Dit artikel presenteert een methode die volledige beenmergaanhechting en flowcytometriesortering combineert voor het isoleren, cultiveren, sorteren en identificeren van beenmerg mesenchymale stamcellen uit rattenkaken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie en teelt van mandibulaire beenmerg mesenchymale stamcellen bij ratten
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hier presenteren we een efficiënte methode voor het isoleren en cultiveren van mandibulaire beenmerg mesenchymale stamcellen (mBMSC's) in vitro om snel talrijke hoogwaardige cellen te verkrijgen voor experimentele vereisten. mBMSC's kunnen op grote schaal worden gebruikt in therapeutische toepassingen als weefseltechnologiecellen in het geval van craniofaciale ziekten en cranio-maxillofaciale regeneratie in de toekomst vanwege het uitstekende zelfvernieuwingsvermogen en multi-lineage differentiatiepotentieel. Daarom is het belangrijk om mBMSC's in grote aantallen te verkrijgen.
In deze studie werd beenmerg uit de onderkaak gespoeld en werden primaire mBC's geïsoleerd door hele beenmergaanaanhechtingsteelt. Bovendien werden CD29+CD90+CD45− mBC's gezuiverd door fluorescerende celsortering. De tweede generatie gezuiverde mBC's werd gebruikt voor verder onderzoek en toonde potentieel bij het differentiëren in osteoblasten, adipocyten en chondrocyten. Met behulp van dit in vitro model kan men een groot aantal proliferatieve mBC's verkrijgen, wat de studie van de biologische kenmerken, de daaropvolgende reactie op het micromilieu en andere toepassingen van mBMSC's kan vergemakkelijken.
Inleiding
Beenmerg mesenchymale stamcellen (BMSC 's) zijn niet-hematopoëtische stamcellen afgeleid van beenmerg die een sterk proliferatievermogen en multi-lineage differentiatiepotentieel1,2,3,4manifesteren . Bmsc's worden inderdaad beschouwd als een ideale kandidaat voor botweefseltechnologie en regeneratie sinds ze werden ontdekt. Al jaren zijn de iliacale kuif of lange botten zoals het scheenbeen en dijbeen de meest voorkomende bron van BMSC's voor craniofaciale regeneratie. Orofaciale BMSC's, zoals mandibulaire BMSC's (mBMSC's), vertonen echter e....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproefprocedures in dit document werden goedgekeurd door het Animal Care Committee van het Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.
1. Voorbereiding
- Gebruik twee 5 weken oude mannelijke Sprague Dawley ratten voor het experiment.
- Steriliseer alle instrumenten, inclusief naaldhouders, pincet en schaar op hoge temperatuur of ondergedompeld in 75% ethanol gedurende 10 minuten.
OPMERKING: De onderdompeling van ethanol mag niet te lang zijn om celschade te voorkomen. - Bereid cultuurmedia vooraf voor, waarvan de samenstelling is opgenomen in tabel 1....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van dit protocol hechtte een groot deel van de cellen zich aan de plaat op de derde dag na de eerste kweek. Meestal bereikte de celconfluentie na nog eens 3-4 dagen cultuur 70 tot 80% (figuur 1B). Bij fluorescerende celsortering werden DAPI-CD29+CD90+CD45− mBMSC's gezuiverd18,22, wat goed was voor ongeveer 81,1% in de P0-cellen (figuur 1C).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft een methode om BMSC's in vitro te isoleren van rattenmankaken door volledige beenmergaantrouwing en fluorescerende celsortering te combineren, wat een eenvoudige en betrouwbare manier is om proliferatieve mBC's met een sterk differentiatievermogen te verkrijgen. Deze methode zou mBC's voorlopig kunnen zuiveren door celsortering, maar als er hogere eisen zijn aan celhomogeniteit, kunnen nauwkeurigere zuiveringsmethoden nodig zijn.
Momenteel zijn er vier hoofdtechnieken d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Dankbetuigingen
We danken voor de hulp van Laboratory for Digitized Stomatology and Research Center for Craniofacial Anomalies of Shanghai Ninth People's Hospital. Het werk van dit manuscript wordt ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, het SHIPM-mu fonds van Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], het Incentive Project of High-level Innovation Team for Shanghai Jiao Tong University. En L.J. is een geleerde van de Outstanding Youth Medical Talents, Shanghai "Rising Stars of ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.25% Trypsin-EDTA(1X) | Gibco | 25200072 | |
| 10cm kweekschaal | Corning | ||
| acutenaculum | |||
| Adipogene differentiatie medium | Cyagen biosciences inc. | MUBMX-90031 | |
| Alcian Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Alizarin rood | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alkalische Fosfatase Kleur Ontwikkelings Kit | Beyotime Biotechnology | C3206 | |
| alpha-Minimum essentieel medium | GE Healthcare HyClone Cell Cultuur | SH30265.01B | |
| Anti -CollageenII Konijn pAb | Abcam | ab34712 | |
| Antilichamen tegen CD16/CD32 | |||
| Antifade Montage Medium met DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131 | |
| APC anti-muis/rat CD29 Antilichaam | biolegend inc | 102215 | |
| Bioveiligheidskast | Esco | AC2-4S8-CN | |
| CD45 Monoklonaal Antilichaam (OX1), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0461-82 | |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoklonaal Antilichaam (HIS51), FITC, eBioscience | Invitrogen | 11-0900-85 | |
| Centrifuge | cence | L500 | |
| Chondrogene differentiatie medium | cyagen biosciences inc. | ||
| Confocale laserscanningmicroscoop | Zeiss | LSM880 | |
| Countess II FL Geautomatiseerde Celteller | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Kristal Violet Kleurstofoplossing | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| Foetaal Rundserum | GE Healthcare HyClone Cell Cultuur | SH30084.03 | |
| Geit Anti-Konijn IgG H&L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 | |
| Incubator | Esco | CCL-170B-8 | |
| Omgekeerd microscoop | olympus | CKX53 | |
| Magzol reagens(Trizol reagens) | Magen | ||
| micropipettor | Eppendorf | ||
| Oil Red O | |||
| Osteogene differentiatie medium | cyagen biosciences inc. | MUBMX-90021 | |
| Penicilline-Streptomycine | Gibco | 15070063 | |
| Fosfaatgebufferde saline(1X) | Gibco | 20012027 | |
| PrimeScript RT Master Kit | TakaRa Bio Inc | RR036A | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| QuickBlock Blocking Buffer | Beyotime Biotechnology | P0260 | |
| schaar | |||
| SYBR1 Premix | TakaRa Bio Inc | ||
| Toluidine Blauw | Beyotime Biotechnology | ||
| Trypan Blauw Oplossing, 0.4% | Gibco | 15250061 |
Referenties
- Jin, C., et al. Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).
- Chu, D. T., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
