Summary
Les planaires d’eau douce présentent trois démarches (glisse, péristalse et scrunching) qui se distinguent par l’analyse comportementale quantitative. Nous décrivons une méthode pour induire le scrunching utilisant divers stimuli nocifs, quantification de celui-ci, et la distinction du péristaltisme et de la glisse. En utilisant le knockdown de gène, nous démontrons la spécificité du scrunching comme lecture phénotypique quantitative.
Abstract
Les planaires d’eau douce glissent normalement en douceur à travers la propulsion ciliaire sur leur côté ventral. Certaines conditions environnementales, cependant, peuvent induire des formes de locomotion axées sur la musculature : péristalse ou scrunching. Tandis que le péristaltisme résulte d’un défaut ciliaire, le scrunching est indépendant de la fonction de cils et est une réponse spécifique à certains stimuli, y compris l’amputation, la température nocive, le pH extrême, et l’éthanol. Ainsi, ces deux démarches musculature-conduites sont mécanistement distinctes. Cependant, ils peuvent être difficiles à distinguer qualitativement. Ici, nous fournissons un protocole pour induire scrunching en utilisant divers stimuli physiques et chimiques. Nous détaillons la caractérisation quantitative du scrunching, qui peut être utilisé pour le distinguer du péristaltisme et du glissement, en utilisant des logiciels librement disponibles. Étant donné que le scrunching est une démarche planaire universelle, bien qu’avec des différences spécifiques aux espèces caractéristiques, ce protocole peut être largement appliqué à toutes les espèces de planaires, lorsqu’il s’agit de prendre des considérations appropriées. Pour le démontrer, nous comparons la réponse des deux espèces planaires les plus populaires utilisées dans la recherche comportementale, Dugesia japonica et Schmidtea mediterranea, au même ensemble de stimuli physiques et chimiques. En outre, la spécificité du scrunching permet à ce protocole d’être utilisé en conjonction avec l’interférence de l’ARN et /ou l’exposition pharmacologique pour disséquer les cibles moléculaires et les circuits neuronaux impliqués, fournissant potentiellement un aperçu mécaniste dans les aspects importants de la nociception et de la communication neuromusculaire.
Introduction
En plus de leur popularité pour les cellules souches et la recherche de régénération1,2,3, planaires d’eau douce ont longtemps été utilisés dans les études comportementales4,5, en profitant de leur taille relativement grande (quelques millimètres de longueur), la facilité et le faible coût de l’entretien de laboratoire, et un large spectre de comportements observables. L’introduction de la vision par ordinateur et du suivi automatisé aux études de comportement planaire6,7,8,9,10,11 ont permis la différenciation quantitative des phénotypes comportementaux. Le comportement animal est une lecture directe de la fonction neuronale. Parce que le système nerveux planaire est de taille moyenne et la complexité, mais partage les éléments clés conservés avec le cerveau vertébré12,13,14, l’étude du comportement planaire peut fournir un aperçu des mécanismes conservés de l’action neuronale qui peut être difficile à sonder directement dans les organismes plus complexes. Ainsi, les planaires sont un modèle précieux pour les études comparatives de neurobiologie8,12,15,16,17,18,19,20,21. En outre, l’environnement aquatique permet une exposition rapide et facile aux produits chimiques pour étudier leur effet sur le fonctionnement du cerveau chez les planaires régénérants et adultes, ce qui en fait un système populaire pour la neurotoxicologie22,23,24,25,26.
Les planaires possèdent trois démarches distinctes, appelées glisse, péristalse et scrunching. Chaque démarche est exposée dans des circonstances spécifiques : le glissement est la démarche par défaut, le péristaltisme se produit lorsque la fonction ciliaire est compromise7,27, et le scrunching est une démarche d’évasion – indépendamment de la fonction de cils – en réponse à certains stimuli nocifs7. Nous avons montré que le scrunching est une réponse spécifique, provoquée par la sensation de certains indices chimiques ou physiques, y compris les températures extrêmes ou le pH, les blessures mécaniques, ou des inducteurs chimiques spécifiques, et n’est donc pas une réponse générale de stress7,28,29.
En raison de sa spécificité et de ses paramètres stéréotypés, qui peuvent facilement être quantifiés à l’aide de ce protocole, le scrunching est un phénotype comportemental puissant qui permet aux chercheurs d’effectuer des études mécanistes disséquant les voies sensorielles et le contrôle neuronal du comportement25,28. En outre, le scrunching s’est avéré être un critère d’évaluation sensible aux effets chimiques indésirables de l’essai sur le développement du système nerveux et la fonction dans les études de neurotoxicologie22,24,25,30. Comme plusieurs voies sensorielles différentes semblent converger pour induire scrunching à travers divers mécanismes28, scrunching diffère des autres comportements planaires parce que divers, mais spécifiques, stimuli peuvent être utilisés pour disséquer des circuits neuronaux distincts et d’étudier comment différents signaux sont intégrés pour produire le phénotype scrunching.
Fait important, il existe des différences d’espèces, dans lesquelles un produit chimique peut provoquer des scrunching dans une espèce planaire, mais une réponse comportementale différente dans une autre. Par exemple, nous avons constaté que l’anandamide induit scrunching dans l’espèce planaire Dugesia japonica mais induit le péristaltisme dans Schmidtea mediterranea28. Cet exemple souligne l’importance de pouvoir distinguer de manière fiable les différentes démarches, parce qu’elles sont les manifestations phénotypiques de mécanismes moléculaires distincts. Cependant, la distinction entre le scrunching du péristaltisme est difficile à l’aide de données d’observation qualitatives, parce que les deux démarches sont axées sur la musculature et partagent des similitudes qualitatives7,28. Ainsi, pour distinguer les démarches, il est nécessaire d’effectuer l’imagerie cilia ou une étude comportementale quantitative, qui permet la distinction basée sur les paramètres caractéristiques7,28. Parce que l’imagerie par cils est expérimentalement difficile et nécessite un équipement spécialisé comme un microscope composé à grossissement élevé et une caméra à grande vitesse7,28, il n’est pas aussi largement accessible aux chercheurs que l’analyse comportementale quantitative.
Ici, nous présentons un protocole pour (1) l’induction de scrunching en utilisant divers stimuli physiques (température nocive, amputation, lumière quasi-UV) et chimiques (allol isothiocyanate (AITC), stimuli cinnamaldéhyde) et (2) l’analyse quantitative du comportement planaire à l’aide de logiciels librement disponibles. En quantifiant quatre paramètres (fréquence des oscillations de longueur du corps, vitesse relative, amplitude maximale, et asymétrie de l’élongation et de la contraction du corps)7,le scrunching peut être différencié de la glisse, du péristaltisme, et d’autres états comportementaux rapportés dans la littérature, tels que la locomotionde serpent-comme 15 ou les épilepsies15. En outre, tandis que le scrunching est conservé entre les différentes espèces planaires7, chaque espèce a sa propre fréquence caractéristique et la vitesse; par conséquent, une fois que les vitesses de glisse et de scrunching d’une espèce ont été déterminées, la vitesse seule peut être utilisée comme un moyen de distinguer le scrunching de la glisse et du péristalse29. Le protocole suppose qu’aucune formation préalable en analyse d’image computationnelle ou en études comportementales et peut donc également être appliqué pour des expériences comportementales planaires dans un contexte de laboratoire d’enseignement au premier cycle. Des exemples de données pour faciliter l’adaptation du protocole sont fournies dans le matériel supplémentaire.
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Protocol
1. Essais quantitatifs de comportement planaire
- Configuration expérimentale
- Placez un panneau LED dimmable sur une surface plane. Le panneau LED sert à deux fins : (1) fournir un fond blanc uniforme et (2) être utilisé comme source lumineuse réglable pour obtenir un contraste approprié. Placez une arène de 100 mm de plat Petri sur le panneau LED.
REMARQUE : Pour augmenter le débit, une plaque multi puits peut être utilisée comme arène23,24,mais les grandes arènes facilitent l’analyse automatisée de l’image. - Montez une caméra sur un anneau au-dessus de l’arène (Figure 1A). Ajuster la position de la caméra, la hauteur et la mise au point au besoin afin que toute l’arène soit centrée dans le champ de vision et soit au point de mire (figure 1B).
REMARQUE : La résolution de la caméra doit être suffisamment élevée pour distinguer clairement un planaire du fond homogène fourni par le panneau LED. - Remplissez l’aréna avec les milieux d’exposition appropriés (eau planaire ou solution chimique) à un volume demi-maximum (ce qu’on appellera un bain). Cela correspond à environ 25 mL pour une boîte de Pétri de 100 mm. Allumez le panneau LED et éteignez toutes les autres sources lumineuses qui peuvent nuire à la qualité de l’enregistrement (c.-à-d. les sources lumineuses à proximité qui produisent un éblouissement sur l’arène).
ATTENTION : Gérez les solutions chimiques dangereuses de manière appropriée en portant un équipement de protection individuelle complet (EPI) et en déplaçant la configuration expérimentale vers une hotte de fumée si nécessaire. Suivez les règlements fédéraux et étatiques sur l’élimination des déchets. - Déposez un planaire vers le centre de l’arène à l’aide d’une pipette de transfert. Commencez l’enregistrement. Enregistrer les données sous forme de séquences d’images dans un format Fidji31 natif (TIFF, GIF, JPEG, PNG, DICOM, BMP, PGM ou FITS; voir la section d’analyse d’image 1.2).
REMARQUE : Étant donné que les comportements et la sensibilité aux stimuli externes varient d’un planaire à l’autre, il est important de recueillir des données sur un nombre suffisamment élevé de répliques biologiques, en plus d’effectuer des répliques techniques. Nous avons travaillé avec jusqu’à 10 planaires de taille moyenne (4-7 mm) dans une boîte de Pétri de 100 mm à la fois. Bien que le temps efficace, les planaires multiples dans la boîte de Pétri à la fois rendre l’analyse des données plus difficile puisque les planaires peuvent se croiser.- Pour les expériences de glisse, enregistrez à l’aide d’au moins 1 image par seconde (FPS). Pour les expériences de scrunching/péristalse, enregistrez à l’aide d’un FPS qui est au moins deux fois la fréquence de scrunching/péristalse de l’espèce planaire. Si l’espèce planaire a une fréquence inconnue de scrunching/péristalse, utilisez 10 FPS comme point de départ et augmentez/diminuez selon le cas.
- Lors de l’utilisation d’une solution chimique, transférer le planaire en utilisant le moins de gouttes d’eau planaire que possible afin que la concentration de la solution chimique ne soit pas modifiée de façon significative.
- Pour les expériences de glisse, enregistrez 1-2 minutes de comportement de glisse. Pour les expériences de scrunching/péristalse, enregistrez assez longtemps pour capturer au moins 3 oscillations consécutives se produisant en ligne droite. Une fois l’expérience terminée, terminez l’enregistrement.
REMARQUE : Pour les expériences de scrunching/péristalse, si un planarien ne satisfait pas au critère de terminaison dans un délai fixe qui doit être cohérent entre les répliques et est déterminé empiriquement en fonction du stimulus, terminez l’enregistrement et testez un autre planaire.- Si le planaire atteint la limite de l’aréna sans satisfaire au critère de résiliation, pipette le planaire de retour au centre de l’arène.
REMARQUE : Évitez le pipetage répété d’un individu pour l’enregistrement, car cela peut changer son comportement.
- Si le planaire atteint la limite de l’aréna sans satisfaire au critère de résiliation, pipette le planaire de retour au centre de l’arène.
- Retirez le ou les planaires de l’aréna et jetez l’eau planaire ou la solution chimique dans les contenants de déchets appropriés. Les planaires qui étaient dans l’eau planaire peuvent être retournés à leur conteneur à la maison.
REMARQUE : Évitez la contamination croisée en utilisant différents arénas pour différents milieux (c.-à-d. que les expériences de glisse dans l’eau planaire ne doivent pas être menées dans un aréna précédemment utilisé pour des expériences de scrunching/péristalse avec exposition chimique).- Rincez en série les planaires exposés à une solution chimique dans 3 plats petri propres de 100 mm remplis de 25 mL d’eau planaire pour diluer complètement tous les produits chimiques. Si le scrunching ou le péristalse a été induit, placez ces planaires dans un récipient séparé. Les planaires peuvent être retournés à leur conteneur à la maison après un mois puisque la plupart des cellules se seraient retournées à cemoment-là 1.
REMARQUE : Si plusieurs expériences différentes sont nécessaires pour la même population de planaires, par exemple pour une population de l’RNAi, permettez aux planaires de récupérer pendant 24 heures avant d’exécuter la prochaine expérience. Commandez les expériences de telle sorte que l’expérience la moins invasive est la première et l’expérience la plus invasive (p. ex., amputation) est menée en dernier. - Si vous exécutez plusieurs expériences dans la même arène, disposer correctement de la solution de bain et enlever les traces de mucus en essuyant l’arène avec une serviette en papier entre les pistes.
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
- Rincez en série les planaires exposés à une solution chimique dans 3 plats petri propres de 100 mm remplis de 25 mL d’eau planaire pour diluer complètement tous les produits chimiques. Si le scrunching ou le péristalse a été induit, placez ces planaires dans un récipient séparé. Les planaires peuvent être retournés à leur conteneur à la maison après un mois puisque la plupart des cellules se seraient retournées à cemoment-là 1.
- Placez un panneau LED dimmable sur une surface plane. Le panneau LED sert à deux fins : (1) fournir un fond blanc uniforme et (2) être utilisé comme source lumineuse réglable pour obtenir un contraste approprié. Placez une arène de 100 mm de plat Petri sur le panneau LED.
- Analyse quantitative du comportement planaire
- Effectuez des tests de comportement planaires tels que décrits à la section 1.1.
- Ouvrez la séquence d’image brute pour une expérience à Fidji (Fichier > Importer > Séquence d’images) et sélectionnez la première image de la séquence d’images. Dans la fenêtre Options de séquence, activez la case « Trier les noms numériquement » et cliquez sur « OK ». Une fois la séquence d’image chargée, convertissez la séquence d’image en 8 bits (Image > Type > 8 bits) et utilisez l’outil de flèche ou le curseur en bas de la pile d’images pour regarder ou parcourir la séquence d’image.
REMARQUE : Pour les expériences de glisse, toutes les données peuvent être utilisées aussi longtemps que le planaire peut être clairement vu tout au long de l’enregistrement. Cependant, il suffit généralement d’analyser le mouvement libre au centre de l’arène en extrayant les parties pertinentes telles que décrites ci-dessous. - Pour extraire une période de temps et une région d’intérêt, dessiner une région d’intérêt englobant le chemin complet d’un planaire à l’aide de l’outil rectangle (Figure 2A, 2B). Cliquez avec le bouton droit sur la pile d’images et sélectionnez Duplicate..., cochez la case pour Duplicate stack, entrez les premières et dernières images de la séquence d’intérêt, puis cliquez sur OK. Si plusieurs planaires ont été photographiés simultanément, répétez cette étape de sélection et de duplication de la région pour chaque planaire dans l’arène afin qu’il y ait autant de piles d’images ouvertes qu’il y a de planaires dans l’arène. Les étapes suivantes (étapes 1.2.4-1.2.10) doivent être effectuées sur chaque pile d’images, une à la fois.
- Pour les expériences de glisse, extraire une période de glisse où le planaire se déplace au moins deux fois sa longueur de corps.
REMARQUE : Plus les données de glisse sont extraites par planaire, plus les données seront fiables. Le planaire n’a pas besoin de se déplacer en ligne droite pour l’analyse de glisse. - Pour les expériences de scrunching/péristalse, extraire une instance où le planaire subit un minimum de trois oscillations corporelles consécutives (idéalement plus) en ligne droite, en s’assurant que chaque oscillation est un cycle complet d’élongation-contraction, car des oscillations complètes sont nécessaires pour déterminer avec précision la fréquence.
REMARQUE : Plus il y aura d’oscillations qui peuvent être extraites, plus les données seront fiables. N’utilisez pas de séquences où le planaire tourne, car ceux-ci entraîneront des mesures de longueur inexactes.
- Pour les expériences de glisse, extraire une période de glisse où le planaire se déplace au moins deux fois sa longueur de corps.
- Appliquez un seuil à la pile d’images dupliquées (Image > Ajuster > Seuil) pour binariser l’image et extraire le planaire de l’arrière-plan. Ajuster les barres coulissantes au besoin de sorte que l’ensemble du planaire soit mis en évidence en rouge. Les valeurs exactes dépendent de la qualité de l’imagerie. Laissez les cases pour l’arrière-plan sombre, Empilez l’histogrammeet ne réinitialisez pas la plage non cochée. Faites défiler la pile d’images pour assurer une bonne plage de seuil (c.-à-d. que le planaire est bien séparé de l’arrière-plan dans toute la pile), puis cliquez sur Appliquer.
- Dans la fenêtre Convertir la pile en binaire, définissez la méthode par défaut et l’arrière-plan sur la lumière. Décochez toutes les cases de cette fenêtre, puis cliquez sur OK. Une image binariée montrant un planaire noir sur fond blanc apparaîtra (Figure 2C). Assurez-vous que l’ensemble du planaire est visible dans tous les cadres de la séquence d’image.
REMARQUE : Les objets indésirables de la séquence d’image binarisée qui sont plus petits ou plus grands que le planaire peuvent être filtrés dans l’analyse suivante à l’aide d’un filtre de taille (Figure 2Ciii). - Définissez des mesures en cliquant sur Analyser > Définir les mesures. Cochez les cases pour Area, Center of Mass, Stack position, et Fit ellipse et cliquez sur OK.
REMARQUE : Ces paramètres ne doivent être réglés qu’une fois par session aux Fidji. - Sélectionnez la pile d’images ouverte et sélectionnez Analyser > Analyser les particules.
- Dans la fenêtre Analyser les particules, sélectionnez Afficher > Masques pour ouvrir une nouvelle pile montrant tous les objets détectés avec les paramètres choisis. Cela peut être utilisé pour vérifier visuellement que seules les mesures du planaire sont prises. Un filtre de taille peut être défini à cette étape pour éliminer le bruit indésirable en entrant la zone approximative du planaire (en pixel2 unités) dans l’espace fourni. Cochez les cases pour afficher les résultats et effacer les résultats, puis cliquez sur OK.
REMARQUE : Dans la fenêtre Résultats, si l’index (première colonne) n’égale pas le nombre de tranches pour toutes les lignes, cela signifie que trop ou trop peu d’objets ont été suivis. Une possibilité pour cet écart est la présence d’autres objets en dehors du planaire ou que le planaire n’a pas été suivi dans des cadres spécifiques. - Traversez la pile d’images du masque à l’aide du curseur en bas du panneau. S’il y a du bruit ou s’il y a des cadres qui n’ont pas de planaire, fermez la fenêtre Résultats et la pile d’images de masque. Répétez les étapes 1.2.7-1.2.8 en ajustant le filtre de zone pour supprimer uniquement les objets autres que le planaire.
REMARQUE : Si le planaire est absent du cadre du masque, cela suggère que la limite inférieure du filtre de zone a été trop haute. - Dans la fenêtre Résultats, enregistrez les données à l’aide de File>Save As. Ajoutez l’extension .csv au nom de fichier pour enregistrer les données en tant que valeurs séparées par virgule. Une fois que les données de la pile d’images sont enregistrées, fermez la pile d’images respective et les fenêtres Résultats et Masque.
- Importer des données et analyser davantage à l’aide de n’importe quel logiciel de feuille de calcul ou freeware. Pour calculer la vitesse de glisse, reportez-vous à la section 1.3. Pour calculer l’ensemble complet de paramètres scrunching/peristalsis, reportez-vous à la section 1.4.
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. - Pour déterminer le pixel à la conversion de longueur réelle, ouvrez une image aux Fidji avec une longueur de référence (par exemple, le diamètre de l’arène). Sélectionnez l’outil de ligne et tracez une ligne sur la longueur connue.
- Convertir les unités de pixels en une unité de longueur standard en cliquant sur Analyser > Définir l’échelle. Entrez la longueur correspondant à la ligne tracée sur l’image dans la zone distance connue et changez l’unité de longueur du pixel à l’unité de longueur standard choisie. Le facteur de conversion est écrit à côté de l’échelle.
REMARQUE : Une valeur de conversion de pixels n’est pas requise pour les analyses de glisse ou de scrunching/peristalsis dans les sections 1.3 et 1.4.
- Calcul de la vitesse de glisse
- À l’aide du fichier de données enregistré dans la section 1.2, chargez le centre des coordonnées de masse (COM) x et y et les données de l’axe principal. Si les données sont enregistrées en tant que fichier de valeurs séparés par virgule, ces listes correspondent respectivement aux colonnes « XM », « YM » et « Major ».
- Calculez le déplacement (d) du centre planaire de masse en pixels pour chaque image par rapport au cadre suivant à l’aide des colonnes de données « XM » et « YM ». Le déplacement d) est donné par:
oùles coordonnées com (XM, YM) d’un cadre et x2 et y2 se réfèrent aux coordonnées COM (XM, YM) du cadre suivant. - Définissez la longueur du corps planaire comme le 95e percentile de la colonne « major ». Puisque les planaires présentent un comportement de préférence de mur32, ceci assure que la longueur calculée de corps planaire est représentative du moment où le planaire est allongé24.
- Normaliser le déplacement par longueur du corps planaire en divisant les déplacements de pixels par image par la longueur du corps planaire (l). Le déplacement normalisé (dn) est donné par:
- Générer une liste de vitesses normalisées en divisant les déplacements normalisés par le temps écoulé par image (inverse du FPS enregistré). La vitesse de glisse normalisée (sn) est donnée par:
- Calculer la vitesse de glisse normalisée du planaire en prenant la moyenne de la liste des vitesses normalisées (sn). L’écart type peut être utilisé comme mesure de l’incertitude pour le planaire.
- Répétez les étapes 1.3.1-1.3.6 pour chaque planaire à analyser. Moyenne et prendre l’écart type des vitesses de glisse pour tous les planaires pour obtenir la vitesse de glisse et l’incertitude associée, respectivement, pour une population planaire.
- Distinction des démarches de scrunching et de péristalse à l’aide de l’ensemble complet de paramètres
- Chargez la liste de données de l’axe principal à partir du fichier de données enregistré à partir de la section 1.2. Si les données sont enregistrées en tant que fichier de valeurs séparés par virgule, cela correspond à la colonne Major.
- Créez une liste qui numérote chaque point de données dans la colonne Major, en commençant par 0. Convertissez cette liste en temps écoulé par image en divisant par le FPS enregistré.
- Tracez les données de la colonne principale en ce qui concerne le temps écoulé pour générer une parcelle d’oscillation scrunching/peristalsis (Figure 3A). À l’aide de la parcelle d’oscillation, réduire les données à au moins trois oscillations consécutives en ligne droite (Figure 3Bi). Couper les données pour commencer et terminer à des pics locaux (élongation maximale de l’oscillation) ou des creux (allongement minimal de l’oscillation).
REMARQUE : Si les extrema locaux ne sont pas à peu près égaux (les pics/creux diffèrent considérablement en hauteur), cela suggère que les oscillations ne sont pas en ligne droite (Figure 3Bii). Extraire une autre séquence d’au moins trois oscillations consécutives en ligne droite. Reportez-vous à la section 1.2. - Confirmez que la séquence d’intérêt d’oscillation a été extraite et coupée correctement en replotant les données principales coupées en ce qui concerne le temps. Utilisez cette liste de données découpée pour tous les calculs ultérieurs.
- Pour calculer la fréquence d’oscillation (νm),divisez le nombre d’oscillations (On) par le nombre total de points de données dans la liste de données de l’axe majeur (N). Multipliez le FPS par cette valeur pour obtenir la fréquence dans les oscillations par seconde.
- Pour calculer l’allongement maximal (|Δε| max), soustraire la longueur minimale absolue du corps (lmin) de la longueur maximale absolue du corps (lmax). Normalisez à la longueur du corps allongée en divisant par la longueur maximale absolue du corps.
- Pour calculer la vitesse par longueur de corps (v*m),multipliez l’élongation maximale calculée par la fréquence d’oscillation.
NOTE : La vitesse seule peut être utilisée pour distinguer entre les démarches de scrunching et de péristalse7. - Pour calculer la fraction du temps passé à allonger (felong), prenez le dérivé de la liste de données de l’axe majeur paré en ce qui concerne le temps. Divisez le nombre de points de données positifs (c.-à-d. lorsque le dérivé est >0 (np), par le nombre total de points de données dans la liste de données de l’axe principal (nt)).
REMARQUE : Les planaires scrunching présentent une fraction asymétrique du temps passé à s’allonger alors que les planaires qui exécutent le péristaltisme passent autant de temps à allonger et à contracter7. - Répétez les étapes 1.4.1-1.4.8 pour chaque planaire à analyser. Calculez un paramètre de population planaire défini en prenant l’écart moyen et standard de chaque paramètre.
REMARQUE : L’ensemble de paramètres peut être utilisé pour déterminer si le comportement d’oscillation est scrunching, péristalse ou une autre forme de locomotion avec des changements périodiques de forme du corps. Le scrunching et le péristalse ont des paramètres fixes pour une espècedonnée 7, avec des paramètres scrunching généralement étant plus grands que les paramètres de péristalse7. Bien qu’il soit possible que l’un des paramètres puisse tomber en dehors de l’aire de répartition spécifique à l’espèce, comme nous l’avons déjà observé avec l’induction chimique28, le comportement observé doit être d’accord avec au moins 3 des 4 paramètres publiés à classer comme péristalse ou scrunching.
2. Induction scrunching
- Stimuli physiques (température nocive, lumière UV, amputation)
- Pour toutes les expériences de stimuli physiques, reportez-vous à la section 1.1 pour la configuration expérimentale.
REMARQUE : Il est préférable d’utiliser une grande arène, comme une boîte de Pétri de 100 mm, pour des expériences de stimuli physiques afin de permettre plus d’espace ouvert pour manœuvrer une pipette et/ou une lame de rasoir. - Pour induire le scrunching par la température nocive, chauffer l’eau planaire dans un bécher en verre (au moins 100 μL par planaire à tester) à 65 °C sur une plaque chauffante.
- Placez un planaire au centre de l’arène. Attendez que le planaire s’oriente debout et commence à glisser. Commencez l’enregistrement.
- À l’aide d’une pipette P-200, pipette lentement 100 μL de l’eau planaire de 65 °C post-pharyngeally sur l’extrémité arrière du planaire pour induire le scrunching.
REMARQUE : Assurez-vous que l’eau planaire chauffée reste à 65°C. Si nécessaire, réchauffer l’eau à 65°C avant de commencer une autre expérience. Puisque la pression peut également induire le scrunching, le pipeting lent est nécessaire. Le canalage de l’eau de température ambiante de la même manière que dans l’expérience peut servir d’option de contrôle et de pratique. - Arrêtez l’enregistrement une fois que le scrunching a cessé. Placez le planaire dans un récipient de récupération et échangez les supports dans la boîte de Pétri avec de l’eau planaire fraîche et de température ambiante si vous exécutez plus d’expériences.
- Pour induire le scrunching par amputation, transférer un planaire au centre de l’arène et attendre que le planaire s’oriente debout et commence à glisser. Commencez l’enregistrement.
- Amputer le planaire à l’aide d’une lame de rasoir propre. Les amputations peuvent être faites n’importe où le long du planaire tant que l’emplacement de coupe est cohérent entre les expériences.
REMARQUE : Les paramètres de scrunching sont extraits de la pièce antérieure. Ainsi, évitez d’obstruer la vue de la caméra de cette partie du planaire lors de l’application de la coupe en s’approchant de l’extrémité postérieure. Les feuillets de couverture en plastique fonctionnent également bien pour la coupe et sont une option plus sûre, en particulier dans un cadre d’enseignement. - Arrêtez l’enregistrement une fois que la pièce antérieure a cessé de scrunching. Retirez les deux morceaux, placez-les dans un récipient séparé et laissez-les se régénérer pendant 7 jours. Les planaires amputés peuvent être réincorporés dans le contenant domestique une fois régénérés.
- Amputer le planaire à l’aide d’une lame de rasoir propre. Les amputations peuvent être faites n’importe où le long du planaire tant que l’emplacement de coupe est cohérent entre les expériences.
- Pour induire le scrunching à l’aide de la lumière quasi-UV, attachez les filtres appropriés (p. ex., filtres Roscolux) à l’objectif de la caméra afin de réduire la quantité de lumière quasi-UV réfléchie recueillie par la caméra et peut interférer avec la réponse du planaire. Au lieu d’utiliser le panneau LED pour éclairer l’arène d’en bas, utilisez l’éclairage rouge ambiant auquel les planaires sont insensibles33.
- Remplissez une arène de 100 mm de plat Petri avec de l’eau planaire et placez un seul planarian (5-9 mm) au centre de l’arène. Commencez l’enregistrement à 10 FPS.
- Tenez un pointeur laser UV de classe II (405 ± 10 nm, puissance de sortie <5 mW) à environ 30 cm de l’arène. Placez le pointeur laser à un angle de 45° du planaire de glisse, puis faites briller le pointeur laser pendant 5-10 secondes à mi-chemin entre l’extrémité postérieure du pharynx et la pointe de la queue pour induire le scrunching.
REMARQUE : La puissance du pointeur laser peut être mesurée à l’aide d’un compteur de puissance proche des UV. - Attendez que le planaire recommence à glisser avant de tenter deux autres stimulations sur la même personne pour tester la reproductibilité de la réaction. Si le planaire continue à afficher le même comportement, arrêtez d’enregistrer et remettez le planaire dans son conteneur. Si le comportement change entre les stimulations, des tests supplémentaires montreront quelle réponse est la plus importante.
REMARQUE : Les planaires peuvent devenir désensibilisés à la lumière quasi-UV et cesseront de réagir. Les stimulations consécutives nécessitent une période de repos de 8-10 secondes.
- Pour toutes les expériences de stimuli physiques, reportez-vous à la section 1.1 pour la configuration expérimentale.
- Stimulus chimique (AITC)
- Pour induire le scrunching à l’aide d’un produit chimique, par exemple, l’agoniste RAITC28trpa1 , les planariens sont idéalement immergés dans un bain du produit chimique. Si nécessaire, le pipetage peut être appliqué comme décrit à la section 2.1.2.3.
ATTENTION : L’AITC est inflammable, extrêmement toxique, peut causer une irritation de la peau et des yeux, une sensibilisation respiratoire et cutanée, et est dangereuse pour la vie aquatique. L’huile d’AITC doit être manipulée dans un capot de fumée. Avant de fabriquer des solutions de stock d’AITC, mettre en PPE approprié (gants de nitrille et une couche de laboratoire) et mettre en place des contenants appropriés d’élimination des déchets solides et liquides dangereux. - Dans un capot de fumée, faire une solution de stock de 10 mM d’AITC dans l’eau planaire dans un tube de centrifugeuse de 50 mL. Cette solution de stock peut être utilisable jusqu’à un mois lorsqu’elle est stockée à 4°C.
- À partir de ce stock, préparer une solution de travail de 25 mL de 100 μM AITC dans l’eau planaire dans un tube de centrifugeuse de 50 mL. Cette solution AITC de 100 μM sera utilisée pour induire le scrunching chez les planaires.
NOTE : 100 μM AITC induit des scrunchings cohérents dans D. japonica et S. mediterranea planarians28. Pour les autres planaires aquatiques, 100 μM peuvent servir de concentration de départ et peuvent être ajustés en conséquence. - Configurer la configuration expérimentale (voir la section 1.1). Remplissez l’arène avec la solution de travail AITC et placez-la dans un conteneur secondaire. Le conteneur secondaire doit contenir au moins deux fois le volume de l’aréna.
REMARQUE : Des expériences peuvent être effectuées à l’intérieur d’une hotte de fumée pour plus de sécurité. - Transférer jusqu’à 10 planaires au centre de l’arène et commencer l’enregistrement.
- Une fois que les planaires deviennent désensibilisés et cessent de scrunching, arrêtez d’enregistrer. Retirez les planaires de la solution AITC et rincez (voir la section 1.1). Éliminer les déchets solides et liquides de l’AITC dans des contenants de déchets appropriés.
- Vérifiez la spécificité de la réponse à l’AITC à l’aide de l’ARNI à TRPA128 en suivant les protocoles standard.
- À partir de ce stock, préparer une solution de travail de 25 mL de 100 μM AITC dans l’eau planaire dans un tube de centrifugeuse de 50 mL. Cette solution AITC de 100 μM sera utilisée pour induire le scrunching chez les planaires.
- Pour induire le scrunching à l’aide d’un produit chimique, par exemple, l’agoniste RAITC28trpa1 , les planariens sont idéalement immergés dans un bain du produit chimique. Si nécessaire, le pipetage peut être appliqué comme décrit à la section 2.1.2.3.
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Representative Results
La perception extraoculaire proche des UV chez les planaires de S. mediterranea dépend de TRPA1 et a été proposée pour être liée à H2O2 version17. Étant donné que l’exposition à H2O2 induit des scrunchings dépendants de trpa1 dans S. mediterranea et D. japonica planarians28, les étapes de la section 2.1.4 peuvent être utilisées pour vérifier si l’exposition à la lumière quasi-UV induit des scrunchings chez les deux espèces. Alors que D. japonica planarians scrunch (10/10) lorsqu’ils sont exposés à la lumière quasi-UV, S. mediterranea planarians présentent soit l’amincissement de la queue (7/10) comme décrit précédemment17 ou aucune réponse (3/10) (Figure 4A,4B). Une quantification des paramètres de scrunching, comme indiqué à la section 1.4, pour les planaires D. japonica qui ont présenté au moins 3 scrunches droites consécutives révèle des paramètres caractéristiques scrunching pour cette espèce7,28 (νm = 0,84 ± 0,14, | Δε- France | max = 0,56 ± 0,06, v*m = 0,47 ± 0,07, et felong = 0,56 ± 0,03, valeurs déclarées comme moyenne ± écart type pour N=7).
En revanche, l’exposition à 250 μM de cinnamaldéhyde, un agoniste trpa1 connu chez les souris34, provoque des scrunching dans S. mediterranea7,28 (νm = 0,46 ± 0,08, | Δε- France | max = 0,36 ± 0,08, v*m = 0,16 ± 0,04, et felong = 0,58 ± 0,04, valeurs déclarées comme moyennes n ± écart type pour N=8) (figure 5A), tandis que D. japonica planarians à la même (et 1,6x la concentration) affichent un mélange de mouvement de serpent et d’oscillatoire, interrompu par des virages de la tête planant et/ou vigoureux (Figure 5A). Une quantification des échantillons (8/24) avec au moins trois oscillations consécutives donne des valeurs significativement inférieures pour 3 sur 4 paramètres que prévu pour le scrunching chez cette espèce (νm = 0,43 ± 0,08, | Δε- France | max = 0,39 ± 0,03, v*m = 0,17 ± 0,02, et f elong = 0,54 ± 0,06, valeurs déclarées comme écart standard moyen ± pour N=8). Ainsi, alors que D. japonica semble scrurnch sur l’exposition au cinnamaldéhyde, une comparaison des paramètres calculés avec les valeurs littéraires pour cette espèce7,28 montre que le mouvement oscillatoire observé n’est pas scrunching. Cet exemple souligne l’importance des mesures quantitatives en conjonction avec une inspection minutieuse des données comportementales brutes pour interpréter correctement les comportements observés.
RNAi confirme la spécificité de scrunching en réponse à l’exposition au cinnamaldéhyde dans S. mediterranea. Dans les 180 secondes suivant l’exposition à 250 μM de cinnamaldéhyde dans l’eau planaire 15/15 unc22 (contrôle) RNAi S. mediterranea planarians scrunched, tandis que 0/16 SmTRPA1 RNAi planarians scrunched (Figure 5B), démontrant que S. mediterranea scrunching in cinnamaldéhyde nécessite SmTR1. Knockdown de SmTRPA1 a été confirmé par une exposition de 60 secondes à un bain AITC de 100 μM28.
Figure 1 : Configuration expérimentale du comportement planaire.
(A) Exemple d’installation expérimentale pour étudier le comportement planaire. (B) 100 mm Petri plat arène centrée dans le champ de vision de la caméra. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Exemples représentatifs de l’analyse d’image des planaires fidjiens dans l’arène.
(A) Région d’intérêt sélectionnée, englobant le chemin planaire complet, indiqué par le rectangle jaune. (B) Exemples de cadres de la région d’intérêt après duplication. (C) Soustraying the planarian from background and noise via thresholding (i) 8-bit image of planarian with noise, noted by the asterisk. iiii) Image binaire du planaire après seuil. iiiiii) Masque de planaire après avoir mis le filtrage par taille pour enlever le bruit. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Tracer la longueur planaire en ce qui concerne le temps.
(A) Parcelle brute de la longueur planaire par rapport au temps pour un s. mediterranea planarian scrunching. L’astérisque désigne un moment où le planaire s’est retourné tout en scrunching. (B) Moyens possibles de couper les données de scrunching. ii) Une parcelle correctement découpée qui supprime les données d’événement de rotation. iiii) Une parcelle mal découpée qui ne supprime pas les données d’événement de rotation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Réponses spécifiques des espèces à la lumière quasi-UV.
(A) Échantillons de cadres de D. japonica scrunching et S. mediterranea amincissement de la queue en réponse à la lumière quasi-UV. (B) Parcelles d’oscillation représentatives de S. mediterranea et D. japonica en réponse à la lumière quasi-UV. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Réponse spécifique des espèces à 250 μM de cinnamaldéhyde, un agoniste trpa1.
(A) Parcelles d’oscillation représentatives pour D. japonica et S. mediterranea planarians dans un bain de cinnamaldéhyde de 250 μM. (B) Parcelles d’oscillation représentatives montrant la perte de scrunching dans 250 μM cinnamaldéhyde dans SmTRPA1 RNAi S. mediterranea planarians. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Matériaux supplémentaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ces documents.
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Discussion
En utilisant ce protocole, on peut étudier quantitativement les effets des stimuli physiques et chimiques7,28,29 ou manipulation génétique (RNAi)28,29 sur la locomotion planaire. Pour maximiser la résolution spatiale, il est préférable de déplacer la caméra aussi près que possible de l’arène tout en s’assurant que l’ensemble de l’arène est dans le champ de vision. Pour augmenter le débit, le comportement des planaires multiples peut être examiné à la fois en enregistrant plusieurs planaires simultanément. Lors du dépistage de plus d’un planaire dans un seul aréna, des régions d’intérêt peuvent être tracées aux Fidji pour isoler les planaires individuels tels que décrits ici ou un suivi multi-objet plus avancé peut être employé. Un problème avec le fait d’avoir plusieurs planaires dans la même arène, c’est qu’ils peuvent se croiser. Ce problème peut être résolu par l’utilisation de plaques multi-puits pour isoler les planaires les uns des autres tout en permettant l’enregistrement simultané de nombreuses personnes pour quantifier le comportement23,24. Toutefois, les planaires passeront relativement plus de temps au mur dans de plus petites arènes, ce qui exigera des ajustements à l’analyse de l’image et limiteront la résolution pour la quantification de la scrunching/peristalsis.
Lorsque des stimuli sont administrés localement (p. ex., pipetage7, amputation7,28, pointeur laser17),il est crucial que les planaires soient constamment stimulés dans la même région parce que stimuler d’autres régions du corps peut potentiellement induire des comportements différents. Différentes méthodes de livraison (telles que le pipetage ou le bain d’un produit chimique) peuvent également affecter la consistance du phénotype comportemental. En outre, les planaires peuvent désensibiliser rapidement28, qui doit être pris en considération lors de la planification d’expériences que les mêmes planariens ne devraient pas être immédiatement réutilisés pour de multiples expériences, soit en utilisant les mêmes stimuli ou différents. Enfin, comme le montre ici l’exposition aux quasi-UV et le cinnamaldéhyde, il est important de savoir que le même stimulus peut induire des comportements distincts chez différentes espèces planaires. D. japonica scrunched lorsqu’il est stimulé avec la lumière presque UV près de la pointe de la queue, tandis que S. mediterranea planarians affiché amincissement de la queue. En revanche, l’exposition au cinnamaldéhyde induit scrunching dans S. mediterranea, mais pas dans D. japonica planarians. Ainsi, tandis que le scrunching est une réponse conservée de diverses espèces planaires aux stimuli nocifs7, il a des paramètres spécifiques aux espèces7,28, sensibilités28, et inducteurs28. Par conséquent, pour une nouvelle espèce pour laquelle le scrunching n’a pas encore été paramétré, il est préférable de commencer par un inducteur bien conservé, comme l’amputation7, pour déterminer les paramètres spécifiques à l’espèce avant de tester la réponse à d’autres stimuli.
Une limitation de l’analyse décrite ici est qu’elle ne tient pas compte des virages et/ou des comportements mixtes, tels que le scrunching intermittent avec des têtes qui se tortillent, glissent ou d’autres changements de forme corporelle. Toutefois, une inspection approfondie des données brutes peut aider à atténuer ces problèmes si ces cas sont exclus manuellement de l’analyse, comme le démontre la figure 3. En outre, il est possible d’ajouter l’analyse de la forme du corps au centre de suivi de masse et de longueur décrit ici et d’élargir le protocole pour quantifier ces autres comportements planaires. Étant donné que l’analyse ne fait pas d’hypothèses sur l’organisme étudié, le protocole pourrait en principe également être appliqué à d’autres organismes qui présentent des types similaires de comportements.
La méthode de quantification des différentes démarches planaires et de distinction de la scrunching du péristaltisme, telle que décrite ici, ne suppose aucune formation préalable en analyse d’image computationnelle ou en études comportementales et ne nécessite pas d’équipement ou de logiciels spécialisés. Pour faciliter l’adaptation du protocole, des données par exemple sont fournies dans le matériel supplémentaire. La facilité d’obtenir et de cultiver des planaires, ainsi que la capacité d’enregistrer des comportements sans équipement spécialisé, rend les études comportementales planaires largement accessibles à la recherche à tous les niveaux, des salles de classe de l’école primaire aux laboratoires universitaires. Une version modifiée de ce protocole a été utilisée avec succès dans un laboratoire d’enseignement qui était principalement composé d’étudiants de première année et de deuxième année et comprenait à la fois des majors potentielles stem et non-STEM.
La combinaison d’outils moléculaires (RNAi) et chimiques avec l’analyse comportementale quantitative, telle que décrite dans ce protocole, permet aux chercheurs d’obtenir des informations mécanistes sur le contrôle moléculaire du comportement. Ces travaux ont mis au jour certains des principaux médiateurs et circuits neuronaux impliqués dans planarian glisse19,20, phototaxis17,35,36, thermotaxis9,37, et scrunching9,28,29. Bien que les comportements planaires peuvent ne pas avoir de comportements corollaires directs chez les organismes supérieurs, tels que les humains, ces comportements représentent des fonctions neuronales fondamentales importantes pour tous les organismes - la capacité de détecter et de traiter des stimuli spécifiques et de réagir de manière appropriée. En raison de la conservation des fonctions neuronales clés à travers différents organismes, les études mécanistes chez les planaires peuvent nous enseigner plus largement sur le contrôle neuronal du comportement. En outre, l’analyse du comportement planaire en réponse à l’exposition chimique peut être utilisée pour étudier les effets du produit chimique sur le système nerveux planaire23,24,25, qui peut éclairer sur les risques potentiels pour le cerveau humain. En particulier, le scrunching induit par la chaleur nocive s’est avéré être un critère d’évaluation sensible et spécifique pour l’analyse de la neurotoxicité, parce qu’il devient perturbé par l’exposition à certaines classes de produits chimiques22,24,25,30. Enfin, les capacités régénératrices uniques du planaire permettent aux chercheurs de disséquer la dynamique de la façon dont les différents comportements sont restaurés pendant la neurorégénération.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient M. Tapan Goel pour les commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été financé par NSF CAREER Grant 1555109.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
| Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
| Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
| Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
| Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
| Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
| Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
| Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
| Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| Thermometer | VWR | 89095-600 | |
| UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |
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