nodig zijn voor de 3D-culturen mogelijk maken. Bovendien zal de implementatie van een geautomatiseerd label-vrij beeldvormingsmodel ons in staat stellen om de neuronale groei in real-time te volgen en veranderingen in neurite-uitgroei, neuronorganisatie en celdood te vertalen naar een beter begrip van de ziektemechanismen.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen dankbaar de patiënten en hun families die biomateriaal hebben bijgedragen aan deze studie. Cellen lijnen gebruikt in de studie waren uit NINDS collectie met Rutgers (ND41865 als iPS # 1) en het lab van Dr Tilo Kunath (iPS # 2). Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door de NOMIS Foundation (PH), RiMod-FTD, een EU Joint Programme - Neurodegenerative Disease Research (JPND) (PH); Het DZNE I2A-initiatief (AD); PD-Strat, een ERA-Net ERACoSysMed gefinancierd project (PH) en het Foundational Data Initiative for Parkinson's Disease (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD maakt deel uit van het PATH to PD-programma van de Michael J. Fox Foundation. De auteurs bedanken Steven Finkbeiner en Melanie Cobb (Gladstone Institutes) voor het bijdragen aan de oprichting van de handmatige mDA neuron differentiatie protocol en Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) voor hulp bij neurite ontgroeiing analyse setup.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Distributor | Catalog Number | Dilution |
| iPSC pluripotency marker | |||
| Mouse anti-SSEA4 | Abcam | ab16287 | 1 to 33 |
| Rabbit anti-Oct3/4 | Abcam | ab19857 | 1 to 200 |
| NGN2 neuron markers | |||
| Mouse anti- TUBB3 | R & D | MAB1195 | 1 to 500 |
| Rabbit anti-BRN2 | NEB | 12137 | 1 to 1,000 |
| mDA neuron markers | |||
| Chicken anti-TH | Pel-Freez Biologicals | 12137 | 1 to 750 |
| Mouse anti-MAP2 | Santa Cruz | sc-74421 | 1 to 750 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11039 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | 1 to 2,000 |
| Nuclei counterstaining | |||
| Hoechest 33342 | Invitrogen | H3570 | 1 to 8,000 |
| Instruments | Distributor | Catalog Number | Description/Application |
| Agilent TapeStation system | Agilent technologies | 4200 | Automated electrophoresis for DNA and RNA samples |
| Automated -20 °C storage system | Hamilton Storage Technologies |
Sample Access Manager (SAM -20C, 3200 series) |
Storage of reagents |
| Barcode reader | Honeywell | Barcode Reader Orbit | Barcode scanner |
| Brightfield cell cytomat | Nexcelom | Celigo | Confluence check and cell counting |
| CellVoyager 7000 | Yokogawa | CellVoyager 7000 | Automated confocal microscope |
| Cytomat for cell cultures | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 24 C, CU | 12 stackers pitch 28 mm, 12 stackers pitch 23 mm (total of 456 plates) |
| Cytomat for thawing samples | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 2-LIN, 60 DU (Drying Unit) |
2 stackers pitch 28 mm (total of 42 plates) |
| HEPA filters | Hamilton Robotics | Hood Flow Star UV | Modified by Hamilton Robotics |
| Liquid handling station | Hamilton Robotics | Microlab Star | Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml and 96 Channel MPH |
| Media reservoir | Hamilton Robotics | 188211APE | Media/reagents reservoir |
| Pure water system | Veolia Water | ELGA PURELAB Classic | Provides pure water for needle wash station |
| QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System |
Thermo Fisher Scientific | QSTUDIO12KOA | Real-time PCR machine |
| Robotic arm | Hamilton Robotics | Rackrunner | Transport of plates |
| Turn table | Hamilton Robotics | Turn Table | Adjust plate orientiation |
| Uninterruptible power supply | APC | Smart UPS RT Unit, 10000 VA Power supply |
Backup power supply |
| VIAFLO-pipettes | Integra | 4500 | Electronic pipette |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4453545 | Real-time PCR machine |
| Materials | Distributor | Catalog Number | Notes |
| 1-well culture plate (84 cm2) | Thermo Fischer Scientific | 165218 | Nunc OmniTray |
| 6-well culture plates (9.6 cm2) | Greiner Bio-One | 657160 | TC treated with lid |
| 12-well culture plate (3.9 cm2) | Greiner Bio-One | 665180 | TC treated with lid |
| 96-well culture plate (0.32 cm2) | Perkin Elmer | 6005558 | CellCarrier-96 Black plate |
| Tips, 50-µL | Hamilton Robotics | 235987 | 50-uL tips |
| Tips, 300-µL | Hamilton Robotics | 235985 | 300-µL tips |
| Tips, 1000-µL | Hamilton Robotics | 235939 | 1000-µL tips |
| Tips, 5-mL | Hamilton Robotics | 184022 | 5-mL tips |
| Tubes, 15-mL | Greiner Bio-One | 188271 | 15-mL tubes |
| Tubes, 50-mL | Greiner Bio-One | 227261 | 50-mL tubes |
| Nalgene cryogenic 2.0 mL vials | Sigma Aldrich | V5007 | Cryovials |
| Plasmids | Distributor | Catalog Number | Notes |
| pLV_hEF1a_rtTA3 | Addgene | 61472 | Kind gift from Ron Weiss |
| pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro | Addgene | 61474 | Kind gift from Ron Weiss |
| pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus | Takara Bio | 631983 | |
| Primers | Sequence (forward) | Sequence (reverse) | Source |
| iPSC pluripotency | |||
| OCT4 (ID 4505967a1) | CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG | GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC | PrimerBank |
| NANOG (ID 153945815c3) | CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA | CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC | PrimerBank |
| REX1 (ID 89179322c1) | AGAAACGGGCAAAGACAAGAC | GCTGACAGGTTCTATTTCCGC | PrimerBank |
| NGN2 neurons | |||
| MAP2 (ID 87578393c1) | CTCAGCACCGCTAACAGAGG | CATTGGCGCTTCGGACAAG | PrimerBank |
| BRN2 (ID 380254475c1) | CGGCGGATCAAACTGGGATTT | TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT | PrimerBank |
| CUX2 (ID 291045458c2) | CGAGACCTCCACACTTCGTG | TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG | PrimerBank |
| NCAM1 (ID 336285437c3) | TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC | CTCACAGCGATAAGTGCCCTC | PrimerBank |
| SYNAPSIN1 (ID 91984783c3) | TGCTCAGCAGTACAACGTACC | GACACTTGCGATGTCCTGGAA | PrimerBank |
| mDA neurons | |||
| TH | CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA | CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA | NCBI primer-BLAST |
| MAP2 | GGATCAACGGAGAGCTGAC | TCAGGACTGCTACAGCCTCA | NCBI primer-BLAST |
| Housekeeping genes | |||
| GAPDH | GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG | GAGCCCCAGCCTTCTCCATG | NCBI primer-BLAST |
| OAZ1 | AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT | ATGAAGACATGGTCGGCTCG | NCBI primer-BLAST |
| RPLPO | CCTCATATCCGGGGGAATGTG | GCAGCAGCTGGCACCTTATTG | NCBI primer-BLAST |
| RPL13A | GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC | TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC | NCBI primer-BLAST |
| Media and Reagents | Distributor | Catalog Number | Use concentration |
| Coating matrix | |||
| Extracellular matrix (Matrigel) | Corning | 354277 | 10 μg/mL |
| Fibronectin | Corning | 356008 | 2 μg/mL |
| Laminin | Sigma | L2020 | 5 - 10 μg/mL |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | P3655 | 0.1 mg/mL |
| Culture media | |||
| iPSC culture medium (Essential 8 Flex medium) |
Gibco | A2858501 | |
| NGN2 neurons - NGN2 medium | |||
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.909 mL (50 µM) |
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (1%) |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Gibco | 31331093 | 484.75 mL |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL ( 2 mM) |
| Insulin | Sigma | I9278 | 0.25 mL (2.5 µg/mL) |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (0.5%) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (0.5%) |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
| mDA neurons - SRM medium | |||
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.5 mL (55 µM) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
| Knockout DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | 409.5 mL |
| Knockout serum replacement (serum replacement) |
Gibco | 10828028 | 75 mL (15%) |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (1%) |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
| mDA neurons - N2 medium | |||
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (1%) |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 475 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL(1%) |
| mDA neurons - Differentiation medium | |||
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
| NGN2 neurons - Supplements | |||
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 10 ng/mL |
| CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 2 μM |
| Doxycyline (dox) | Sigma | D9891 | 2.5 μg/mL |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
| L-ascorbic acid 2-phosphate magnesium (AA2) |
Sigma | A8960 | 64 mg/L |
| Neurotrophic factor-3 (NT-3) | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
| Purmorphamine (PMA) | Cayman | 10009634 | 0.5 μM |
| Puromycin | Sigma | P8833-10MG | 0.5 μg/mL |
| Thiazovivin | Merk Millipore | 420220-10MG | 2 μM |
| mDA neurons - Supplements | |||
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 20 ng/mL |
| CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 3 μM |
| DAPT | Cayman | 13197 | 10 µM |
| Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | 1 mM |
| Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b) | Peprotech | 100-25 | 100 ng/mL |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 20 ng/mL |
| L-ascorbic acid (AA1) | Sigma | A4403 | 0.2 mM |
| LDN193189 (LDN) | Cayman | 11802 | 100 nM |
| Purmorphamine (Purm) | Cayman | 10009634 | 2 μM |
| Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus (SHH) |
R&D | 1845-SH | 100 ng/mL |
| SB431542 (SB) | Cayman | 13031 | 10 μM |
| Transforming Growth Factor type ß3 (TGFß3) |
R&D | 243-B3 | 1 ng/mL |
| Y-27632 | Cayman | 10005583 | 10 µM |
| Dissociation reagents | |||
| Single cell dissociation reagent (StemPro Accutase) |
Gibco | A1110501 | 1x |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Gibco | 11575020 | 0.5 mM |
| RNA isolation and cDNA kit | |||
| RNA isolation kit | Qiagen | 74106 | Rneasy MiniKit |
| RNA lysis buffer | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | Trizol lysis buffer (RNA lysis buffer) |
| Reverse transcriptase (kit) | Thermo Fisher Scientific | 18080-085 | SuperScript III Reverse Transcriptase |
| Software | Company | Catalog Number | Description/Application |
| Cell Culture Framework (CCF) (Graphical user interface, GUI) |
Hamilton Robotics | Custom-made | User interface for the automated system |
| CellPathFinder software (image analysis software 1) |
Yokogawa | CellPathfinder HCS Software | Image analysis tool |
| CellVoyager Measurement System | Yokogawa | Included with CellVoyager 7000 |
Microscope controlling software |
| Columbus software (image analysis software 2) |
Perkin Elmer | Columbus | Image analysis tool |
| Cloud based qPCR app | Thermo Fisher Scientific | Themo Fisher cloud | Analysis software for qRT-PCR data |
| Venus software | Hamilton Robotics | VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Software |
Controlling software for the automated system |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases. New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).
- Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease. Open Biology. 9 (1), 180177 (2019).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Jain, S., Heutink, P. From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease. Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).
- Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions. Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific reports. 5, 16647 (2015).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755 (2015).
- Paull, D., et al. high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells. Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).
- Busskamp, V., et al. Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells. Molecular systems biology. 10, 760 (2014).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PloS one. 8 (3), 59252 (2013).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Koch, J. C., et al. Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons. Cell death & disease. 6, 1811 (2015).
- Korecka, J. A., et al. Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation. Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).
- Mehta, S. R., et al. Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation. Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification. Nucleic acids research. 38, Database issue 792 (2010).
