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एकीकृत लाइव-सेल मॉनिटरिंग के साथ मानव प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कॉर्टिकल और डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स का स्वचालित उत्पादन

Published: August 6, 2020 doi: 10.3791/61525
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 2, 1,3
1Genome Biology of Neurodegenerative Diseases, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Applied Genomics for Neurodegenerative Diseases, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 3Department for Neurodegenerative Diseases, Hertie Institute for Clinical Brain Research, University of Tübingen
* These authors contributed equally

Summary

हम स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण के साथ संगत मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) संस्कृतियों और न्यूरोनल अंतर के स्वचालन दिखाते हैं।

Abstract

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) के लिए मैनुअल संस्कृति और भेदभाव प्रोटोकॉल को मानकीकृत करना मुश्किल है, उच्च परिवर्तनशीलता दिखाना और अवांछित कोशिका प्रकारों में सहज भेदभाव का खतरा है। तरीके श्रम-प्रधान हैं और बड़े पैमाने पर प्रयोगों के लिए आसानी से उत्तरदायी नहीं हैं। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हमने एक स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली विकसित की है जो एक उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग सिस्टम के साथ मिलकर और समानांतर और न्यूरोनल भेदभाव में कई हिप्ससी लाइनों को बनाए रखने के लिए प्रोटोकॉल लागू की गई है। हम 6 \u20128 दिनों के भीतर हिप्ससी-व्युत्पन्न कॉर्टिकल न्यूरॉन्स का उत्पादन करने के लिए न्यूरोजेनिन-2 (एनजीएन 2) ओवर-एक्सप्रेशन का उपयोग करके एक अल्पकालिक भेदभाव प्रोटोकॉल के स्वचालन का वर्णन करते हैं, और 65 दिनों के भीतर हिप्ससी-व्युत्पन्न मिडब्रेन डोपामिनर्जिक (एमडीए) न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए दीर्घकालिक भेदभाव प्रोटोकॉल का कार्यान्वयन। इसके अलावा, हमने जीएफपी लेंटीवायरस के साथ स्थानांतरित एक छोटे अणु-व्युत्पन्न तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (एसएमएनपीसी) के लिए NGN2 दृष्टिकोण लागू किया और एक लाइव-सेल स्वचालित न्यूराइट आउटग्रोथ परख की स्थापना की। हम नियमित हिप्ससी संस्कृति और कॉर्टिकल और डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स में भेदभाव के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल के साथ एक स्वचालित प्रणाली पेश करते हैं। हमारा मंच उपन्यास रोग तंत्र और नशीली दवाओं के लक्ष्यों की पहचान करने के लिए दीर्घकालिक हैंड्स-फ्री कल्चर और हाई-कंटेंट/हाई-थ्रूपुट हिप्ससी बेस्ड कंपाउंड, आरएनएआई और CRISPR/Cas9 स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है ।

Introduction

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) आत्म नवीनीकरण कर रहे है और लगभग किसी भी वयस्क सेल प्रकार में अंतर कर सकते हैं । ये विशेषताएं बुनियादी अनुसंधान और दवा खोज में रोग मॉडलिंग के लिए एचआईपीएससी को एक उपयोगी उपकरण बनाती हैं1. मानव आईपीएससी दाता आनुवंशिक पृष्ठभूमि को बरकरार रखता है जो रोग-प्रासंगिक कोशिका प्रकारों को प्राप्त करने की अनुमति देता है जो रोग पाठ्यक्रम में सबसे अधिक प्रभावित/शामिल होते हैं, उदाहरण के लिए, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के लिए विभिन्न न्यूरोनल उपप्रकार2,3। इसके अलावा, hiPSC एक मानव संदर्भ और शारीरिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में रोगों मॉडलिंग द्वारा पशु और सेलुलर अधिक अभिव्यक्ति मॉडल की सीमाओं में से कुछ पर काबू पा, और मोनोजेनिक, जटिल और एपीजेनेटिक विकारों के साथ ही देर से शुरू रोगों से लेकर रोगों मॉडलिंग में एक मूल्यवान संपत्ति साबित हो गया है4।

इन लाभों और अवसरों के बावजूद, hiPSC की कई सीमाओं को अभी भी संबोधित करने की जरूरत है । वर्तमान hiPSC संस्कृति और भेदभाव प्रोटोकॉल लागत प्रभावी नहीं हैं, मानकीकरण करने के लिए मुश्किल है और श्रम गहन हैं । मैन्युअल संस्कृति कदमों के परिणामस्वरूप विकास में अंतर और एचआईपीएससी के सहज भेदभाव के कारण पैदावार और फेनोटाइप में उच्च परिवर्तनशीलता हो सकती है। इसलिए, अधिक मानकीकृत हैंडलिंग तकनीकों को लागू करके और प्रोटोकॉल को सरल बनाकर प्रयोगकर्ता-निर्भर भिन्नता को कम करने की आवश्यकता है जिसे स्वचालन5का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। स्वचालित एचएससी संस्कृति और भेदभाव प्रोटोकॉल की स्थापना अकादमिक और औद्योगिक अनुसंधान परियोजनाओं दोनों के लिए सामान्य मानक निर्धारित करेगी, और जैविक रूप से प्रासंगिक रोग मॉडल और अधिक प्रजनन योग्य परिणामों के उत्पादन की अनुमति देगी।

पिछले काम ने एचआईपीएससी संस्कृतियों6,7,8 के स्वचालन का प्रयास किया है लेकिन उनके प्रोटोकॉल को विशिष्ट सेल संस्कृति प्लेट प्रारूपों तक सीमित कर दिया गया है जो सिस्टम पर निर्भर हैं और विभिन्न परख प्रारूपों के अनुकूलनशीलता की कमी है। इस तरह की प्रणालियां कोशिकाओं के थोक में उपयोगी होती हैं लेकिन वांछित कोशिका प्रकारों, रोग फेनोटाइपिंग और स्क्रीनिंग उद्देश्यों में स्वचालित भेदभाव के लिए उपयुक्त नहीं हो सकती हैं। इसके अतिरिक्त, फाइब्रोब्लास्ट व्युत्पन्न, hiPSC पीढ़ी और भेदभाव के लिए एक बड़े पैमाने पर स्वचालित मंच9 वर्णित किया गया है, लेकिन एक पैमाने पर है कि केवल उच्च थ्रूपुट लाइनों जो आकर्षक लगता है, लेकिन कई अकादमिक प्रयोगशालाओं के लिए सस्ती हो सकता है के उत्पादन के लिए समर्पित प्रयोगशालाओं द्वारा प्राप्त किया जा सकता है ।

हमने एक उच्च दक्षता कण हवा (HEPA) में तरल हैंडलिंग स्टेशन के आधार पर एक पूरी तरह से स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली विकसित की है, जो बड़ी क्षमता वाले सीओ2 इनक्यूबेटर, एक ब्राइटफील्ड इमेजिंग साइटोमीटर और प्लेट परिवहन के लिए एक रोबोट आर्म के साथ मिलकर फ़िल्टर किया गया है। ये घटक स्थिर और प्रजनन योग्य एचएससी संस्कृति और भेदभाव का आधार प्रदान करते हैं। हमने सिस्टम को यौगिक या वायरस भंडारण के लिए स्वचालित -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण प्रणाली और उच्च गति वाले कताई डिस्क कॉन्फोकल लाइव-सेल इमेजर के साथ पूरित किया। कस्टम निर्मित प्रोटोकॉल स्वचालित सेल सीडिंग, मीडिया परिवर्तन, मांग जांच, सेल विस्तार और नमूना उपचार और प्लेट इमेजिंग के साथ परख प्लेट पीढ़ी की अनुमति उत्पन्न किए गए थे, जिससे सिस्टम उच्च सामग्री/उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के साथ संगत हो गया था । स्वचालित सेल कल्चर और इमेजिंग सिस्टम को कंट्रोलिंग सॉफ्टवेयर और कस्टम-मेड ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) का उपयोग करके संचालित किया जाता है। जीयूआई उपयोगकर्ताओं को विधि निष्पादन के लिए आवश्यक सेल लाइन-विशिष्ट मापदंडों वाली सीएसवी फाइलों को आयात करने की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, जीयूआई बिल्ट-इन कैलेंडर व्यू का उपयोग करके किसी भी अनुक्रम में कई प्रयोगों को शेड्यूल करने में सक्षम बनाता है, इस प्रकार प्रत्येक विधि शुरू होने पर समय का पूर्ण नियंत्रण करने की अनुमति देता है।

हमारी स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली विभिन्न प्लेट प्रारूपों (96-, 48-, 24-, 12-, 6-या 1-अच्छी प्लेट प्रारूप) में संस्कृति कोशिकाओं के लचीलेपन के साथ मानकीकृत पाइपिंग गति, पासिंग टाइम, कन्फ्यूशियस थ्रेसहोल्ड, सीडिंग घनत्व, और मध्यम मात्रा का उपयोग करती है। हमने हिप्ससी को न्यूरॉन्स में बदलने के लिए हाल ही में प्रकाशित अल्पकालिक भेदभाव प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जो 6 दिनों में TUBB3 सकारात्मक न्यूरॉन्स प्राप्त कर सकता है10,11। हमने छोटे अणु तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (एसएमएनपीसी) के स्वचालित भेदभाव और इमेजिंग को न्यूरॉन्स में स्थापित किया, जो EF1a प्रमोटर12 और आईपीएससी के तहत जीएफपी को मिडब्रेन डोपामिनेर्गिक (एमडीए) न्यूरॉन्स में व्यक्त करते हैं, जो पहले प्रकाशित दोहरे-SMAD अवरोध प्रोटोकॉल13 को अनुकूलित करते हैं जो 65 दिनों के भीतर एमडीए न्यूरॉन्स की पैदावार करता है।

Protocol

1. सेल संस्कृतियों और इमेजिंग को स्वचालित करने के लिए बुनियादी प्रक्रियाएं

  1. लोड नई संस्कृति प्लेटें और सुझाव
    1. जीयूआई खोलें और रिसोर्स/इंस्ट्रूमेंट प्रोसेस व्यू बटन पर क्लिक करें । किसी भी संसाधन/साधन प्रक्रिया को चलाने के लिए संसाधन/साधन प्रक्रिया का चयन करें और रन इंस्ट्रूमेंट प्रोसेस बटन पर क्लिक करें ।
    2. संसाधन प्रक्रिया रनहेपेहुड और रीलोडिंग चलाएं (चरण 1.1.1 देखें)। दरवाजा खोलें, नियंत्रण पीसी पर पॉप-अप छवि में इंगित के रूप में संबंधित स्थिति में सेल संस्कृति प्लेटें और डिस्पोजेबल युक्तियां लोड करें।
    3. विसंदूषण के लिए 70% इथेनॉल के साथ दरवाजे को पोंछें और इसे बंद करें। जीयूआई से इंस्ट्रूमेंट प्रोसेस डेकेशन चलाएं (चरण 1.1.1 देखें)। सिस्टम 30 मिनट के लिए यूवी विकिरण द्वारा निष्फल हो जाता है।
  2. रिफिल संस्कृति मीडिया और/या वियोजन अभिकर्ण
    1. साधन चरण RunHepahood पर अमल करें (चरण 1.1.1 देखें)। लिक्विड हैंडलिंग स्टेशन के सामने का दरवाजा खोलें। 70% इथेनॉल के साथ जलाशयों (जिसमें मीडिया, पीबीएस और/या वियोजन अभिवाक) को दूषित किया जाता है और उन्हें डेक पर सौंपा गया पॉजिटन (जैसा कि सीएफजी.csv फ़ाइल में परिभाषित किया गया है) के लिए रखें। जलाशयों को डी-ढक्कन करें।
    2. 70% इथेनॉल के साथ दरवाजे को दूषित करें और इसे बंद करें। संसाधन/साधन प्रक्रिया "InitHepahood" जीयूआई से चलाकर HEPA हुड नीचे बिजली ।
  3. जीयूआई में एक नई "सेल लाइन" और परियोजना बनाएं
    1. उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित "सेल लाइन"-कॉन्फिग (*.cfg.csv), आयात (*.imp.csv), संसाधन (*.rsv.csv) और कार्यप्रवाह (*.wfl.csv) फ़ाइलों से मिलकर फ़ाइलें बनाएं/संशोधित करें ।
    2. जीयूआई खोलें और "सेल लाइन एडिटर" व्यू में ऐड सेल लाइन बटन पर क्लिक करके एक नई "सेल लाइन" बनाएं। एक जादूगर खुलता है जहां कॉन्फ़िग फ़ाइल का चयन करने की आवश्यकता होती है और एक संक्षिप्त विवरण के साथ एक परियोजना नाम दर्ज करने की आवश्यकता होती है।
    3. हरे तीर सिर का उपयोग कर इस जादूगर के माध्यम से नेविगेट करें और हरे चेकमार्क पर क्लिक करके सेटिंग्स की पुष्टि करें। ऐड प्रोजेक्ट बटन पर क्लिक करके जेनरेटेड "सेल लाइन" के लिए एक नया प्रोजेक्ट बनाएं।
    4. एक परियोजना का नाम और विवरण दर्ज करें और एक परियोजना रंग को परिभाषित करें जो जीयूआई के कैलेंडर दृश्य में दिखाई देगा। तीर सिर पर क्लिक करके जादूगर के अगले पृष्ठ पर नेविगेट करें।
    5. ऐड बैच बटन पर क्लिक करके और पॉप-अप विंडो में एक छोटा नाम और विवरण देकर एक नया बैच बनाएं। सभी प्रक्रिया चरणों का चयन करें और प्रक्रिया चरण में से प्रत्येक के लिए शुरू समय निर्धारित करें। ठीक है पर क्लिक करके खिड़की बंद करो।
  4. जीयूआई का उपयोग करके एक स्वचालित विधि निष्पादित करें
    1. जीयूआई के कैलेंडर व्यू पर जाएं और ऐड प्रोसेस स्टेप बटन पर क्लिक करें।
    2. सेल लाइन का चयन करें और जादूगर के अगले पृष्ठ पर नेविगेट करने के बाद परियोजना का चयन करें। इस्तेमाल किए जाने वाले बैच को चिह्नित करें और दाईं ओर इशारा करते हुए एरोहेड पर क्लिक करें। उपयोग की जाने वाली विधि के आधार पर, बैचों को या तो खाली होना चाहिए (नई प्लेटें प्राप्त करने के लिए), या संस्कृति प्लेटें या परख प्लेटें (अन्य सभी प्रक्रियाएं) शामिल हैं।
    3. जादूगर के अगले पृष्ठ पर नेविगेट करें और प्रक्रिया चरण का चयन करें जिसे निष्पादित किया जाएगा। इस जादूगर के अंतिम पृष्ठ पर जाएं और प्रयोग शेड्यूल करें। अनुभाग में "पैरामीटर विवरण" चर जो विधि को चलाने के लिए आवश्यक हैं, संशोधित किया जा सकता है। ठीक क्लिककरके पुष्टि करें ।
  5. सीओ2 इनक्यूबेटर में संस्कृति और परख प्लेटों की लोडिंग
    नोट: 1-अच्छी प्लेटों को संस्कृति प्लेटों के रूप में परिभाषित किया जाता है क्योंकि वे आमतौर पर थोक कोशिकाओं के लिए उपयोग किए जाते हैं। सभी बहु-अच्छी प्लेटों को परख प्लेटों के रूप में परिभाषित किया गया है।
    1. चरण 1.1.1 में वर्णित जीयूआई से उपकरण प्रक्रिया "रनहेपेहुड" को निष्पादित करें। और रोबोटिक आर्म के सामने दरवाजा खोलें।
    2. यदि प्लेटें स्वचालित इमेजिंग के लिए भरी हुई हैं तो 70% इथेनॉल और एक लिंट-फ्री ऊतक के साथ परख प्लेटों के नीचे पोंछें। बाएं शेल्फ पर संस्कृति या परख प्लेटें रखें। सुनिश्चित करें कि प्लेट का अभिविन्यास सही है। परख प्लेटों के लिए, अच्छी तरह से A1 रोबोट बांह की ओर इशारा किया है, जबकि संस्कृति प्लेटों के किनारों को सही करने के लिए बिंदु है ।
    3. विसंदूषण के लिए 70% इथेनॉल के साथ दरवाजे को पोंछें और इसे बंद करें।
    4. चरण 1.4 में वर्णित बहु-अच्छी प्लेटों के आयात के लिए 1-अच्छी प्लेटों या "परख प्लेटों की लोडिंग" आयात करने के लिए "लोडिंग ऑफ कल्चर प्लेट्स" विधि को निष्पादित करें। दोनों तरीकों को चलाने के लिए एक खाली बैच का उपयोग करें। यदि इस बैच में प्लेट बारकोड पहले से मौजूद हैं, तो चेकबॉक्स पर क्लिक करके उन्हें डिच करें।
    5. रोबोट बांह का उपयोग कर सीओ2 इनक्यूबेटर मंच के लिए शेल्फ से व्यक्तिगत प्लेटों परिवहन। बिल्ट-इन प्लेट शटल स्टेशन प्लेट को पुनः प्राप्त करता है और उन्हें सीओ2 इनक्यूबेटर के रैक में से एक में स्टोर करता है। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर बनाए रखाजाताहै।
  6. सीओ2 इनक्यूबेटर से प्लेटों की अनलोडिंग
    1. "प्लेटें उतारना" विधि निष्पादित करें (चरण 1.4 देखें)। प्लेटों वाले बैच का चयन करें जिन्हें निर्यात करने की आवश्यकता है। अलग-अलग प्लेटों का चयन उनके बारकोड द्वारा किया जा सकता है।
    2. रोबोटिक आर्म का उपयोग करके प्लेटों को सीओ2 इनक्यूबेटर से बाएं शेल्फ तक ले जाएं।
    3. चरण 1.1.1 में वर्णित साधन प्रक्रिया "रनहेपाहुड" का उपयोग करके हेपा हुड शुरू करें। और रोबोटिक आर्म के सामने दरवाजा खोलें। प्लेटों को हटा दें, इसे बंद करने से पहले 70% इथेनॉल के साथ दरवाजे को दूषित करें और हेपा हुड को पावर दें।

2. ऑटोमेशन प्रोटोकॉल

  1. ट्यूबों से प्लेटों की सीडिंग
    1. साधन प्रक्रिया RunHepahood को क्रियांवित करके हेपा हुड शुरू करें (चरण 1.1.1 देखें)। लिक्विड हैंडलिंग स्टेशन के सामने दरवाजा खोलें। सेल निलंबन युक्त 50 एमएल ट्यूब इनपुट करें और ट्यूब को डी-ढक्कन करें।
    2. शेल्फ पर कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए रोबोट बांह और लोड लेपित संस्कृति प्लेटों के सामने दरवाजा खोलें। दोनों दरवाजों को दूषित और बंद करें। "ट्यूबों से प्लेटों की सीडिंग" विधि को निष्पादित करें (चरण 1.4 देखें)।
    3. डायरेक्ट सेल काउंटिंग फ़ंक्शन का उपयोग करके ब्राइटफील्ड इमेजिंग साइटोमीटर में कोशिकाओं की गणना करें। सेल गिनती के लिए, 384-वेल प्लेट प्रारूप में प्रतिकृति के रूप में 16 कुओं का उपयोग करें।
    4. डेक से 384-अच्छी तरह से गिनती प्लेट को रोबोट आर्म का उपयोग करके टर्नटेबल के माध्यम से ब्राइटफील्ड इमेजिंग साइटोमीटर तक परिवहन करें और इमेजिंग प्रक्रिया शुरू करें। साइटोमीटर स्वचालित रूप से प्रति मिलीलीटर सेल संख्या निर्धारित करता है। रोबोट बांह का उपयोग कर अपनी मूल स्थिति में गिनती की थाली वापस लाओ ।
    5. रोबोट बांह का उपयोग करके शेल्फ से पाइपिंग डेक तक एक लेपित संस्कृति या परख प्लेट का परिवहन करें। उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित संख्या में कोटिंग और बीज कोशिकाओं को हटा दें, और प्लेट प्रारूप के लिए उपयुक्त मात्रा (तालिका 1देखें)। सेल वितरण और सीओ2 इनक्यूबेटर को स्थानांतरित करने के लिए 500 आरपीएम पर 10 एस के लिए ऑन-डेक शेखर के लिए प्लेट ले जाएं।
  2. स्वचालित संगम मूल्यांकन
    1. चरण 1.4 में वर्णित विधि "जांच ी शक्ति" को निष्पादित करें। एक बैच का चयन करें जिसमें कम से कम एक संस्कृति प्लेट और कोई परख प्लेटें शामिल हैं। अनुभाग में "पैरामीटर विवरण" इनपुट "iPSCf_2020" छवि अधिग्रहण और इमेजिंग विश्लेषण सेटिंग्स के लिए।
    2. रोबोट बांह का उपयोग कर टर्नटेबल के माध्यम से ब्राइटफील्ड इमेजिंग साइटोमीटर के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर से पहली प्लेट परिवहन।
    3. हिप्ससी कॉलोनियों की संगम जांच के लिए ब्राइटफील्ड इमेजिंग साइटोमीटर में कोशिकाओं की इमेजिंग करें। 1-अच्छी तरह से पीटे के "संगम" एप्लिकेशन और इमेज 13 फ़ील्ड का उपयोग करें और स्वचालित रूप से कोशिकाओं द्वारा कब्जे वाले औसत क्षेत्र की गणना करें।
    4. रोबोटिक आर्म का उपयोग करके प्लेट को सीओ2 इनक्यूबेटर में वापस परिवहन करें। चरण 2.2.2 दोहराएं। 2.2.4 करने के लिए। शेष प्लेटों के लिए।
  3. संस्कृति प्लेटों या परख प्लेटों के मीडिया परिवर्तन
    1. चरण 1.4 में वर्णित "मीडिया चेंज ऑफ कल्चर प्लेट्स" विधि को निष्पादित करें। और केवल संस्कृति प्लेटों वाले बैच का चयन करें। परिवर्तनीय सेट करें जो यह दर्शाता है कि "पैरामीटर विवरण" अनुभाग में पाइपिंग चरणों के लिए युक्तियों या सुइयों का उपयोग किया जाता है या नहीं। किसी भी बहु-वेल प्लेट के मीडिया परिवर्तन के लिए, "मीडिया परिवर्तन परख प्लेटों" की विधि को निष्पादित करें और परख प्लेटों वाले बैच का चयन करें।
    2. रोबोट बांह का उपयोग कर डेक के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर से व्यक्तिगत प्लेटों परिवहन और प्लेटों de-lid । स्वचालित रूप से प्लेटों को झुकाएं और पुराने मीडिया को एस्पिरेट करें और इसे अपशिष्ट संग्रह मॉड्यूल में त्याग दें। ताजा मीडिया के 12 एमएल जोड़ें। प्लेट को फिर से ढक्कन करें और प्लेटों को रोबोटिक आर्म का उपयोग करके सीओ2 इनक्यूबेटर में वापस परिवहन करें।
  4. उपसंभात
    नोट: 1.1.1 में वर्णित जीयूआई से उपकरण प्रक्रिया "रनहेपेहुड" को निष्पादित करें। और तरल हैंडलिंग स्टेशन के सामने का दरवाजा खोलें। आवश्यक पदों पर मीडिया और वियोजन अभिकर्ण लोड करें (चरण 1.2 देखें)। यदि युक्तियों को फिर से भरा जाना चाहिए, तो चरण 1.1 में वर्णित "रीलोडिंग" का उपयोग करें। सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए एक 50 एमएल ट्यूब इनपुट और ट्यूब को डी-ढक्कन करें।
    1. "अनुयायी कोशिकाओं की उपकृषण" विधि को निष्पादित करें (चरण 1.4 देखें)। संस्कृति प्लेटों वाले बैच का चयन करें जिन्हें उपखेती की आवश्यकता है।
    2. रोबोट बांह का उपयोग कर डेक के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर से प्लेटों परिवहन और प्लेटों de-lid । स्वचालित रूप से प्लेटों को झुकाएं और पुराने मीडिया को हटा दें और इसे अपशिष्ट संग्रह मॉड्यूल में त्याग दें। पीबीएस के 8 एमएल के साथ एक बार कोशिकाओं को धोएं। झुरमुट आधारित पासेजिंग के लिए 0.5 एमएम ईडीटीए का 8 एमएल जोड़ें। 8 मिनट के लिए डेक पर इनक्यूबेट।
    3. प्लेटों से EDTA समाधान निकालें और इसे अपशिष्ट संग्रह मॉड्यूल में त्याग दें। ताजा माध्यम के 12 एमएल जोड़ें और शेकर के लिए प्लेटों परिवहन। कॉलोनियों को उखाड़ फेंकने के लिए 1 मिनट के लिए 2000 आरपीएम पर हिलाएं।
    4. आईपीएससी उपनिवेशों को छोटे आकार (~ 50\u201280 μm) में तोड़ने के लिए पिपटिंग के पांच चक्रों के लिए सेल निलंबन को ट्रिटरेट करें। डेक पर सेल निलंबन को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। बीज कोशिकाओं को स्वचालित रूप से चरण 2.1.5 में वर्णित 7 में 1 के विभाजन अनुपात का उपयोग करते हुए।
      नोट: वैकल्पिक, एकल सेल पासिंग। सिंगल सेल डिसोसिएशन रीएजेंट (सामग्रियों की टेबलदेखें) का उपयोग करके एकल सेल सस्पेंशन उत्पन्न करें। स्टेप 2.4.2 में 0.5 एमएम ईडीटीए के बजाय सिंगल सेल डिससोिएशन रिएजेंट के 8 एमएल का इस्तेमाल करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। सेल निलंबन को 50 एमएल ट्यूब में ले लीजिए और मीडिया की बराबर मात्रा जोड़ें। एकल कोशिका वियोजन अभिवाक का उपयोग कर के वियोजन कोशिकाओं को गोली मारने के लिए एक मैनुअल कदम की आवश्यकता होती है। 3 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं। सुपरनैंट निकालें और आवश्यक मीडिया के 12 एमएल में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें और "ट्यूबों से प्लेटों की सीडिंग" के साथ आगे बढ़ें (चरण 2.1 देखें)। आईआईपीएससी के एकल सेल निलंबन का उपयोग करते समय सीडिंग के दिन 2 माइक्रोन थियाजोविन के साथ मीडिया को पूरक करें।
  5. स्वचालित उच्च सामग्री, उच्च थ्रूपुट इमेजिंग
    नोट: माप सेटिंग उपलब्ध होनी चाहिए (पूरक फ़ाइल 1देखें: चरण 1.1)। छवि की जाने वाली परख प्लेटें इनक्यूबेटर में उपलब्ध हैं।
    1. "इमेजिंग" विधि को निष्पादित करें (चरण 1.4 देखें)। एक बैच का चयन करें जिसमें कम से कम एक परख प्लेट और कोई संस्कृति प्लेट न हो। "पैरामीटर विवरण" अनुभाग में, प्लेट प्रकार, प्लेट परिभाषाएं (मानक 96-वेल इमेजिंग प्लेटों के लिए: "प्लेट-96-20170918113842" दर्ज करें) और माप सेटिंग का नाम।
    2. इमेजिंग प्रक्रिया शुरू करने के लिए रोबोट आर्म का उपयोग करके स्वचालित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए टर्नटेबल के माध्यम से परख प्लेट का परिवहन करें। माइक्रोस्कोप से इमेजिंग के अंत में प्लेट को ठीक करें और इसे सीओ2 इनक्यूबेटर में वापस ले जाएं। बैच में शेष प्लेटों की प्रक्रिया दोहराएं।

3. ऑटोमेटेड रखरखाव और एचआईपीएससी का विस्तार

  1. स्वचालित योग्यता जांच, मीडिया परिवर्तन और उपशकुंदी का अनुक्रम
    1. "ट्यूबों से प्लेटों की सीडिंग" विधि का उपयोग करके 1-अच्छी प्लेटों पर बीज कोशिकाएं (चरण 2.1 देखें)। वैकल्पिक रूप से, "लोडिंग ऑफ कल्चर प्लेट" विधि का उपयोग करके मैन्युअल रूप से वरीयता प्राप्त 1-अच्छी प्लेटों का आयात करें (चरण 1.5 देखें)।
    2. आईपीएससी के लिए संस्कृति के दिन 1 से 6 दिन तक कॉलोनी विकास की निगरानी के लिए दैनिक स्वचालित कन्फ्यूजेंसी चेक शेड्यूल करें (चरण 2.2 देखें)।
    3. ताज़ा मीडिया हर दूसरे दिन "संस्कृति प्लेटों के मीडिया परिवर्तन" विधि का उपयोग कर (चरण २.३ देखें) । प्रति प्लेट 12 एमएल मीडियम का इस्तेमाल किया जाता है।
    4. 6 दिन पर, "उपखेती" प्रक्रिया शुरू (चरण 2.4 देखें।) ।

4. स्वचालित भेदभाव

  1. मानव आईपीएससी कॉर्टिकल NGN2 न्यूरॉन्स के लिए
    नोट: मैनुअल hiPSC तैयारी। प्रोटोकॉल में डिलीवरी के लिए लेंटीवायरल वैक्टर का उपयोग करके एनजीएन 2 की अधिक अभिव्यक्ति शामिल है। 1:2 अनुपात (>107 टीयू/एमएल) में NGN2 से rTTA3 lentivirus के साथ ट्रांसड्यूस हिप्ससी । कोशिकाओं तो ०.५ μg/mL puromycin के साथ एक मार्ग के लिए चुना जाता है । स्थिर एचआईपीएससी-एनजीएन2 लाइनों को उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल अनुपूरक फाइल 1:चरण 2 में है।
    1. चरण 2.4.4 के नोट में वर्णित एकल कोशिका वियोजन अभिवाक का उपयोग करके वर्णित "उपखेती" प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ें। जब hiPSC पहुंच 70 \u201280% की नरमी
    2. सुपरनैंट निकालें और 2.5μg/mL doxycycline (dox) और 2 μM thiazovivin युक्त NGN2 मीडिया(सामग्री की मेज)के 12 mL में सेल गोली resuspend ।
    3. "ट्यूबों से प्लेटों कीसीडिंग" विधि का उपयोग करके भेदभाव शुरू करें (चरण 2.1 देखें)। आईपीएससी के वांछित सीडिंग घनत्व को 30,000/सेमी 2 (तालिका1 देखें) में सेट करें। आईपीएससी को ०.१ मिलीग्राम/एमएल पॉली-एल-ऑर्निथिन (पीईओ) और 5 माइक्रोनजी/एमएल लैमिनिन के साथ प्री-कोटेड प्लेटों पर चढ़ाया जाता है ।
      नोट: 1-अच्छी तरह से प्लेटें आरएनए और प्रोटेओमिक्स आधारित अध्ययनों के लिए पसंद कर रहे हैं, जबकि ९६-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप इमेजिंग प्रयोगों के लिए पसंद किया जाता है । 48-, 24-, 12- या 6-अच्छी प्लेटों जैसे अन्य परख प्लेट प्रारूपों का भी उपयोग किया जा सकता है।
    4. भेदभाव के दिन 1 पर, "परख प्लेटों के मीडिया परिवर्तन का उपयोग कर मीडिया ताज़ा (चरण 2.3 देखें) NGN2 माध्यम का उपयोग कर, 2.5 μg/mL dox और 10 μM N-[2S-(3,5-difluorophenyl) एसीटाइल] -L-alanyl-2-फिनाइल-ग्लाइसिन, 1,1-डिमेथिलेथिल एस्टर (DAPT) के साथ पूरक । मीडिया परिवर्तन के साथ जारी रखें हर 2 \u20123 दिनों तक भेदभाव के वांछित दिन तक (चरण 2.3 देखें)।
    5. भेदभाव के दिन 4 पर, एक और मीडिया परिवर्तन (चरण 2.3 देखें), 10 एनजी/एमएल मस्तिष्क व्युत्पन्न न्यूरोट्रोफिक फैक्टर (BDNF), 10 एनजी/एमएल ग्लियल सेल-व्युत्पन्न न्यूरोट्रोफिक फैक्टर (GDNF) और 10 एनजी/एमएलए न्यूरोट्रोफिक फैक्टर 3 (एनटी-3) के साथ पूरक NGN2 माध्यम का उपयोग कर maturation बढ़ाने के लिए । प्रयोग के अंत में, डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए सिस्टम से संस्कृति प्लेटों का निर्यात करें (चरण 1.6 देखें)।
  2. एनजीएन2 न्यूरॉन्स के लिए छोटे अणु तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (smNPC)
    नोट: प्रकाशित प्रोटोकॉल12 के अनुकूलित संस्करण के बाद smNPC प्राप्त करें (पूरक फ़ाइल 1देखें: चरण 5)। NGN2 और rTTA3 वायरस के साथ smNPC को संशोधित करें (पूरक फ़ाइल 1देखें: चरण 2)। एक स्थिर आबादी उत्पन्न करने के लिए एनजीएन2 और आरटीए ट्रांसडक्शन का एक दौर पर्याप्त है। इसके अलावा पीएलवीएक्स-EF1a-AcGFP1-N1 लेंटीवायरस के साथ एसएमएनपीसी को संशोधित करने की अनुमति देता है जो लाइव-सेल निगरानी करने की अनुमति देता है। 10 की बहुलता (एमओआई) का उपयोग जीएफपी लेंटीवायरल ट्रांसडक्शन के लिए किया जाता है।
    1. चरण 2.4 में वर्णित एकल सेल वियोजन अभिकर्ण का उपयोग करके कन्फ्यूशियस तक पहुंचने पर पारित होने की संभावना है। नोट।
    2. बीज कोशिकाओं को 50,000/सेमी2 के एक सेल घनत्व पर स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर "ट्यूबों से प्लेटों की सीडिंग" विधि का उपयोग (कदम 2.1.1.) ०.१ मिलीग्राम/एमएल PLO के साथ पूर्व लेपित प्लेटों पर, और 5 μg/mL laminin NGN2 मध्यम में २.५ μg/mL dox के साथ पूरक ।
    3. तीसरे दिन, 2.5 μg/mL dox और 10 μM DAPT युक्त ताजा NGN2 माध्यम का उपयोग कर एक मीडिया परिवर्तन (चरण 1.3 देखें)। 3 दिन के बाद, ताजा NGN2 माध्यम २.५ μg/mL dox, BDNF, GDNF और एनटी-3 10 एनजी/एमएल प्रत्येक पर युक्त के साथ हर तीसरे दिन मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन करते हैं ।
    4. इमेज सेल दैनिक "स्वचालित उच्च सामग्री, उच्च थ्रूपुट इमेजिंग" विधि का उपयोग करके (चरण 2.5 देखें) जीएफपी का उपयोग करके भेदभाव की स्थिति की निगरानी के लिए न्यूराइट आउटग्रोथ के लिए रीडआउट के रूप में। लेजर पावर को 80% तक सेट करें और 30 एमएस के एक्सपोजर टाइम का इस्तेमाल करें। 20x उद्देश्य का उपयोग करके बड़ी संख्या में फ़ील्ड (जैसे, 25 फ़ील्ड) प्राप्त करें।
  3. बैच छवि विश्लेषण
    1. न्यूराइट आउटग्रोथ टेम्पलेट का उपयोग करके, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर 1 के साथ छवि विश्लेषण करें।
    2. सॉफ्टवेयर खोलें। "डेटा" विकल्प का चयन करें और इमेजिंग डेटा फ़ोल्डर में ब्राउज़ करें, विश्लेषण करने के लिए डेटा लोड करने के लिए ठीक क्लिक करें। ओपन और टॉप मेनू बार से क्लिक करें, प्रोटोकॉल का चयन करें और एप्लिकेशन मेनू से न्यूराइट आउटग्रोथका चयन करें। "एल्गोरिदम" पर जाएं और नाभिक, कोशिका शरीर और न्यूराइट को परिभाषित करने के लिए "488" चैनल का उपयोग करें। प्रत्येक के लिए सीमा मापदंडों को समायोजित करें।
    3. छवि विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले कुओं का चयन करें। नीचे सही क्लिक लिंक पर और सेल काउंट औसत, कुल कंकाल लंबाई कुल के रूप में विश्लेषण किया जा करने के लिए सुविधाओं का चयन करें । "पूर्वावलोकन" के बाद "पूर्व-विश्लेषण" के साथ आगे बढ़ें।
    4. देखें कि क्या पूर्वावलोकन सेटिंग्स स्वीकार्य हैं और बैच मोड में विश्लेषण शुरू करते हैं। परिणाम .csv फ़ाइल प्रारूप में "रिपोर्ट" के तहत पैरेंट फ़ोल्डर में उपलब्ध हैं जिन्हें एक्सेल में खोला जा सकता है।
      नोट: छवि विश्लेषण स्क्रिप्ट अनुरोध पर उपलब्ध है।
    5. कुल न्यूराइट लंबाई द्वारा प्राप्त प्लॉट औसत न्यूराइट लंबाई सेल संख्या में सामान्यीकृत है।

5. मिडब्रेन डोपामिनर्जिक (एमडीए) न्यूरॉन्स में हिप्ससी का स्वचालित भेदभाव

  1. मैनुअल एचएससी तैयारी
    1. एकल कोशिका वियोजन अभिकर्मक का उपयोग करके एकल कोशिकाओं में 70\u201280% कॉन्फ्ल्यूरेट हिब्प्ससी को अलग करें। संक्षेप में, 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एकल कोशिका वियोजन रिएजेंट (100 माइक्रोन/सेमी2)के साथ इनक्यूबेट कोशिकाएं, एक शंकुदाता में सेल निलंबन एकत्र करें, 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और आईपीएससी संस्कृति माध्यम में सेल पेलेट को फिर से रखें।
    2. बीज 200,000 कोशिकाओं/सेमी2 एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स-लेपित 1-वेल प्लेट्स और आईपीएससी कल्चर मीडियम सप्लीमेंट पर 10 माइक्रोन वाई-27632 के साथ सप्लीमेंट किया गया । संस्कृति कोशिकाओं 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर रात भर।
  2. स्वचालित भेदभाव: चरण 1
    1. चरण 1.1\u20121.2 में वर्णित स्वचालित संस्कृति प्रणाली तैयार करें।
    2. स्वचालित संस्कृति प्रणाली के सीओ2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं वाली संस्कृति प्लेटें लोड करें (चरण 1.5 देखें)।
    3. केएसआर माध्यम तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें) और छोटे अणुओं के साथ पूरक (तालिका 2देखें) भेदभाव के दिन 0 शुरू करने के लिए आवश्यक है। छोटे अणुओं और विकास कारकों के साथ केवल हौसले से तैयार मीडिया का उपयोग करें।
    4. संस्कृति प्लेटों के मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन के रूप में 0 दिन और भेदभाव के 1 पर कदम २.३ में वर्णित है और फिर हर दूसरे दिन 25 दिन तक ।
    5. 5 दिन से, मीडिया निर्माण को धीरे-धीरे शिफ्ट करें जैसा कि तालिका 3में विस्तार से वर्णित है।
    6. 11 दिन, एमएडीए न्यूरॉन विभेदन माध्यम को चिर (13 दिन तक), बीडीएनएफ, एए1, जीडीएनएफ, डीबी-सीएएमपी, टीजीएफए 3 और डीएपीटी (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ पूरक जोड़ें।
    7. 25 दिन पर, प्लेटें उतारना (चरण 1.6 देखें।
  3. मैन्युअल रिप्लेटिंग 1
    1. एकल कोशिका वियोजन अभिकर्ण का उपयोग करके एकल कोशिकाओं में 25 एमडीए अग्रदूत दिन अलग करें। संक्षेप में, एकल कोशिका वियोजन रिएजेंट (100 माइक्रोएल/सेमी2)के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए, एक शंकुदाता में सेल निलंबन एकत्र, 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और एमडीए न्यूरॉन विभेदन माध्यम में पुन: खर्च सेल गोली।
    2. बीज 400,000 कोशिकाओं/सेमी2 में 1-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों पूर्व ०.१ मिलीग्राम/एमएल पीईओ के साथ लेपित, एमडीए न्यूरॉन विभेदन माध्यम में 10 μg/mL लैमिनिन और 2 μg/mL फाइब्रोनेक्टिन 10 μM Y-27632 (26 दिन तक) और छोटे अणुओं और विकास कारकों तालिका 2में वर्णित के साथ पूरक । संस्कृति कोशिकाओं 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर रात भर।
  4. स्वचालित भेदभाव: चरण 2
    1. लोड संस्कृति प्लेटें जो एमडीए न्यूरॉन्स को स्वचालित संस्कृति प्रणाली के सीओ2 इनक्यूबेटर में लोड करती हैं जैसा कि चरण 1.5 में वर्णित है
    2. एमडीए न्यूरॉन विभेदन माध्यम तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें) और 26 दिन के बाद से अंतिम भेदभाव के लिए आवश्यक छोटे अणुओं और विकास कारकों के साथ पूरक (तालिका 2देखें)।
    3. संस्कृति प्लेटों के मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन के रूप में भेदभाव के दिन 26 पर कदम २.३ में वर्णित है और फिर हर 3 \ u20124 दिन ६५ दिन तक ।
      नोट: उच्च थ्रूपुट इमेजिंग उद्देश्यों के लिए, भेदभाव के दिन 32 पर कम घनत्व पर 96-अच्छी प्लेटों में एमडीए न्यूरॉन्स को फिर से पेश करने की सिफारिश की जाती है, जैसा कि चरण 5.5 में वर्णित है।
  5. मैन्युअल रिप्लेटिंग 2
    1. कदम 1.6 में वर्णित संस्कृति प्लेटों को उतारना। दिन 32 एमडीए न्यूरॉन्स एकल कोशिकाओं में अलग के रूप में चरण 5.3.1 में वर्णित है।
    2. बीज १००,००० कोशिकाओं/सेमी2 में ९६-अच्छी तरह से प्लेटें पूर्व ०.१ मिलीग्राम/एमएल PLO के साथ लेपित, 10 μg/mL laminin और 2 μg/mL फाइब्रोनेक्टिन एमडीए न्यूरॉन भेदभाव माध्यम में 10 μM Y-27632 के साथ पूरक (३३ दिन तक) और छोटे अणुओं और विकास कारकों (तालिका 2देखें) । संस्कृति कोशिकाओं 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर रात भर।
    3. 33 दिन, छोटे अणुओं और विकास कारकों (वाई-27632 के बिना) के साथ पूरक हौसले से तैयार दा न्यूरॉन्स भेदभाव माध्यम द्वारा मध्यम की जगह। 65 दिन तक हर 3\u20124 दिनों में मध्यम मैन्युअल रूप से बदलें।

6. इम्यूनोदाता, स्वचालित उच्च थ्रूपुट छवि अधिग्रहण और विश्लेषण

  1. फ्लोरेसेंस धुंधला
    1. पूरक फ़ाइल 1:चरण 4 में वर्णित फ्लोरोसेंट इम्यूनोस्टेनिंग करें।
    2. अनुपूरक फ़ाइल 1में वर्णित छवि कोशिकाएं: चरण 1.2।
    3. इमेजिंग सिस्टम द्वारा उत्पन्न इमेजिंग फाइलों को आगे के छवि विश्लेषण के लिए इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर 2 (सामग्री की तालिकादेखें) पर अपलोड करें, जैसा कि चरण 6.2 में वर्णित है।
  2. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर 2 का उपयोग कर छवि विश्लेषण
    1. इमेजिंग फ़ाइलों को छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर 2 में अपलोड किए जाने के बाद, "छवि विश्लेषण" फ़ंक्शन पर जाएं और ड्रॉप डाउन मेनू का उपयोग करके विश्लेषण एल्गोरिदम का निर्माण करें।
    2. कार्य "ढूंढें नाभिक" का उपयोग करके नाभिक का चयन करें, जो सेल नाभिक से संबंधित छवि पर क्षेत्रों का पता लगाता है (यहां Hoechst के साथ दाग)। परमाणु क्षेत्र या व्यास के लिए एक सीमा निर्धारित करके मृत कोशिकाओं (पाइक्नोटिक नाभिक) से नाभिक को बाहर करें।
    3. कार्य "साइटोप्लाज्म ढूंढें" का उपयोग करके सेल साइटोप्लाज्म का चयन करें। यह कार्य कोशिका साइटोप्लाज्म से संबंधित नाभिक के आसपास के क्षेत्रों का पता लगाता है। केवल अच्छी तरह से खंडित कोशिकाओं को शामिल करें। माइटोटिक, एपोटोटिक और बुरी तरह से खंडित कोशिकाओं को बाहर करें। छवि की सीमा को छूने वाली कोशिकाओं को हटा दें।
    4. कार्यों को जोड़ें "आकृति विज्ञान गुणों की गणना करें" और "तीव्रता गुणों की गणना करें"। आकृति विज्ञान मापदंडों में ब्याज के क्षेत्र के लिए क्षेत्र जैसे आकृति विज्ञान गुणों की गणना शामिल है। तीव्रता मापदंडों में तीव्रता गुणों की गणना शामिल है जैसे ब्याज के क्षेत्र के लिए मतलब तीव्रता (जैसे न्यूरॉन्स का साइटोप्लाज्म)।
    5. एक या अधिक स्थितियों, आकृति विज्ञान और/या तीव्रता का उपयोग करके इनपुट जनसंख्या (सभी साइटोप्लाज्म्स चयनित) की एक उपजनसंख्या (जैसे, टीएच सकारात्मक न्यूरॉन्स) का चयन करें।
      नोट: आमतौर पर, तीव्रता न्यूरॉन्स के लिए चुना जाता है। नकारात्मक नियंत्रण के आधार पर, यह परिभाषित करना संभव है कि किस तीव्रता की सीमा न्यूरॉन्स को टीएच के लिए सकारात्मक माना जाता है।
    6. आउटपुट परिणामों को परिभाषित करें। यह प्रत्येक विश्लेषण का अंतिम भवन ब्लॉक है। यह एक संस्कृति प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए परख readout मूल्यों को परिभाषित करता है (परिणाम प्रति अच्छी तरह से) ।
    7. बैच विश्लेषण चलाएं और परिणामों का निर्यात करें। नाभिक की कुल संख्या के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या को सामान्य और सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं।

7. मात्रात्मक वास्तविक समय पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर)

  1. अनुपूरक फाइल 1:चरण 3 में वर्णित क्यूआरटी-पीसीआर प्रोटोकॉल करें।

Representative Results

हमारी स्वचालित सेल संस्कृति और इमेजिंग प्रणाली को मानव हस्तक्षेप को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था जिससे हमें एचआईपीएससी की खेती को मानकीकृत करने और कॉर्टिकल या मिडब्रेन डोपामिनेर्गिक (एमडीए) न्यूरॉन्स जैसे विभिन्न सेल प्रकारों में भेदभाव करने की अनुमति दी गई थी। एकीकृत इमेजिंग उपकरणों के साथ हमारी स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्र 1में दर्शाया गया है । इस स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली के लिए सेल संस्कृतियों का प्रारंभिक परिचय या तो स्वचालित रूप से एक ५० एमएल ट्यूब से कोशिकाओं बोने या संस्कृति या परख प्लेटों के आयात के लिए "परख प्लेटों की लोडिंग" विधि का उपयोग करके किया जा सकता है । हमारी प्रणाली का एक केंद्रीय घटक तरल हैंडलिंग स्टेशन है जहां मीडिया परिवर्तन या उप-खेती जैसे सभी तरल हस्तांतरण कदम किए जाते हैं। तरल हैंडलर के कस्टम निर्मित डेक लेआउट को चित्र 2में दर्शाया गया है। लिक्विड हैंडलिंग स्टेशन चार पदों से लैस है। चार प्लेटों तक इनक्यूबेटर से डेक में स्थानांतरित किया जा सकता है, समानांतर मीडिया परिवर्तन की अनुमति । चूंकि उपवृषि विधि में, माता-पिता और बेटी संस्कृति प्लेटों दोनों को डेक पर समायोजित किया जाना है, इसलिए समानांतर रूप से संसाधित संस्कृति प्लेटों की अधिकतम संख्या दो तक सीमित है। तरल हैंडलिंग स्टेशन की एक महत्वपूर्ण विशेषता सेल संस्कृति सुपरनैंट को पूरी तरह से हटाने के लिए मीडिया परिवर्तन के दौरान प्लेटों को झुकाने की संभावना है। इसके अलावा, तरल हैंडलिंग स्टेशन उपवृक्ष प्रोटोकॉल के निष्पादन के दौरान कोशिकाओं के एंजाइमेटिक वियोजन के पक्ष में शेकर्स से लैस है। हमारी स्वचालित संस्कृति प्रणाली भी दो इमेजिंग सिस्टम से लैस है: सेल गिनती और कन्फ्यूलेंसी जांच करने के लिए एक ब्राइटफील्ड इमेजिंग साइटोमीटर और इसलिए, समय के साथ सेल विकास की निगरानी, और तेजी से, उच्च सामग्री और कोशिकाओं के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए एक दोहरी कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप।

हिप्ससी संस्कृतियों को ब्राइटफील्ड इमेजिंग साइटोमीटर में विकास के लिए दैनिक निगरानी की जाती है और व्यापकता के प्रतिशत के लिए विश्लेषण किया जाता है। बाएं पैनल में ब्राइटफील्ड छवि और दाएं पैनल में साइटोमीटर(चित्रा 3 ए)के साथ प्राप्त ब्राइटफील्ड छवि के विश्लेषण से एक हरे रंग का मुखौटा। समय के साथ एक सजातीय एचिप्ससी वृद्धि देखी जाती है, जैसा कि समानांतर रूप से उगाई जाने वाली दो एचआईपीएससी लाइनों (एन = 4 प्लेटों) के संगम प्रतिशत द्वारा दिखाया गया है और दिन 1 से 6(चित्रा 3B)तक की जांच के अधीन है। निर्धारित सीमा तक पहुंचने पर, एचआईपीएससी को पारित कर दिया जाता है। सेल लाइनों को मैन्युअल रूप से (एम) या स्वचालन (ए) प्रणाली द्वारा सुसंस्कृत किया गया था और कम से कम दो मार्ग, प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियों(चित्रा 4 ए)के लिए विशिष्ट स्टेम सेल आकृति विज्ञान के रखरखाव के लिए मनाया गया था। हिप्ससी ने मैन्युअल रूप से सुसंस्कृत (नहीं दिखाया) या स्वचालित प्रणाली में ठेठ स्टेम सेल मार्कर OCT4 (लाल) और SSEA4 (हरा) का प्रदर्शन किया, जैसा कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख(चित्रा 4B)में दिखाया गया है। क्यूआरटी-पीसीआर(चित्रा 4सी)द्वारा प्लुरिपोती मार्कर OCT4, NANOG और REX1 की अभिव्यक्ति का भी एमएनए स्तर पर आकलन किया गया था। डुप्लिकेट (1 और 2 की प्रतिकृति) में मैन्युअल रूप से उगाई गई एक सेल लाइन से और स्वचालित संस्कृति प्रणाली (ए) में एकत्र किए गए नमूनों के साथ सापेक्ष मात्राकरण किए गए थे। स्वचालित संस्कृति प्रणाली में खेती की प्रतिकृति में सभी तीन pluripotency मार्कर की अभिव्यक्ति का स्तर मैनुअल संस्कृति के बाद मार्कर अभिव्यक्ति के समान हैं । दिन 8 (D8) पर, पूर्णपत्व मार्कर की अभिव्यक्ति हिप्ससी से कॉर्टिकल न्यूरॉन्स विभेदित (डिफ) में अनुपस्थित थी।

स्वचालित संस्कृति प्रणाली का एक महत्वपूर्ण अनुप्रयोग न्यूरॉन्स सहित विभिन्न सेल प्रकारों में एचआईपीएससी का भेदभाव है। यहां हम एनजीएन2 रणनीति का उपयोग करके न्यूरॉन्स में एचआईपीसी के भेदभाव को दिखाते हैं, जो बहुत कम समय (लगभग 6 दिनों) में एक शुद्ध कॉर्टिकल न्यूरॉन संस्कृति का उत्पादन करता है। स्वचालित संस्कृति प्रणाली (ए) में विभेदित न्यूरॉन्स ने इसी तरह की आकृति विज्ञान और न्यूरोनल नेटवर्क संगठन प्रस्तुत किया क्योंकि न्यूरॉन्स ने मैन्युअल रूप से खेती की (एम)(चित्रा 5A)। स्वचालित विभेदित कॉर्टिकल न्यूरॉन्स TUBB3 (न्यूरॉन-विशिष्ट कक्षा III β-ट्यूबलिन, लाल) और बीआरएन 2 (ऊपरी कॉर्टिकल लेयर मार्कर, ग्रीन)(चित्रा 5B)के लिए सकारात्मक थे, जो मैन्युअल रूप से विभेदित न्यूरॉन्स (डेटा नहीं दिखाए गए) के बराबर थे। माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन 2(MAP2),तंत्रिका कोशिका आसंजन अणु(NCAM1)और Synapsin-1(SYN1)सहित न्यूरोनल मार्कर की अभिव्यक्ति, साथ ही कॉर्टिकल न्यूरॉन मार्कर BRN2 और CUX1 (ऊपरी कॉर्टिकल परत) को न्यूरॉन्स में विभेदन(चित्रा 5C)के दिन 8 (D8) पर समृद्ध किया गया । हिप्ससी में इन मार्कर की बहुत कम या कोई अभिव्यक्ति नहीं देखी गई। डुप्लिकेट (1 और 2 की प्रतिकृति) में मैन्युअल रूप से उगाई गई एक सेल लाइन से और स्वचालित संस्कृति प्रणाली (ए) में एकत्र किए गए नमूनों के साथ सापेक्ष मात्राकरण किए गए थे। प्रतिकृति में अभिव्यक्ति का स्तर मैन्युअल और स्वचालित अंतर के बीच समान भिन्नता दिखाता है।

स्वचालित संस्कृति प्रणाली की एकीकृत इमेजिंग क्षमता संस्कृतियों के स्वास्थ्य के लिए हाथ से मुक्त डेटा संग्रह की अनुमति देती है इस प्रकार फेनोटाइपिक रीडआउट के दीर्घकालिक स्वचालित अधिग्रहण को सक्षम करती है। जीएफपी लेंटीवायरस के साथ स्थानांतरित एक छोटे अणु व्युत्पन्न तंत्रिका अग्रदूत (एसएमएनपीसी) लाइन के लिए NGN2 दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने एक लाइव-सेल स्वचालित न्यूराइट आउटग्रोथ परख की स्थापना की जिसमें न्यूराइट लंबाई को बिना किसी मैनुअल हस्तक्षेप के 11 दिनों के भेदभाव से अधिक मापा गया था। समय के साथ न्यूराइट जटिलता में वृद्धि हुई, जैसा कि 1, 3 और 11 दिन, जीएफपी अभिव्यक्ति और विश्लेषण से नकाबपोश छवियों(चित्र 6ए, बी)पर न्यूराइट्स के साथ कब्जे वाले क्षेत्र द्वारा प्रदर्शित किया गया है। भेदभाव के दिन 1 से 11 तक न्यूराइट लंबाई में वृद्धि की मात्रा निर्धारित की गई थी और विभिन्न कुओं में इसी तरह का विकास दिखाया गया था। सादगी के लिए, 96-अच्छी प्लेट से 6 कुओं के साथ केवल 3 स्तंभों के डेटा को प्रतिनिधि ग्राफ में चित्रित किया गया है, हालांकि सभी आंतरिक 60 कुओं का विश्लेषण किया गया(चित्रा 6C)।

यहां दिखाए गए स्वचालित संस्कृति प्रणाली का एक और अनुप्रयोग एमडीए न्यूरॉन्स में एचआईपीएससी का भेदभाव है। भेदभाव एक पूर्व स्थापित प्रोटोकॉल के बाद मीडिया परिवर्तनों पर आधारित है और 0 से ६५ दिनों तक स्वचालित संस्कृति प्रणाली पर किया गया था । स्वचालित मीडिया परिवर्तनों के कारण सेल टुकड़ी या भेदभाव में किसी अन्य नेत्रहीन पता लगाने योग्य परिवर्तन नहीं हुआ। भेदभाव के अंत में, 65 दिन, एमडीए न्यूरॉन्स मैनुअल भेदभाव(चित्रा 7ए, बी)के बराबर सेलुलर संगठन और आकृति विज्ञान (स्पफेरिक सोमा, लंबी और कांटेदार डेंड्राइट्स) दिखाते हैं। एमआरएनए स्तर पर, स्वचालित संस्कृति प्रणाली में विभेदित एमडीए न्यूरॉन्स क्रमशः न्यूरोनल और एमडीए मार्कर, MAP2 और TH (टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज) की अभिव्यक्तिदिखाते हैं( चित्र 7 सी)। दोनों अंतर TH और MAP2 सकारात्मक न्यूरॉन्स(चित्रा 7D)की पर्याप्त मात्रा में उत्पन्न ।

Figure 1
चित्रा 1: स्वचालित सेल संस्कृति और इमेजिंग मंच का योजनाबद्ध सिंहावलोकन।
इस प्रणाली को सेल संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए बाँझ वातावरण सुनिश्चित करने वाले चार यूवी लैंप से लैस पॉलीकार्बोनेट आवास और दो हेपा हुड (ए और बी) के साथ डिजाइन किया गया था। सेल संस्कृति प्लेटें रोबोट बांह के सामने अलमारियों पर भरी हुई हैं जिन्हें सामने के दरवाजे (सी) के माध्यम से पहुंचा जा सकता है। प्लेटों को 456 प्लेटों की क्षमता वाले सीओ2 इनक्यूबेटर (डी) में लोड किया जाता है। एक ब्राइटफील्ड सेल साइटोमीटर (ई) का उपयोग सबकुनटिवेशन दिनचर्या के दौरान कन्फ्यूशियस चेक और सेल काउंटिंग के लिए किया जाता है। तरल हैंडलिंग स्टेशन हेपा हुड (बी) में से एक के नीचे है। तरल हैंडलर का डेक लेआउट चित्र 2में वर्णित है। तरल हैंडलिंग स्टेशन की पाइपिंग शाखा में 96 चैनल पाइपिंग हेड, आठ 1 एमएल पाइपिंग चैनल और चार 5 एमएल पाइपिंग चैनल होते हैं। 1 एमएल पाइपिंग चैनलों के मामले में, तरल हस्तांतरण के लिए युक्तियों या सुइयों का उपयोग किया जा सकता है। स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए, परख प्लेटों में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं को एक दूसरे इनक्यूबेटर (जी) में इन नमूनों को विगलन करने के बाद स्वचालित -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण प्रणाली (एफ) में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत नमूनों के साथ इलाज किया जा सकता है। दो कताई डिस्क या एपिफ्लोरेसेंस मोड में उपयोग करके कॉन्फोकल मोड में छवियों को प्राप्त करने के लिए स्वचालित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (एच) की पेशकश में उच्च थ्रूपुट इमेजिंग की जाती है। माइक्रोस्कोप में एकीकृत एक लाइव-सेल कक्ष सुसंस्कृत कोशिकाओं की दीर्घकालिक इमेजिंग करने की अनुमति देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: तरल हैंडलिंग स्टेशन का डेक लेआउट।
टिप पदों को 50 माइक्रोन युक्तियों के लिए "50 माइक्रोन" द्वारा इंगित किया जाता है, 300 माइक्रोन युक्तियों के लिए "मानक" द्वारा, 1 एमएल सुझावों के लिए "उच्च" द्वारा और 5 एमएल सुझावों के लिए "5 एमएल" द्वारा। डेक घटक:(ए)चार गर्म शेखर स्थितियां (अधिकतम गति: 2500 आरपीएम) जिसका उपयोग किसी भी संस्कृति प्लेट या परख प्लेट प्रारूप के लिए किया जा सकता है। शेकर पोजीशन क्लैंप करने योग्य तवे से लैस हैं जो डेक तक परिवहन के बाद प्लेट संरेखण के लिए भी उपयोग किए जाते हैं। इसके अलावा, शेखर स्थिति तरल हस्तांतरण चरणों के दौरान प्लेटों के लिए ढक्कन पार्किंग की स्थिति के रूप में कार्य करते हैं। प्रतिनिधि प्रयोजनों के लिए, सभी शेखर पदों पर ९६ अच्छी तरह से परख प्लेटों का कब्जा कर रहे हैं । (ख)किसी भी प्रारूप की चार प्लेटों को संसाधित करने के लिए चार झुकाव मॉड्यूल एक साथ शीर्ष पर तैनात हैं । सबसे कम स्थिति संस्कृति और परख प्लेटों और ९६ चैनल pipetting सिर के लिए अपशिष्ट संग्रह कक्ष के निशान । प्रतिनिधि प्रयोजनों के लिए, सभी झुकाव मॉड्यूल 96-अच्छी तरह से परख प्लेटों द्वारा कब्जा कर रहे हैं। (ग)शीर्ष स्थान पर, सेल काउंटिंग के लिए 384-वेल प्लेट स्थित है। नीचे प्लेटों के लिए दो पदों है कि प्रतिनिधि प्रयोजनों के लिए ९६ अच्छी तरह से प्लेटों और चार ५० एमएल और चार 15 एमएल ट्यूबों के लिए एक रैक द्वारा कब्जा कर रहे हैं । सबसे कम स्थिति 5 एमएल टिप्स के कब्जे में है। (घ)मीडिया जलाशयों के लिए पदों के साथ तीन मीडिया लाइनें । मीडिया लाइनों में तरल स्तर के सेंसर होते हैं जो मीडिया जलाशय को मीडिया के 250 एमएल तक स्वचालित रूप से भरने की अनुमति देते हैं। (ई)सक्रिय नाली के साथ दो तरल अपशिष्ट मॉड्यूल शीर्ष पर आधारित हैं, एक कंटेनर (सफेद) और एक 5 एमएल टिप रैक के लिए एक स्थिति के साथ एक तापमान नियंत्रित मॉड्यूल के नीचे स्थित हैं । (एफ)1 एमएल टिप्स के लिए पांच पोजिशन । (जी)दो तापमान नियंत्रित मॉड्यूल नीचे तैनात है और शीर्ष पर उनके lids में से एक पार्किंग के लिए एक स्थिति है । (H)शीर्ष में दो ५० μL नेस्टेड टिप रैक (एनटीआर) के लिए पदों के बाद एकल चैनल के लिए दो पदों और ९६-चैनल ३०० μL युक्तियों और नीचे एक 5 एमएल टिप रैक की उठाओ । (I)शीर्ष पर ३८४-अच्छी तरह से गिनती प्लेटों के लिए एक स्टैकर और नीचे तीन ३०० μL NTR और एक 5 एमएल टिप रैक के बाद । (जम्मू)आठ पुन: प्रयोज्य धातु 1 एमएल सुइयों के तीन सेट के लिए भंडारण और वॉश स्टेशन । (K)1 एमएल और 5 एमएल पाइपिंग चैनलों और खाली एनटीआर (ग्रे) के साथ-साथ ऑन-डेक परिवहन चरणों के लिए उपयोग किए जाने वाले 1 और 5 एमएल चैनलों (सफेद) के लिए एक तवे ब्लॉक के लिए अपशिष्ट स्थिति । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एचआईपीएससी की स्वचालित कन्फ्यूशियस चेक।
(ए)सेल साइटोमीटर (बाएं) द्वारा ली गई हाइप्ससी की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड (बीएफ) छवियां और स्वचालित संकुचन विश्लेषण (दाएं) के बाद जो हरे रंग में कोशिकाओं द्वारा कब्जा किए गए आनुपातिक क्षेत्र को दर्शाती है; (ख)संस्कृति के दिन 1 से 6 तक दो एचएससी लाइनों (आईपीएस #1 और #2) से दर्ज की गई कन्फ्यूशियस प्रतिशत, एन = 4 1-अच्छी प्लेटें प्रति सेल लाइन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एचआईपीएससी की पासिंग।
(A)एक एचआईपीएससी लाइन की बीएफ छवि मैन्युअल रूप से उगाई गई (बाएं) और स्वचालित संस्कृति प्रणाली (दाएं) का उपयोग करके। छवियों को दूसरी पासिंग के 6 दिन बाद लिया गया; (ख)फ्लुरिपोता मार्कर OCT4 और SSEA4 के लिए दाग hiPSC के प्रतिनिधि छवियां, और Hoechst ३३३४२ (नाभिक) के साथ जवाबी दाग; (ग)एक हिप्ससी लाइन में प्लेरिपोपॉंसी मार्कर OCT4, नैनोजी और रेक्स1 के लिए क्यूआरटी-पीसीआर के परिणाम डुप्लीकेट (1 और 2) मैन्युअल रूप से (एम) और स्वचालित संस्कृति प्रणाली (ए) में और संबंधित एचआईपीएससी-व्युत्पन्न कॉर्टिकल न्यूरॉन्स (डिफ) में भेदभाव के दिन 8 (डी8) में खेती की गई । डेटा संदर्भ नमूने के रूप में iPS_a_1 का उपयोग कर सापेक्ष मात्रा (आरक्यू) के रूप में दर्शाया जाता है। त्रुटि सलाखों क्यूआरटी-पीसीआर प्रतिक्रिया के 3 तकनीकी प्रतिकृति से मानक विचलन (एसडी) का प्रतिनिधित्व करते हैं। गपध, RPL13A1 और RPLPO हाउसकीपिंग जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया । स्केल बार: 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कॉर्टिकल न्यूरॉन्स।
(क)6 दिन की ब्राइटफील्ड छवियां, मैन्युअल रूप से (एम) और स्वचालित (क) विभेदित कॉर्टिकल न्यूरॉन्स समान न्यूरोनल नेटवर्क दिखाते हैं; (ख)भेदभाव के दिन 8 पर TUBB3 (पैन न्यूरोनल), BRN2 (कॉर्टिकल न्यूरॉन्स) और Hoechst ३३३४२ (नाभिक) के लिए दाग कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियां; (ग)कॉर्टिकल न्यूरॉन्स के मार्कर जीन के लिए क्यूआरटी-पीसीआर के परिणाम(MAP2, BRN2, CUX2, NCAM1 और SYN1)भेदभाव के दिन 8 (D8) में समृद्ध । डेटा संदर्भ नमूने के रूप में iPS_a_1 का उपयोग कर सापेक्ष मात्रा (आरक्यू) के रूप में दर्शाया जाता है। त्रुटि सलाखों क्यूआरटी-पीसीआर प्रतिक्रिया के 3 तकनीकी प्रतिकृति से एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं। गपध, RPL13A1 और RPLPO हाउसकीपिंग जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया । स्केल बार: 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: न्यूराइट आउटग्रोथ के लिए एक उच्च थ्रूपुट परख।
(A)जीएफपी की प्रतिनिधि छवियां भेदभाव के 1, 3 और 11 दिनों पर कोशिकाओं को व्यक्त करती हैं; (ख)भेदभाव के 1, 3 और 11 दिनों पर न्यूराइट्स की प्रतिनिधि बाइनरी छवियां । न्यूराइट आउटग्रोथ को उच्च सामग्री छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर 1 का उपयोग करके निर्धारित किया गया था और इसका प्रतिनिधित्व न्यूराइट लंबाई के रूप में किया जाता है; (ख) ग्राफिक एनपीसी-व्युत्पन्न NGN2 न्यूरॉन्स में न्यूराइट लंबाई में वृद्धि और एक घने नेटवर्क के गठन को प्रदर्शित करता है । भीतरी 60 कुओं में कोशिकाओं के साथ तीन 96-अच्छी तरह से प्लेटें चित्रित कर रहे हैं। सादगी के लिए, प्रति 96-अच्छी प्लेट कुओं के केवल तीन कॉलम एन = 6 कुओं प्रति कॉलम के साथ एक उदाहरण के रूप में दिखाए जाते हैं। प्रति अच्छी तरह से औसतन 1308 कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया। त्रुटि सलाखों के मतलब के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते है (एसई.M. । स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न एमडीए न्यूरॉन्स।
मिडब्रेन दा न्यूरॉन्स मैन्युअल रूप से (एम) और स्वचालित (ए) संस्कृति प्रणाली में विभेदित। (A, B) टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज (टीएच, एमडीए न्यूरॉन मार्कर; ग्रीन), MAP2 (न्यूरोनल मार्कर; लाल) और होचस्ट 33342 (न्यूक्लिई; ब्लू) के लिए दाग एमडीए न्यूरॉन्स की प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियां; (ग)एमडीए न्यूरॉन्स के मार्कर जीन के लिए प्रतिनिधि क्यूआरटी-पीसीआर परिणाम मैन्युअल रूप से और स्वचालित संस्कृति प्रणाली में विभेदित। TH और MAP2 अभिव्यक्ति के स्तर को सापेक्ष मात्रा (आरक्यू) के रूप में दर्शाया जाता है जो हाउसकीपिंग जीन(ओजे 1 और गैपध)के लिए सामान्यीकृत होता है; (घ)मैनुअल और स्वचालित भेदभाव द्वारा उत्पन्न TH और MAP2 सकारात्मक न्यूरॉन्स के प्रतिशत। त्रुटि सलाखों के दो अलग आईपीएससी लाइनों (#1 और #2) के साथ प्रदर्शन दो स्वतंत्र अंतर के एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं । स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सेल प्रकार उद्देश्य प्रोटोकॉल कदम सेल घनत्व प्लेट प्रारूप सेल नंबर/वेल
NGN2 भेदभाव
आईपीएससी NGN2 स्थिर लाइन उत्पादन एस.2.3. 30,000 कोशिकाएं/सेमी2 12-कुआं 1,17,000
आईपीएससी NGN2 न्यूरॉन भेदभाव 3.1.3. 30,000 कोशिकाएं/सेमी2 1-अच्छी तरह से 25,20,000
आईपीएससी NGN2 न्यूरॉन भेदभाव 3.1.3. 30,000 कोशिकाएं/सेमी2 96-कुआं 9,600
एसएमएनपीसी जनरेशन
एसएमएनपीसी 12 और 16 दिन का रिप्लेटिंग S5.9. और S5.11। 70,000 कोशिकाएं/सेमी2 6-अच्छी तरह से 6,72,000
एसएमएनपीसी मार्ग 5 से रिप्लेटिंग 5.11. 50,000 कोशिकाएं/सेमी2 6-अच्छी तरह से 4,80,000
एसएमएनपीसी NGN2 न्यूरॉन्स के लिए smNPC 3.2.2 50,000 कोशिकाएं/सेमी2 96-कुआं 16,000
एमडीए भेदभाव
आईपीएससी एमडीए न्यूरॉन भेदभाव 4.1.2. 200,000 कोशिकाएं/सेमी2 1-अच्छी तरह से 1,68,00,000
दा न्यूरॉन्स दिन 25 रिप्लेटिंग 4.3.2. 400,000 कोशिकाएं/ 1-अच्छी तरह से 3,36,00,000
दा न्यूरॉन्स दिन 25 रिप्लेटिंग 4.5.2. 100,000 कोशिकाएं/ 96-कुआं 32,000
आवरण उद्देश्य प्रोटोकॉल कदम एकाग्रता/
कमजोर पड़ने		 प्लेट प्रारूप कोटिंग का विवरण
आईपीएस संस्कृति
एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स आईपीएससी, एनजीएन2 लाइन,
एमडीए न्यूरॉन्स		 1.5.7. और S2.3. 1 अलीकोट *;
25 एमएल डीएमईएम/एफ-12		 1-/12-अच्छी तरह से 8/0.5 एमएल/वेल; आरटी में 1 घंटे
NGN2 भेदभाव
पॉली-एल-ऑर्निथिन NGN2 न्यूरॉन भेदभाव 3.1.3. और 3.2.2. 0.1 मिलीग्राम/एमएल; पीबीएस 1-/96-अच्छी तरह से 8/0.1 एमएल/वेल; 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे;
3x पीबीएस वॉश
लैमिनिन NGN2 न्यूरॉन भेदभाव 3.1.3. और 3.2.2. 5 μg/mL; पीबीएस 1-/96-अच्छी तरह से 8/0.1 एमएल/वेल; 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे
एसएमएनपीसी जनरेशन
एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स एसएमएनपीसी पीढ़ी और संस्कृति S5.6., S5.9.,
S5.11।		 1 अलीकोट *;
25 एमएल डीएमईएम/एफ-12		 6-अच्छी तरह से 1 एमएल; आरटी में 2 घंटे
एमडीए भेदभाव
एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स एमडीए भेदभाव 4.1.2. 1 अलीकोट *;
25 एमएल डीएमईएम/एफ-12		 1-अच्छी तरह से 12 एमएल; 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे
पॉली-एल-ऑर्निथिन एमडीए भेदभाव 4.3.2. और 4.5.2. 0.1 मिलीग्राम/एमएल; पीबीएस 1-/96-अच्छी तरह से 12/0.1 एमएल/वेल;
37 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे; 3x पीबीएस वॉश
लैमिनिन एमडीए भेदभाव 4.3.2. और 4.5.2. 10 μg/mL; पीबीएस 1-/96-अच्छी तरह से 12/0.1 एमएल/वेल; 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे
फाइब्रोनेक्टिन एमडीए भेदभाव 4.3.2. और 4.5.2. 2 μg/mL; पीबीएस 1-/96-अच्छी तरह से 12/0.1 एमएल/वेल; 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे
* एक एक्सेलिलिएलर मैट्रिक्स एलिकोट को इस उत्पाद के विश्लेषण के प्रमाण पत्र में मौजूद कमजोर पड़ने वाले कारक (μL में) के रूप में परिभाषित किया गया है।

तालिका 1: प्लेट प्रारूप से संबंधित सेल घनत्व और कोटिंग का सीडिंग।

दिन अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ)
दिन 0 - 1 100 एनएम LDN193189, 10 μM SB431542
दिन 1 - 3 100 एनएम एलडीएन193189, 10 माइक्रोन एसबी431542, 1 एमएमएम एसएचएचएच, 2 एमएम पुरमोर्फामाइन,
100ng/mL FGF-8b
दिन 3 - 5 100 एनएम एलडीएन193189, 10 माइक्रोन एसबी431542, 1 एमएमएम एसएचएचएच, 2 एमएम पुरमोर्फामाइन,
100ng/mL FGF-8b, 3 μM CHIR999021
दिन 5 - 7 100 एनएम LDN193189, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mLFGF-8b,
3 माइक्रोम चिर99021
दिन 7 - 9 100 एनएम LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM चिर99021
दिन 9 - 11 100 एनएम LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM चिर99021
दिन 11 - 13 3 μM CHIR99021, 20 एनजी/mL BDNF, ०.२ mM L-ascorbic एसिड (AA1), 20 एनजी/mL
जीडीएनएफ, 1 एमएमएम डीबी-सीएएमपी, 1 एनजी/एमएल टीजीएफए3, 10 माइक्रोन डीएपीटी
दिन 13 - 65 20 एनजी/एमएल बीडीएनएफ, 0.2 एमएम एल-एस्कॉर्बिक एसिड (एए1), 20 एनजी/एमएल जीडीएनएफ, 1 एमएम डीबी-सीएएमपी,
1 एनजी/एमएल TGFß3, 10 μM DAPT

तालिका 2: डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन भेदभाव के लिए छोटे अणु इसके अलावा।

दिन केएसआर माध्यम N2 मध्यम भेदभाव माध्यम
दिन 0 - 1 100% 0 0
दिन 1 - 3 100% 0 0
दिन 3 - 5 100% 0 0
दिन 5 - 7 75% 25% 0
दिन 7 - 9 50% 50% 0
दिन 9 - 11 25% 75% 0
दिन 11 - 13 0 0 100%
दिन 13 - 65 0 0 100%

तालिका 3: डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन भेदभाव के लिए मीडिया ढाल।

अनुपूरक फाइल 1. इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

हम हिप्ससी संस्कृति और न्यूरोनल भेदभाव के मानकीकरण के लिए एकीकृत इमेजिंग क्षमताओं के साथ एक स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली पेश करते हैं। न्यूनतम उपयोगकर्ता हस्तक्षेप के कारण, प्रयोगात्मक भिन्नता भेदभाव के दौरान सेलुलर फेनोटाइप की प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने में कम है। कैलेंडर-आधारित शेड्यूलर संगठन और प्रयोगों के समानांतरीकरण का समर्थन करता है और उच्च स्तर के लचीलेपन की अनुमति देता है जिस समय प्रयोग किए जाते हैं। मौजूदा तरीकों को आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है और उपलब्ध तरीकों के स्पेक्ट्रम को बढ़ाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, परख प्लेट प्रारूपों की एक बड़ी संख्या इस प्रणाली के लचीलेपन को जोड़ने का इस्तेमाल किया जा सकता है । न्यूनतम प्रणाली जिसमें सीओ2 इनक्यूबेटर, एक रोबोटिक आर्म, एक ब्राइटफील्ड सेल साइटोमीटर और एक तरल हैंडलिंग स्टेशन शामिल है, जो अकादमिक अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए सस्ती लागत के साथ हिप्ससी संस्कृति और भेदभाव के लिए आवश्यक बुनियादी इकाई बनाती है। यौगिकों, आरएनएआई पुस्तकालयों या CRISPR/Cas9 पुस्तकालयों के भंडारण के लिए एक स्वचालित -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण प्रणाली के साथ स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली का संयोजन, और एक उच्च सामग्री/उच्च-थ्रूपित माइक्रोस्कोप के एकीकरण से फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग का निष्पादन सक्षम होता है ।

वर्तमान अध्ययन में, स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली डिस्पोजेबल सुझावों का इस्तेमाल किया और संस्कृति मीडिया जलाशय में मैन्युअल रूप से भर दिया गया था, इस प्रकार मीडिया परिवर्तन और अंय संस्कृति प्रक्रियाओं के लिए तरल हैंडलिंग स्टेशन के उपयोग को सीमित विशेष रूप से रातोंरात । इस सीमा को दरकिनार करने के लिए, तरीकों को डिस्पोजेबल युक्तियों के बजाय सुई के उपयोग में समायोजित किया जा सकता है और, फ्रिज में संग्रहीत मीडिया लाइनों और मीडिया बैग के बीच ट्यूब कनेक्शन स्थापित करने के बाद, मीडिया जलाशयों को स्वचालित रूप से ताजा मीडिया के साथ फिर से भरा जा सकता है जो हीटर तत्वों द्वारा पूर्व-गरम होता है। इससे टिप्स, कल्चर मीडिया और जलाशय एक्सचेंजों के मैनुअल रिफिलिंग के कारण उपयोगकर्ता हस्तक्षेप कम हो जाएगा ।

हमारी स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली कई फायदे प्रदान करती है। इनमें से एक बारकोड ट्रैकिंग सिस्टम है। सिस्टम में भरी हुई प्लेटों की पहचान एक अद्वितीय बारकोड द्वारा की जाती है जिसे विधि निष्पादन के दौरान और बाद में नमूनों की ट्रैकिंग की अनुमति देने वाली प्रणाली द्वारा पढ़ा और सहेजा जाता है। एक और लाभ उपयोगकर्ता विशिष्ट परियोजनाओं को बनाने की संभावना है। यहां, सिस्टम में लोड की गई संस्कृति प्लेटों को एक विशिष्ट परियोजना को सौंपा जा सकता है और बैचों में समूहित किया जा सकता है। बैचों में संरचना एक निश्चित बैच की सभी प्लेटों के लिए एक ही प्रक्रिया के निष्पादन को सरल बनाती है क्योंकि किसी भी व्यक्तिगत प्लेटों का चयन करने की आवश्यकता नहीं है। इसके अतिरिक्त, एक तरल वर्ग संपादक प्रत्येक तरल हस्तांतरण चरण के लिए पाइपिंग गति और ऊंचाई के साथ-साथ आकांक्षा और वितरण मापदंडों को समायोजित करने की अनुमति देता है। हर प्रक्रिया लॉग फ़ाइलों में प्रलेखित है जो कार्य एक दिया संस्कृति या परख प्लेट के लिए प्रदर्शन किया गया है वापस जाना करने की अनुमति ।

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) से प्राप्त न्यूरॉन्स और अन्य सेल प्रकार विशिष्ट रोगी आबादी में न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के तंत्र का अध्ययन करने के लिए विट्रो उपकरणों में उपयोगी होते हैं (जैसे पार्किंसंस रोग के लिए डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स) व्यक्तिगत दवा स्क्रीनिंग के लिए संभावना प्रदान करते हैं। खेती hiPSC बहुत समय गहन है और जटिल भेदभाव प्रोटोकॉल, आमतौर पर कम पैमाने पर उत्पादन तक ही सीमित निष्पादित करने के लिए प्रशिक्षित लोगों की मांग । हमने एक स्वचालित संस्कृति के लिए एचआईपीएससी की फीडर-मुक्त संस्कृति को अनुकूलित किया और दो न्यूरोनल भेदभाव प्रोटोकॉल, एक टेट-ऑन प्रमोटर10, 11केतहत एनजीएन2 ओवर-एक्सप्रेशन पर आधारित एक रैपिड कॉर्टिकल न्यूरॉन विभेदन प्रोटोकॉल और मिडब्रेन डोपामिनर्जिक (एमडीए) न्यूरॉन्स13के उत्पादन के लिए एकदीर्घकालिकछोटे अणु आधारित प्रोटोकॉल को लागू किया। मैनुअल संस्कृति और भेदभाव प्रोटोकॉल की सीधी हस्तांतरण और प्रजनन क्षमता स्वचालित संस्कृति प्रणाली को बहुत उपयोगी बनाती है। मानव आईपीएससी स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली में सुसंस्कृत लगातार स्टेम सेल आकृति विज्ञान दिखाया और महत्वपूर्ण pluripotency मार्कर, स्वतंत्र प्रयोगों के बीच प्रजनन व्यक्त किया । इसके अलावा, हिप्ससी संस्कृति प्रोटोकॉल के स्वचालन ने समानांतर रूप से बड़ी संख्या में सेल लाइनों की संस्कृति और विस्तार का पक्ष लिया। स्वचालित मांग जांच रातोंरात किए जाने वाले समय को बचाया जाता है, जब उपयोगकर्ता प्रयोगशाला में होता था (उदाहरण के लिए, कोशिकाओं की कटाई या भेदभाव के लिए मैनुअल रिप्लेटिंग)। उपयोगकर्ता-परिभाषित संगम सीमा तक पहुंचने पर, कोशिकाओं को स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली के स्टैकर पर उपलब्ध एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों में स्थानांतरित और फिर से लेपित किया जाता है। प्रत्येक मार्ग दौर के बारे में ७० मिनट लेता है और एक माता पिता की थाली है, जो एक दिन में 20 मार्ग की क्षमता के लिए अनुवाद से चार 1 अच्छी तरह से प्लेटें उत्पन्न करता है ।

NGN2 भेदभाव प्रोटोकॉल का स्वचालन सफलतापूर्वक किया गया था और विभिन्न मार्गों में न्यूरोनल कोशिकाओं की एक सजातीय आबादी के उत्पादन की अनुमति दी गई थी और मैनुअल भेदभाव के बराबर थी। इसके अलावा, बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग अध्ययन के लिए प्रायोगिक लागत कई सेल लाइनों या परीक्षण शर्तों के हजारों के साथ स्क्रीनिंग प्रयोगों/यौगिकों तेजी से अंतर के कारण कम हो जाएगा । लाइव-सेल न्यूट्राइट आउटग्रोथ मापन सहित लागत प्रभावी और उच्च-थ्रूपुट रीडआउट को रोग मॉडलिंग के लिए फेनोटाइपिक रीडआउट के रूप में आसानी से विकसित, लागू और उपयोग किया जा सकता है, जैसा कि पहले14,15,16दिखाया गया था। इस प्रकार, हमने छोटे अणु व्युत्पन्न तंत्रिका अग्रदूत (एसएमएनपीसी) कोशिकाओं का उपयोग करके एनजीएन2 प्रोटोकॉल को और अनुकूलित किया जो ओवर-एक्सप्रेस जीएफपी का गठन करते हैं। SMNPC कोशिकाओं संस्कृति मीडिया के साथ कम लागत सहित आगे लाभ प्रदान करते है (आईपीएससी संस्कृति के साथ लागत का एक तिहाई) और समय के लिए प्रयोगों को पैमाने पर आवश्यक है । एसएमएनपीसी से सेल की पैदावार आईपीएससी के साथ प्राप्त की तुलना में 7 से 10 गुना अधिक होती है। अंतर न्यूरॉन्स सफलतापूर्वक निगरानी और मैनुअल एंटीबॉडी धुंधला या रासायनिक लेबलिंग की आवश्यकता के बिना एक पूरी तरह से स्वचालित इमेजिंग प्रक्रिया का उपयोग कर कई दिनों के लिए छवि, लागत और समय की बचत खुद के द्वारा इमेजिंग सहित मैनुअल प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक थे । एक ९६ के भीतरी ६० कुओं की वर्तमान इमेजिंग अच्छी तरह से थाली प्रति 16 मिनट लेता है जब प्रति अच्छी तरह से 25 क्षेत्रों छवि रहे हैं, जिसका अर्थ है कि एक इमेजिंग के लिए डेटा १००० यौगिकों के लिए स्क्रीनिंग आधारित है, का अधिग्रहण किया जा सकता है और एक दिन में विश्लेषण किया । भविष्य में, इस readout न्यूराइट आउटग्रोथ दोषों के बचाव के लिए यौगिक स्क्रीनिंग अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इसके अलावा, हम आईपीएससी से मिडब्रेन डोपामिनेर्गिक (एमडीए) न्यूरॉन्स पैदा करने के लिए एक मैनुअल भेदभाव प्रोटोकॉल के हस्तांतरण को भी प्रदर्शित करते हैं। इस छोटे से अणु आधारित भेदभाव प्रोटोकॉल में 65 दिन लगते हैं और कई रिफ्लेटिंग चरणों और लगातार मीडिया परिवर्तनों के कारण श्रम गहन है, ज्यादातर हर 2 दिन, जो एक ही समय में कुछ आईपीएससी लाइनों के लिए एमडीए न्यूरॉन्स के उत्पादन को सीमित करता है। स्वचालित एमडीए भेदभाव प्रोटोकॉल में दर्जनों आईपीएससी लाइनों के भेदभाव को स्केलिंग करने का बड़ा लाभ है। 30 सेल लाइनों को समानांतर रूप से अलग किया जा सकता है। चूंकि भेदभाव ज्यादातर मीडिया परिवर्तनों पर आधारित है, इसलिए लगभग पूरी भेदभाव प्रक्रिया मानव हस्तक्षेप के बिना आयोजित की जा सकती है। स्वचालित प्रणाली के कैलेंडर-आधारित शेड्यूलर का उपयोग करके, हम भेदभाव चरणों के अनुसार मीडिया परिवर्तनों की योजना बना सकते हैं। सेल लाइनों और संस्कृति प्लेटों की इतनी बड़ी संख्या के साथ काम करने की एक सीमा रातोंरात मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन करने के लिए असंभव था । मुख्य कारण यह है कि हमारी प्रणाली डिस्पोजेबल युक्तियों और संस्कृति मीडिया के मैनुअल रिफिलिंग का उपयोग करने के लिए स्थापित की गई है, जिसमें इस मैनुअल चरण को निष्पादित करने के लिए प्रयोगशाला में उपयोगकर्ता की आवश्यकता होती है। मीडिया परिवर्तन प्रक्रिया को सुगम बनाने के लिए, सिस्टम में भरी हुई प्लेटों को एक परियोजना को सौंपा गया था और बैचों में समूहित किया गया था । बैच आकार तो डिस्पोजेबल सुझावों और उपलब्ध संस्कृति मीडिया की मात्रा की संख्या के लिए अनुकूलित किया गया था । जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, इस सीमा को पुन: प्रयोज्य/धोने योग्य सुइयों और मीडिया के स्वचालित रिफिलिंग के कार्यान्वयन से आसानी से दूर किया जा सकता है । कोशिकाओं की स्वचालित पासेजिंग/रिफ्लैटिंग, जैसा कि आईपीएससी के लिए दिखाया गया है, हमारे स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली द्वारा प्रदान की जाने वाली सुविधाओं में से एक है । हमने भेदभाव के दिन 25 पर एमडीए न्यूरॉन्स के स्वचालित रिप्लेटिंग का परीक्षण किया है। हालांकि, एमडीए न्यूरॉन्स के वियोजन के लिए आईपीएससी (8 मिनट) की तुलना में वियोजन एंजाइम के साथ इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है जो स्वचालित रिप्लेटिंग प्रक्रिया को 1 घंटे प्रति सेल लाइनों से अधिक तक बढ़ाता है। नतीजतन, एक ही दिन में 30 सेल लाइनों की स्वचालित रिप्लेटिंग असंभव हो गई। स्वचालित रिप्लेटिंग (प्लेटों का परिवहन, पाइपिंग) के दौरान अन्य चरणों को तेज करना और सिस्टम को सुइयों और मीडिया लाइन के उपयोग के लिए अनुकूल बनाना जो एक रात भर काम संभव बनाता है, इस सीमा को हल करेगा। कमियों के बावजूद, हम सफलतापूर्वक एमएपी 2 (न्यूरॉन) और टीएच (एमडीए न्यूरॉन्स) सकारात्मक कोशिकाओं की पर्याप्त मात्रा के साथ संस्कृतियों का उत्पादन एमडीए न्यूरॉन्स के एक स्वचालित भेदभाव के लिए मैनुअल प्रोटोकॉल हस्तांतरण सकता है।

समानांतर में आईपीएससी सेल लाइनों के दर्जनों अंतर परियोजनाओं में बहुत रुचि है कि पार्किंसंस रोग सहित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के आणविक तंत्र की जांच है । हालांकि, कम त्रुटियों के साथ तेजी से कार्यों को पूरा करने के लिए और कम लागत पर एक बड़ी चुनौती है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल (आईपीएससी, एसएमएनपीसी और एमडीए न्यूरॉन) के स्वचालन के कारण, हम अपनी परियोजनाओं में तेजी, लागत को कम और प्रजनन क्षमता में वृद्धि कर सकते हैं। सैकड़ों रोगी सेल लाइनों को शामिल करते हुए फाउंडिन-पीडी (https://www.foundinpd.org/wp/) जैसी परियोजनाओं के विकास से स्वचालित संस्कृति और भेदभाव प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। हमारे भविष्य के दृष्टिकोण में स्वचालित प्रणाली में मैनुअल 3 आयामी (3 डी) सेल संस्कृति मॉडल का हस्तांतरण शामिल है। प्लेट परिभाषा सेटिंग्स में मामूली अनुकूलन और एडाप्टर के उपयोग से 3डी संस्कृतियों के लिए आवश्यक वाणिज्यिक या कस्टम-निर्मित प्लेटों और माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों के उपयोग की अनुमति होगी। इसके अलावा, एक स्वचालित लेबल मुक्त इमेजिंग मॉडल के कार्यान्वयन से हमें वास्तविक समय में न्यूरोनल विकास को ट्रैक करने और रोग तंत्र की बेहतर समझ में न्यूराइट आउटग्रोथ, न्यूरॉन संगठन और सेल मृत्यु में परिवर्तन का अनुवाद करने की अनुमति मिलेगी।

Disclosures

हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों कृतज्ञता रोगियों और उनके परिवारों को जो इस अध्ययन के लिए जैव सामग्री का योगदान स्वीकार करते हैं । अध्ययन में इस्तेमाल की जाने वाली कोशिकाएं एनआईएनडीएस संग्रह से रटगर्स (ND41865 आईपीएस #1 के रूप में) और डॉ तिल्लो कुनाथ (आईपीएस #2) की प्रयोगशाला से थीं । इस काम को नोमिस फाउंडेशन (पीएच), रिमोड-एफटीडी, यूरोपीय संघ के संयुक्त कार्यक्रम - न्यूरोडीजेनेरेटिव डिजीज रिसर्च (जेपीएनडी) (पीएच) द्वारा समर्थित किया जाता है; DZNE I2A पहल (विज्ञापन); पीडी-स्ट्रैट, एक युग-नेट ERACoSysMed वित्त पोषित परियोजना (पीएच) और पार्किंसंस रोग (फाउंडिन-पीडी) (पीएच, ईबी) के लिए मूलभूत डेटा पहल । फाउंडिन-पीडी पीडी कार्यक्रम के लिए माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन के पथ का हिस्सा है । लेखकों ने स्टीवन फिंकबेनर और मेलानी Cobb (ग्लैडस्टोन संस्थानों) को मैनुअल एमडीए न्यूरॉन विभेदन प्रोटोकॉल और महोमी सुजुकी (योकोगावा इलेक्ट्रिक कॉर्पोरेशन) की स्थापना में योगदान देने के लिए न्यूराइट आउटग्रोथ विश्लेषण सेटअप में सहायता के लिए धन्यवाद दिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies Distributor Catalog Number Dilution
iPSC pluripotency marker
Mouse anti-SSEA4 Abcam ab16287 1 to 33
Rabbit anti-Oct3/4 Abcam ab19857 1 to 200
NGN2 neuron markers
Mouse anti- TUBB3 R & D MAB1195 1 to 500
Rabbit anti-BRN2 NEB 12137 1 to 1,000
mDA neuron markers
Chicken anti-TH Pel-Freez Biologicals 12137 1 to 750
Mouse anti-MAP2 Santa Cruz sc-74421 1 to 750
Secondary antibodies
Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11039 1 to 2,000
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11029 1 to 2,000
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594 Invitrogen A11032 1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012 1 to 2,000
Nuclei counterstaining
Hoechest 33342 Invitrogen H3570 1 to 8,000
Instruments Distributor Catalog Number Description/Application
Agilent TapeStation system Agilent technologies 4200 Automated electrophoresis
for DNA and RNA samples
Automated -20 °C storage system Hamilton Storage
Technologies		 Sample Access Manager
(SAM -20C, 3200 series)		 Storage of reagents
Barcode reader Honeywell Barcode Reader Orbit Barcode scanner
Brightfield cell cytomat Nexcelom Celigo Confluence check and
cell counting
CellVoyager 7000 Yokogawa CellVoyager 7000 Automated confocal
microscope
Cytomat for cell cultures Thermo Fisher Scientific Cytomat 24 C, CU 12 stackers pitch 28 mm,
12 stackers pitch 23 mm
(total of 456 plates)
Cytomat for thawing samples Thermo Fisher Scientific Cytomat 2-LIN, 60 DU
(Drying Unit)		 2 stackers pitch 28 mm
(total of 42 plates)
HEPA filters Hamilton Robotics Hood Flow Star UV Modified by Hamilton
Robotics
Liquid handling station Hamilton Robotics Microlab Star Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml
and 96 Channel MPH
Media reservoir Hamilton Robotics 188211APE Media/reagents reservoir
Pure water system Veolia Water ELGA PURELAB Classic Provides pure water for
needle wash station
QuantStudio 12K Flex Real-Time
PCR System		 Thermo Fisher Scientific QSTUDIO12KOA Real-time PCR machine
Robotic arm Hamilton Robotics Rackrunner Transport of plates
Turn table Hamilton Robotics Turn Table Adjust plate orientiation
Uninterruptible power supply APC Smart UPS RT Unit,
10000 VA Power supply		 Backup power supply
VIAFLO-pipettes Integra 4500 Electronic pipette
ViiA 7 Real-Time PCR System Applied Biosystems 4453545 Real-time PCR machine
Materials Distributor Catalog Number Notes
1-well culture plate (84 cm2) Thermo Fischer Scientific 165218 Nunc OmniTray
6-well culture plates (9.6 cm2) Greiner Bio-One 657160 TC treated with lid
12-well culture plate (3.9 cm2) Greiner Bio-One 665180 TC treated with lid
96-well culture plate (0.32 cm2) Perkin Elmer 6005558 CellCarrier-96 Black plate
Tips, 50-µL Hamilton Robotics 235987 50-uL tips
Tips, 300-µL Hamilton Robotics 235985 300-µL tips
Tips, 1000-µL Hamilton Robotics 235939 1000-µL tips
Tips, 5-mL Hamilton Robotics 184022 5-mL tips
Tubes, 15-mL Greiner Bio-One 188271 15-mL tubes
Tubes, 50-mL Greiner Bio-One 227261 50-mL tubes
Nalgene cryogenic 2.0 mL vials Sigma Aldrich V5007 Cryovials
Plasmids Distributor Catalog Number Notes
pLV_hEF1a_rtTA3 Addgene 61472 Kind gift from Ron Weiss
pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro Addgene 61474 Kind gift from Ron Weiss
pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus Takara Bio 631983
Primers Sequence (forward) Sequence (reverse) Source
iPSC pluripotency
OCT4 (ID 4505967a1) CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC PrimerBank
NANOG (ID 153945815c3) CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC PrimerBank
REX1 (ID 89179322c1) AGAAACGGGCAAAGACAAGAC GCTGACAGGTTCTATTTCCGC PrimerBank
NGN2 neurons
MAP2 (ID 87578393c1) CTCAGCACCGCTAACAGAGG CATTGGCGCTTCGGACAAG PrimerBank
BRN2 (ID 380254475c1) CGGCGGATCAAACTGGGATTT TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT PrimerBank
CUX2 (ID 291045458c2) CGAGACCTCCACACTTCGTG TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG PrimerBank
NCAM1 (ID 336285437c3) TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC CTCACAGCGATAAGTGCCCTC PrimerBank
SYNAPSIN1 (ID 91984783c3) TGCTCAGCAGTACAACGTACC GACACTTGCGATGTCCTGGAA PrimerBank
mDA neurons
TH CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA NCBI primer-BLAST
MAP2 GGATCAACGGAGAGCTGAC TCAGGACTGCTACAGCCTCA NCBI primer-BLAST
Housekeeping genes
GAPDH GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG GAGCCCCAGCCTTCTCCATG NCBI primer-BLAST
OAZ1 AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT ATGAAGACATGGTCGGCTCG NCBI primer-BLAST
RPLPO CCTCATATCCGGGGGAATGTG GCAGCAGCTGGCACCTTATTG NCBI primer-BLAST
RPL13A GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC NCBI primer-BLAST
Media and Reagents Distributor Catalog Number Use concentration
Coating matrix
Extracellular matrix (Matrigel) Corning 354277 10 μg/mL
Fibronectin Corning 356008 2 μg/mL
Laminin Sigma L2020 5 - 10 μg/mL
Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma P3655 0.1 mg/mL
Culture media
iPSC culture medium
(Essential 8 Flex medium)		 Gibco A2858501
NGN2 neurons - NGN2 medium
2-mercaptoethanol Gibco 21985023 0.909 mL (50 µM)
B27 supplement Gibco 12587010 10 mL (1%)
DMEM/F-12, GlutaMAX Gibco 31331093 484.75 mL
GlutaMAX Gibco 35050038 5 mL ( 2 mM)
Insulin Sigma I9278 0.25 mL (2.5 µg/mL)
MEM Non-Essential Amino Acids Gibco 11140050 5 mL (0.5%)
N2 supplement Gibco 17502048 5 mL (0.5%)
Neurobasal medium Gibco 21103049 485 mL
mDA neurons - SRM medium
2-mercaptoethanol Gibco 21985023 0.5 mL (55 µM)
GlutaMAX Gibco 35050038 5 mL (2 mM)
Knockout DMEM/F-12 Gibco 12660012 409.5 mL
Knockout serum replacement
(serum replacement)		 Gibco 10828028 75 mL (15%)
MEM Non-Essential Amino Acids Gibco 11140050 5 mL (1%)
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 5 mL (1%)
mDA neurons - N2 medium
B27 supplement Gibco 12587010 10 mL (2%)
GlutaMAX Gibco 35050038 5 mL (2 mM)
N2 supplement Gibco 17502048 5 mL (1%)
Neurobasal medium Gibco 21103049 475 mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 5 mL(1%)
mDA neurons - Differentiation medium
B27 supplement Gibco 12587010 10 mL (2%)
Neurobasal medium Gibco 21103049 485 mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 5 mL (1%)
NGN2 neurons - Supplements
Brain-Derived Neurotrophic Factor
(BDNF)		 Peprotech 450-02 10 ng/mL
CHIR99021 (CHIR) R&D 4423/10 2 μM
Doxycyline (dox) Sigma D9891 2.5 μg/mL
Glial-Derived Neurotrophic Factor
(GDNF)		 Peprotech 450-10 10 ng/mL
L-ascorbic acid 2-phosphate
magnesium (AA2)		 Sigma A8960 64 mg/L
Neurotrophic factor-3 (NT-3) Peprotech 450-10 10 ng/mL
Purmorphamine (PMA) Cayman 10009634 0.5 μM
Puromycin Sigma P8833-10MG 0.5 μg/mL
Thiazovivin Merk Millipore 420220-10MG 2 μM
mDA neurons - Supplements
Brain-Derived Neurotrophic Factor
(BDNF)		 Peprotech 450-02 20 ng/mL
CHIR99021 (CHIR) R&D 4423/10 3 μM
DAPT Cayman 13197 10 µM
Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) Sigma D0627 1 mM
Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b) Peprotech 100-25 100 ng/mL
Glial-Derived Neurotrophic Factor
(GDNF)		 Peprotech 450-10 20 ng/mL
L-ascorbic acid (AA1) Sigma A4403 0.2 mM
LDN193189 (LDN) Cayman 11802 100 nM
Purmorphamine (Purm) Cayman 10009634 2 μM
Sonic Hedgehog/Shh (C24II)
N-Terminus (SHH)		 R&D 1845-SH 100 ng/mL
SB431542 (SB) Cayman 13031 10 μM
Transforming Growth Factor type ß3
(TGFß3)		 R&D 243-B3 1 ng/mL
Y-27632 Cayman 10005583 10 µM
Dissociation reagents
Single cell dissociation reagent
(StemPro Accutase)		 Gibco A1110501 1x
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Gibco 11575020 0.5 mM
RNA isolation and cDNA kit
RNA isolation kit Qiagen 74106 Rneasy MiniKit
RNA lysis buffer Thermo Fisher Scientific 15596018 Trizol lysis buffer (RNA
lysis buffer)
Reverse transcriptase (kit) Thermo Fisher Scientific 18080-085 SuperScript III Reverse
Transcriptase
Software Company Catalog Number Description/Application
Cell Culture Framework (CCF)
(Graphical user interface, GUI)		 Hamilton Robotics Custom-made User interface for the automated system
CellPathFinder software
(image analysis software 1)		 Yokogawa CellPathfinder HCS Software Image analysis tool
CellVoyager Measurement System Yokogawa Included with
CellVoyager 7000		 Microscope controlling
software
Columbus software
(image analysis software 2)		 Perkin Elmer Columbus Image analysis tool
Cloud based qPCR app Thermo Fisher Scientific Themo Fisher cloud Analysis software for
qRT-PCR data
Venus software Hamilton Robotics VENUS Two Dynamic
Schedular 5.1 Software		 Controlling software for the
automated system

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References

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JoVE में इस महीने अंक 162 स्वचालित सेल संस्कृति मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल उच्च थ्रूपुट इमेजिंग न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग कॉर्टिकल और डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स
एकीकृत लाइव-सेल मॉनिटरिंग के साथ मानव प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कॉर्टिकल और डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स का स्वचालित उत्पादन
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Dhingra, A., Täger, J., Bressan, E., Rodriguez-Nieto, S., Bedi, M. S., Bröer, S., Sadikoglou, E., Fernandes, N., Castillo-Lizardo, M., Rizzu, P., Heutink, P. Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring. J. Vis. Exp. (162), e61525, doi:10.3791/61525 (2020).

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