Dynamische meting en beeldvorming van haarvaten, slagaders en pericyten in muishart
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd om de coronaire microcirculatie in levend murinehartweefsel te bestuderen door ex vivo monitoring van de arteriële perfusiedruk en -stroom die de druk handhaaft, evenals vasculaire boomcomponenten, waaronder de capillaire bedden en pericyten, omdat de septale slagader wordt ingeblikt en onder druk staat.
Abstract
Coronaire arteriële toon samen met het openen of sluiten van de haarvaten bepalen grotendeels de bloedtoevoer naar cardiomyocyten bij constante perfusiedruk. Het is echter moeilijk om de dynamische veranderingen van de kransslagaders en de haarvaten in het hele hart te volgen, voornamelijk vanwege de beweging en non-stop kloppen. Hier beschrijven we een methode die monitoring van arteriële perfusiesnelheid, druk en de diameterveranderingen van de slagaders en haarvaten in de rechterventrikel papillaire spieren van de muis mogelijk maakt. De muizentussenslagader wordt ingeblikt en doordrenkt met een constante stroom of druk met de andere dynamisch gemeten. Na perfusie met een fluorescerend gelabeld spreekgestoelte (bijv. Alexa Fluor-488 of -633 gelabeld Tarwe-Germ Agglutinine, WGA), konden de slagaders en haarvaten (en andere vaten) in de rechterventrikel papillaire spier en septum gemakkelijk worden gebeeldmerkt. De veranderingen in de diameter van het vat kunnen dan worden gemeten in de aan- of afwezigheid van hartcontracties. Wanneer genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten werden uitgedrukt, konden specifieke kenmerken worden gecontroleerd. Pericyten werden bijvoorbeeld gevisualiseerd in muisharten die NG2-DsRed uitdrukten. Deze methode heeft een nuttig platform geboden om de fysiologische functies van capillaire pericyten in het hart te bestuderen. Het is ook geschikt voor het bestuderen van het effect van reagentia op de bloedstroom in het hart door de vasculaire / capillaire diameter en de arteriële luminale druk tegelijkertijd te meten. Dit preparaat, gecombineerd met een state-of-the-art optisch beeldvormingssysteem, stelt men in staat om de bloedstroom en de controle ervan op cellulair en moleculair niveau in het hart te bestuderen onder bijna fysiologische omstandigheden.
Introduction
Een passende coronaire drukstroomregulatie zorgt voor voldoende bloedtoevoer naar het hart om aan zijn metabolische eisen te voldoen1. Het is echter pas onlangs duidelijk geworden hoe coronaire drukstroom dynamisch wordt gereguleerd in het hart, ondanks uitgebreide studies die de afgelopen decennia in vivo en in vitro zijn uitgevoerd. Een van de redenen is de moeilijkheid om een fysiologisch werkmodel voor dergelijke studies vast te stellen vanwege het constante kloppen van het hart. Hoe dan ook, er zijn verschillende methoden vastgesteld voor de observatie van de coronaire microvaten in levende weefsels of dieren, maar geen van deze methoden was in staat om tegelijkertijd een constante/stabiele focus en de metingen van de druk, stroming en microvasculaire diameter te bereiken2,3. De directe visualisatie van coronaire arteriële microvaten in kloppend hart werd decennia geleden geïntroduceerd4,3, maar de diametermetingen in kleine vaten waren uitdagend en de specifieke functies van de vele gespecialiseerde celtypen geassocieerd met de microcirculatie waren even vervelend. Zelfs de stroboscopische methode en het drijvende objectieve systeem konden bovenstaande informatie niet tegelijkertijd verstrekken5. Niettemin is een aanzienlijke hoeveelheid waardevolle informatie verkregen met behulp van de bovengenoemde technologieën, die ons hebben geholpen meer te begrijpen over de regulering van coronaire bloedstroom6. De methode die we in dit artikel beschrijven, zal iemand helpen om in detail te onderzoeken en te begrijpen hoe componenten van kransslagaders, de slagaders en de microvasculatuur anders reageren op stimulaties en metabole eisen.
Het werkmodel dat we hebben opgesteld om deze studies voort te zetten, is gebaseerd op het eerdere werk van Westerhof et al.2. Na cannulatie van de septale slagader van het muizenhart werd fysiologische zoutoplossing gebruikt om die slagader te doordrenken om de myocyten en andere componenten van het hartweefsel gevoed te houden. De arteriële perfusiedruk, de stroom en de vasculaire diameter werden onder andere fysiologische functies gecontroleerd met behulp van geschikte fluorescerende indicatoren. Deze methode stelt ons in staat om het coronaire microvasculaire bed onder fysiologische druk in levend weefsel te visualiseren en de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan microcirculatieregulatie voor het eerst te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In het huidige werk hebben we een opmerkelijk eenvoudige maar zeer praktische ex vivo-methode geïntroduceerd om de coronaire microcirculatie in het hart onder fysiologische omstandigheden te bestuderen. Deze methode werd gewijzigd uit mechanisch onderzoek met behulp van ratten2. De uitdagende toevoeging was de beeldvormingstechnologie met hoge snelheid en hoge optische resolutie. We konden daarom profiteren van de geavanceerde optische beeldvormingssystemen die nu commercieel beschikbaar zijn. Do…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd mede ondersteund door het Center for Biomedical Engineering and Technology (BioMET); NIH (1U01HL116321) en (1R01HL142290) en de American Heart Association 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).
Materials
| 1 M CaCl2 solution | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Custom glass tubing | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Dissecting microscope | Olympus, Japan | SZX12 | |
| Endothelin-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Inline solution Heater | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isoflurane | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
| Micropipette/cannula holder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC transgenic mouse | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Nylon thread for tying blood vessels | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Pressure Servo Controller | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Scissors | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Temperature controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
References
- Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).
- Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart. Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).
- Tillmanns, H., et al. Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle. Circulation Research. 34, 561-569 (1974).
- Martini, J., Honig, C. R. Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply. Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).
- Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques. Circulation Research. 49, 342-353 (1981).
- Marcus, M. L., et al. Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level. Circulation. 82, 1-7 (1990).
- Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation. Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).
- Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries. Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).
- Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).
- Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion. Circulation. 89, 2412-2420 (1994).
- Lawton, P. F., et al. a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology. Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).
