Summary
דו"ח טכני זה מתאר וריאציה של טכניקת Bergström שונה לביופסיה של השרירים tibialis הקדמי המגביל את נזק סיבים.
Abstract
המאפיינים המכניים של סיבי השלד מתכווץ הם אינדיקטורים מכריעים של בריאות השריר הכוללת, פונקציה, וביצועים. ביופסיות שריר השלד האנושי נאספות לעתים קרובות עבור מאמצים אלה. עם זאת, תיאורים טכניים מעטים יחסית של הליכי ביופסיה, מחוץ לחלל העצום הידוע בדרך כלל, זמינים. למרות טכניקות ביופסיה מותאמים לעתים קרובות כדי להתאים את המאפיינים של כל שריר תחת מחקר, דוחות טכניים מעטים לשתף שינויים אלה לקהילה הגדולה. לכן, רקמת שריר ממשתתפים אנושיים מבוזבזת לעתים קרובות כמו המפעיל ממציא מחדש את הגלגל. הרחבת החומר הזמין על ביופסיות ממגוון רחב של שרירים יכול להפחית את האירוע של ביופסיות כושלות. דו"ח טכני זה מתאר וריאציה של טכניקת Bergström שונה על הקדמי השרירים tibialis המגביל את נזק סיבים ומספק אורכי סיבים מתאימים להערכה מכנית. הניתוח הוא הליך אשפוז שניתן להשלים כך גם בעוד שעה. תקופת ההחלמה של הליך זה היא מיידית לפעילות קלה (כלומר, הליכה), עד שלושה ימים לצורך חידוש פעילות גופנית רגילה, וכשבוע לטיפול בפצעים. הרקמה שחולצו יכולה לשמש לניסויים בכוח מכני וכאן אנו מציגים נתוני הפעלה מייצגים. פרוטוקול זה מתאים לרוב מטרות האיסוף, הניתן להתאמה פוטנציאלית לשרירי השלד האחרים, ועשוי להיות משופר על-ידי שינויים במחט האיסוף.
Introduction
המחקר של פיזיולוגיה שריר אנושי למטרות קליניות או מחקר לעתים קרובות דורש ביופסיות שרירים. לדוגמה, אתגר מרכזי בפיזיולוגיה שרירים אנושיים וביומכניקה הוא להבחין ולהבין את ההתאמות השונות של ביצועי שרירים להתאמן. התאמות ביצועים אינן כוללות רק התאמות מבניות (למשל, שינויים בחלבונים מתכוובים, ארכיטקטורת שרירים) אלאגם כוללים התאמות עצביות 1, שקשה מאוד, אם לא בלתי אפשרי, להעריך בנפרד בעת בדיקה ללא פגע בשרירים האנושיים situ. ניסויים ברמת הסיבים מסירים רכיבים אלה בסדר גבוה יותר ומאפשרים הערכה ישירה יותר של התכווצות שרירים ותוכלים לאסוף אותם באמצעות טכניקות ביופסיה. ביופסיות שרירים נאספו מאז לפחות 18682. כיום, הטכניקה הדומיננטית לאיסוף ביופסיות שרירים היא טכניקת Bergströmשונה 3,4,5 ,למרות טכניקותאחרות זמינות כולל השימוש של Weil-Blakesley conchotome6 או מה שנקראמחט עדינה 7,8. כל הטכניקות האלה משתמשות בכלים מיוחדים כמו מחט שנועדו לעבור לשריר ולחתוך חתיכת רקמה. באופן ספציפי, טכניקת Bergström שונה משתמשת מחט שונה גדול (5 מ"מ גודל מחט כאן; איור 1) שיש לו חלון קרוב לקצה המחט וtrocar פנימי קטן יותר שזז למעלה ומטה המחט, חיתוך השריר בעת מעבר על חלון המחט. בתוך הטרוקאר הזה הוא נגח שזז למעלה ומטה הפיר של trocar ודוחף את הביופסיה לכיוון חלון המחט. כדי למשוך את השריר לתוך חלון המחט, צינור יניקה מחובר, אשר שואב אוויר מהמחט וממשוך את השריר לתוך חלון המחט באמצעות לחץ שלילי.
ביופסיות שריר נרכשות לעתים קרובות כדי ללמוד שינויים בתוכן חלבון, ביטוי גנים, או מורפולוגיה הנגרמת על ידי מחלה או בתגובהלתוכנית פעילות גופנית 1,9,10,11. שימוש קריטי נוסף עבור ביופסיות שרירים הוא ניסויים מכניים כגון מדידה של כוח כיווץ סיבים, נוקשות סיבי שריר, ומאפייני שריר תלויי היסטוריה12,13,14,15,16. סיבים בודדים או סיבים מכניקה נמדדים על ידי חיבור סיבים בין מנוע אורך ומתמר כוח על אסדות מיוחדות לשלוט אורך סיבים ובו זמנית מדידת כוח. על ידי חריצות (למשל, skinning) סיבים, קרום סרקומה הופך חדיר כימיקלים בתמיסת האמבטיה, המאפשר שליטה הפעלה על ידי ריכוז סידן משתנה. יתר על כן, ההשפעה של תכונות כיווץ על כימיקלים / תרופות / חלבונים אחרים ניתן בקלות להעריך על ידי הוספת reagent המדובר לפתרון האמבטיה. עם זאת, בעוד טכניקה זו משמשת מאוד במודלים אחרים של בעלי חיים, באופן ניכר פחות מחקרים ערכו בדיקות מכניות על סיבים עורים 17,18,19. אחת הסיבות לכך היא כי כלים ביופסיה ונהלים נועדו להסיר כמה שיותר רקמת שריר עם פחות התייחסות לרמה של נזק מבני שנגרם במהלך הפקת רקמות. אכן, פרוטוקול ביופסיה האחרונה מציע לנהוג מחט הביופסיה לתוך השריר ולאסוף 2-4 נתחים של שריר3. התהליך עצמו אינו פוגע בחומר ה-DNA או החלבון, אך לעתים קרובות הורס סיבים ומבנים סרקומריים באופן כזה שהפעלת סיבי שריר הופכת לבלתי יציבה או בלתי אפשרית. יתר על כן, האורך היחסי של סיבים בתוך הביופסיה הם בדרך כלל קצרים (<2 מ"מ) ולא מטופלים בקלות לבדיקות מכניות. לבדיקות מכניות, הסיבים האידיאליים ארוכים (3-5 מ"מ) ולא פגומים מבחינה מבנית.
טכניקות מתקדמות יותר להפקת רקמות יכולות לשמש להגבלת נזק לסיבים. לדוגמה, קבוצהאחת 20 ניצלה את "ניתוחים פתוחים" שתוכננו קודם לכן של זרועות (למשל, תיקון שבר עצם), שבו השרירים נחשפו באופן מלא ומנתח הצליח לדמיין את מבנה השריר ולנתח בזהירות דגימות גדולות יחסית ולא ניזוקו מבחינה מבנית של רקמת שריר (15 מ"מ x 5 מ"מ x 5 מ"מ). טכניקת "ביופסיה פתוחה" זו מועדפת כאשר המשתתפים עוברים הליך שתוכנן מראש, ולכן מגבילה את מאגר המשתתפים הפוטנציאליים, במיוחד עבור מבוגרים בריאים, שבהם לא היו מתרחשים ניתוחים בדרך אחרת. לכן, ביופסיות רבות שנערכו למטרות מחקר נעשות כהליך אשפוז ואתר החתך נשמר קטן ככל האפשר כדי להגביל את הסיכון לזיהום, הצטלקות, וזמן ריפוי. לכן, רוב הביופסיות נאספות באופן עיוור (כלומר, המפעיל אינו יכול לראות את מחט האיסוף כפי שהוא עובר דרך fascia לתוך השריר). זה מרמז על כך שאיכות הביופסיה מבוססת כמעט לחלוטין על המיומנות והניסיון של המפעיל. לכל שריר יש קשיים משלו בעת איסוף רקמות, כגון סיכונים להפר את העצבים וכלי הדם, בחירת עומק אוסף אידיאלי ומיקום, ולהחליט על מיקום הגוף המתאים כדי לשמור על השריר רפוי ככל האפשר. למרבה הצער, רוב הכישורים ספציפיים לשרירים אינם כתובים ולכן כל רופא חייב "להמציא מחדש את הגלגל" בעת ביצוע ביופסיות על השרירים החדשים להם. חוסר ניסיון זה מוביל בדרך כלל מספר אוספים באיכות נמוכה עד הרופא מזהה את שיטות העבודה הטובות ביותר עבור ביופסיות על שריר זה. רופאים מתחילים לעתים קרובות ללמוד את המיומנות באמצעות שיחות עם עמיתיהם המנוסים יותר, אבל יחסית מעט אינפורמטיבי וטקסטים ביקורת עמיתים קיימים בנושא, במיוחד עבור שרירים שאינם משמשים באופן מסורתי עבור איסוף ביופסיה. אם נשקול את המידע הנ"ל, יחד עם הקושי לגייס מתנדבים אנושיים לביופסיות, ברור שיש צורך במידע לימודי נוסף שממקסם את סיכויי ההצלחה של כל משתתף.
לכן, מטרת מאמר זה הייתה להציג טכניקת ביופסיה שריר המספק פרוטוקולים לאוסף מוצלח של ביופסיות שרירים עם ארוך, שברי סיבים לא ניזמים לבדיקות מכניות. ביופסיות שרירים אנושיות מתבצעות בדרך כלל על, ואת החלק הארי של חומר אימון ביופסיה הוא על, השרירים vastus lateralis. גודל השריר הגדול יחסית שלו ומיקומו הפשטי יחסית לעור מאפשר איסוף של רקמת שריר נאותה, תוך מזעור אי נוחות המטופלוטראומה פיזית 1,21. עם זאת, יש כמה מגבלות לשימוש בvass lateralis ללימודי אימון אורכי. לדוגמה, במהלך פרוטוקולים ניסיוניים הכוללים תוכנית אימונים, על המשתתפים להימנע מהכשרה נוספת מחוץ למחקר לתקופה המשתרעת לעתים קרובות על פני 2-6 חודשים. עבור ספורטאים, זה לעתים קרובות לא אפשרי, כמו lateralis vastus הוא בדרך כלל מאומן במהלך תרגילים טיפוסיים (למשל, סקוואט, קופץ), או משמש בדרך כלל עבור הספורט (למשל, ריצה, רכיבה על אופניים). חוויות אימון נפרדות אלה הרחק ממטרת המחקר יכולות לגרום להתאמות שרירים שמשנות את מכניקת השרירים, הארכיטקטורה והפיזיולוגיה באופן כזה שקשה או בלתי אפשרי לדעת את ההשפעה האמיתית של הפרוטוקול הניסיוני של המחקר על תכונות שרירים. עבור סוגים אלה של מחקרים, זה יהיה אידיאלי לבחור שריר היעד כי הוא לעתים קרובות לא המוקד של גדודי אימון. השרירים השוקיאליים הקדמיים (ת"א) הוא שריר יעד אידיאלי העונה על הדרישות לעיל. בנוסף, ניתן למקד התערבויות אימון כלפי ת"א באמצעות גישות הניתנות לשליטה, כגון שימוש בדינומטר. אין כמעט חומר אימון הנוגע לביופסיה של השריר של ת"א. לכן, פיתחנו פרוטוקול שונה לאיסוף ביופסיות שרירים שלא ניזתם באופן יחסי מת"א.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: להלן, אנו מתארים פרוטוקול לקצירת סיבים לא ניזמים מכנית מת"א של מתנדבים שנרשמו למחקר מתמשך נפרד. פרוטוקול זה דומה לזה שתואר על ידי Shanely et al.3, שתיארו את טכניקת Bergström שונה בvasstrus lateralis. המידע המוצג כאן כבר מעודן על ידי קבוצת המחקר שלנו, אבל לא יכול להיות אידיאלי עבור כל קבוצות המעבדה או הגדרות ארגוניות. אנו נותנים רק הנחיות, ולהציע בתוקף כי מעבדות חדשות אוסף ביופסיה להתייעץ עם קבוצות מעבדה מנוסות לפני ניסיון כל ניסויים בבני אדם.
כל המחקרים שנערכו בנייר זה אושרו על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה למדעי הספורט באוניברסיטת רוהר בוכום. המשתתפים נתנו הסכמה מושכלת בכתב חינם לפני השתתפות במחקר.
1. הכנה ניסיונית
- הערכת קריטריונים של הדרה בעת נטילת ההיסטוריה הרפואית המפורטת של המשתתף במהלך הייעוץ של המשתתף (ראה להלן).
- לא לכלול את המשתתפים אם הם סבלו מפציעה בשריר היעד במהלך 6 השבועות שקדמו לביופסיה. ודא המשתתפים הם בדרך כלל בריאים, מודעים ללא הפרעות שריר או קרישה, והם לא נוטלים כרגע תרופות הגורמים לדילול דם (למשל, אספירין).
הערה: כאן בחרנו משתתפים שהיו פעילים במתינות והורו להם להימנע מתרגילי רגליים אינטנסיביים או לא רגילים לפחות 3 ימים לפני הביופסיה. עם זאת, עבור שאלות מחקר אחרות, קריטריונים אלה עשויים להשתנות.
- לא לכלול את המשתתפים אם הם סבלו מפציעה בשריר היעד במהלך 6 השבועות שקדמו לביופסיה. ודא המשתתפים הם בדרך כלל בריאים, מודעים ללא הפרעות שריר או קרישה, והם לא נוטלים כרגע תרופות הגורמים לדילול דם (למשל, אספירין).
- לדבוק עיקור וטכניקות aseptic, כפי מוסדר על ידי החוק הגרמני ופרקטיקה נפוצה בפיקוח על ידירופא הקבוצה 22,23. הליך זה יכול לנוהל לעתים קרובות כהליך "ליד המיטה" או בסוויטה כירורגית אשפוז. יש להתייעץ עם הגוף הרגולטורי המקומי לקבלת הדרכה.
- לחבר את צוות הביופסיה. אנו מציעים כי צוות הביופסיה כולל 4 אנשים. רופא (או אדם מיומן באוסף ביופסיה), עוזר רפואי אחד שעובד עם הרופא, עוזר אחד שמנטר ומתקשר עם המשתתף, ועוזר אחד שמטפל בביופסיית השריר מיד לאחר החילוץ. עם מספרים אלה, טיפול מהיר בחולים יכול להינתן אם מתרחש מצב חירום רפואי במהלך ההליך. אם נוח עם ההליך, אז הצוות יכול להיות עשוי משני אנשים בלבד: הרופא והעוזרת הרפואית, אשר יחד לקחת על טיפול בחולים ועיבוד רקמות בו זמנית.
- רוצה שהמשתתף ייפגש עם ההונוה/רופא של הפרוייקט כדי לסקור, לדון ולחתום על טופס הסכמת המשתמש. יש לי לקחת היסטוריה רפואית מפורטת (אלרגיות, פציעות או ניתוחים לגפה התחתונה ולת"א) ואל תכלול את המשתתף אם הוא עומד באחד מקריטריוני ההחרגה. לדון ביסודיות בהיגיינת התאוששות וחתך.
- הסבירו למשתתף כי הם יהיו כואבים אך יוכלו להסתובב מיד לאחר ההליך; הליכה במורד מדרונות או מדרגות היא לעתים קרובות לא נוח במשך 48 השעות הראשונות, עם פעילות מלאה בדרך כלל חוזר אחרי 72 שעות. לבסוף, להסביר כי, כדי להגביל את הזיהום ושפשופים מכניים, אתר החתך צריך להישאר חבוש לפחות 1 שבוע ותשמור נקי.
2. לדמיין את השוקה הקדמית עם אולטרסאונד במצב B
- הנחה את המשתתף לשכב בתנוחת עליונות נוחה ולהרגיע את שרירי הרגליים ככל האפשר. השתמש במכשיר מותאם אישית (ראה להלן) או שהעוזר יחזיק את הקרסול בתנוחה מעט דורסיפלקסית כדי לחקות את מה שנעשה במהלך הביופסיה.
הערה: חשוב כי המשתתף יש ת"א רגוע, כך שהוא משכפל את מאפייני השריר במהלך ההליך. במהלך הבדיקה, בקשו מהמשתתפים להתכווץ ולהריע את השריר כך שניתן יהיה ל ציין את השינויים בארכיטקטורת השרירים. - השתמשו בבדיקה אולטרסאונד כדי לדמיין את התאים שטחיים ועמוקים של ת"א, כדי לסקור את ארכיטקטורת השריר ולהחליט על עומק הכניסה וזווית המחט של התקפה (איור 2A-B). ציין ציוני דרך על העור.
- לתת תשומת לב מיוחדת לבחירה של אזור היעד הימנעות ורידים ראשיים, עורקים, או עצבים.
- להעריך את חתך הרוחב של השריר, במטרה לזהות את הפנורוזיס המרכזי בתוך בטן השריר של ת"א (כשליש מהרגל, דיסטל עד הברך, ו-2 ס"מ לרוחב של ציצהשל השוקה) (איור 2B). להקליט את המיקום ואת העומק של aponeurosis המרכזי (בדרך כלל 1.5-3 ס"מ) כך שניתן לנקוט טיפול כדי לא לנהוג את האוסף (Bergström) מחט בעבר נקודה זו.
- מקם את גשושית אולטרסאונד בכיוון פרוקסימלי-דיסטל מעל מיקום היעד ולדמיין את הפניה fascicle ועובי שריר(איור 2A). השתמש במידע זה כדי לסייע בהצלחה לנהוג (עיוור) מחט האוסף לתוך בטן השריר. שמור תמונות של אתר היעד בשני המטוסים לעיון עתידי במהלך ההליך הכירורגי.
- עם מידע זה, צור תוכנית לתנועת מחט לכיוון אזור היעד.
- מתכנן להפוך את החתך 1-3 ס"מ distal אזור ביופסיה היעד. לאחר המחט מועברת לתוך השריר, לסובב את המחט לזווית ~ 45% לעור לאורך הציר הארוך של האיבר, ולאחר מכן מונע פרוקסימלית לכיוון אזור הביופסיה. אסטרטגיה זו מגבילה את הסיכוי לנהוג את המחט לתוך aponeurosis המרכזי, אם המחט נדחפת קשה מדי. יתר על כן, המחט יכולה להיות מונעת באופן לא יציב או פרוקסימטלי, בהתאם לידיים של מפעיל המחט.
3. הליך ביופסיה
- הנחה את המשתתף להניח על שולחן הניתוחים ולהניח את שרירי הרגליים. ודא שקו הראייה של המשתתף באתר הביופסיה חסום על ידי וילון.
- הסר מתח פסיבי מבטן השריר על-ידי הצבת איבר המשתתף במכשיר המתקן את הקרסול לתנוחה מעט דורסיפלקסית (0-5° מנייטרלי; איור 3). שאל את המטופל אם הם עדיין יכולים להרגיע את השריר שלהם, כמו יותר מדי dorsiflexion עלול לעשות את זה קשה להירגע.
הערה: מצאנו כי איסוף ביופסיות מכף רגל דורסיפלקסית, לא יותר מ-5° של נייטרלי (כלומר, סוליית כף הרגל בניצב לשוק) מייצר ביופסיות עקביות וגדולות יותר מזוויות קרסול מכופפות יותר. ההתקן ששומר על הקרסול הוא מכשיר מותאם אישית. עם זאת, כל מספר של (זול) התקנים יכול להיות מפוברק שעדיין לייצר את התוצאה הרצויה.
- הסר מתח פסיבי מבטן השריר על-ידי הצבת איבר המשתתף במכשיר המתקן את הקרסול לתנוחה מעט דורסיפלקסית (0-5° מנייטרלי; איור 3). שאל את המטופל אם הם עדיין יכולים להרגיע את השריר שלהם, כמו יותר מדי dorsiflexion עלול לעשות את זה קשה להירגע.
- לגלח, לנקות ולחטא את אזור החתך שנבחר, לפי שיטות עבודה סטנדרטיות24.
הערה: האזור ה"נקי" של המשתתף הוא כ-20 ס"מ פרוקסימלי-דיסטל ו-10 ס"מ-רוחב של אתר החתך המוצע. עם זאת, יש להתייעץ תמיד עם התקנות של המוסד ו/או הלאומי (אם בכלל) בנושא זה. פרוטוקול החיטוי כולל קרצוף העור נקי ולאחר מכן חיטוי ארבע פעמים עם שימוש ליברלי בתרסיס חיטוי ברמה רפואית. אם המשתתף עוזב את הטבלה מסיבה כלשהי, יש להפעיל מחדש את פרוטוקול החיטוי. - לתת הזרקה על-פשיסטית של 1.5 סמ"ק של 2% Xylocitin עם אפינפרין באתר הביופסיה, אשר מתפקד כמרדים מקומי ו- vasoconstrictor. המתן לזמן ההשפעה המוקצב של ~ 20-30 דקות.
הערה: תרופות אלה הן מיוטוקסיות ולכן אסור להזריק לתוך השריר, רק רק את הרקמה התת עורית. כתגובה להתכוונויות כלי הדם, האזור של אתר ההזרקה עשוי להפוך ללבן (בגווני עור בהירים יותר) או אפור (גווני עור כהים יותר). - אשר אפקט סמים עם זריקות עור וחטטנים עדינים עם אזמל סטרילי.
- באתר הביופסיה שסומן קודם לכן, לעשות חתך פרוקסימלי-דיסטלי 1 ס"מ עם אזמל סטרילי שחותך את העור fascia, חושף את הבטן שריר. הקפד לחתוך את fascia באופן מלא כי המחט היא בוטה ולא יעבור דרך fascia.
- לדחוף את מחט הביופסיה 0.5-1.0 ס"מ לתוך השריר עם אוריינטציהניצבת לעור (איור 2C, 2E).
הערה: המפעיל ירגיש שינוי במתח הדרוש כדי להניע את המחט דרך סוגי הרקמות השונים. רקמת השומן קלה, fascia הוא הקשה ביותר, והשריר הוא באמצע (אבל יכול להיות משתנה, בהתבסס על המשתתף). - כוון את המחט למיקום של זווית של כ-45° לעור, לאורך הציר הארוךשל הרגל (איור 2D, 2F). לדחוף את המחט עוד 1-2 ס"מ לתוך השריר עד קצה המחט הוא במיקום היעד בתוך השריר.
הערה: הרופא צריך לנצל את תמונות אולטרסאונד שמורות כדי להסביר וריאציה בודדת של ממדי שריר. בגלל החתך הוא רק גדול מספיק כדי להכניס את המחט, הרופא מניע את המחט עיוור דרך העור. יש "תחושה" שמפעיל הביופסיה מרוויח עם ניסיון. טירון חייב ללמוד את המיומנות ממפעיל ביופסיה מיומן (עוד על זה בדיון). - לחבר את מזרק 100 מ"ל וצינור מחט ביופסיה(איור 1G). להחיל יניקה על מחט Bergström על ידי משיכת הבוכנה של המזרק על ידי כ 15-20 מ"ל כדי לייצר לחץ שלילי במחט ומוצץ את רקמת השריר לתוך חלון המחט. לאחר מכן, לסלק את השריר על ידי דחיפה מהירה(es) של trocar מעל חלון המחט.
הערה: לפני ובמהלך יניקה, זה לפעמים מועיל לשים לחץ קל על העור מיד מעל חלון המחט כדי לעזור לדחוף את השריר לתוך המחט. - בעדינות להסיר את המחט מהרגל, מסתובב לאט. צריכה להיות התנגדות קלה רק בעת חילוץ המחט. אם יש התנגדות נוספת, זה עשוי להצביע על חתך ביופסיה חלקית. זה קורה, להחזיר את הצורך למיקום היעד, ולפתות מחדש איסוף רקמות.
- לדחוף את הרקמה לחוץ לכיוון חלון המחט באמצעות ramrod הפנימי.
- בזהירות להסיר את הדגימה מהמחט.
הערה: שקוע המחט לתוך פתרון איסוף (ראה סעיף הכנת סיבים) לעתים קרובות מפרק את הביופסיה מהמחט. בנוסף, המזרק יכול לשמש כדי לנהוג אוויר דרך המחט ולדחוף את המדגם. טכניקות אלה להסיר את הצורך לגעת פיזית בביופסיה עם פינצטה ומפחית את האפשרות של נזק. אם כלים, ידיים (עם כפפות או לא) או פתרונות לא סטריליים באים במגע עם המחט, המחט לא יכולה לשמש המשך במהלך ההליך. לכן, אם יש צורך בביופסיה מיידית שנייה, אז יש להשתמש במחט סטרילית חדשה. זה קורה לעתים קרובות, אז זה תרגול הטוב ביותר כדי לשמור על כמה מחטים סטריליות במילואים. - זהה את הרקמה כשריר ולא שומן או רקמת חיבור. רקמת שריר מזוהה בקלות מרקמות אחרות בגלל הצבע האדום העמוק שלה(איור 4A). לפעמים, הרקמה שנאספו אינה שריר, אלא רקמת שומן או חיבור.
- אם נאספת כמות מספקת של רקמת שריר, המשך בפרוטוקול. אם אין מספיק שרירים, נסה שוב את הביופסיה.
- אם יש צורך בביופסיה שנייה, עקבו בקפידה אחר המשתתף, כאשר דחיפה שנייה של מחט גורמת למשתתף להרגיש לא בנוח יותר מהקודם.
- לשטוף דגימות שרירים באופן מיידי בתמיסת איסוף ולהתכונן לניסויים סיבים בודדים (ראה טיפול ביופסיית שריר ואחסון).
- יש עוזר מנוסה לבדוק את איכות המדגם (ראה להלן) ולהעריך את הצורך לבצע ביופסיה שנייה. עוזר נפרד לוקח את הביופסיה לעיבוד, בעוד שאר הצוות ממשיך עם המשתתף.
- סגור את אתר החתך.
- סגור את פצע החתך עם קלטת לוקוסטר סטרילית. השתמש בפיסה אחת או יותר כדי להצטרף לקצוות של אתר החתך על-ידי הנחתם בניצב לציר הארוך של החתך, ולאחר מכן הנח רצועות נוספות בתבנית בעלת צורה של כוכבים כדי להגן מפני טעינה רב-כיוונית.
הערה: טיפול נכון בשלב זה יפחית את הצלקות. תפירת הפצע יכולה להיעשות אבל אין צורך. אפשרויות אחרות כוללות דבק פצע. - מקום הלבשה פצע סטרילי (למשל, Leucomed T פלוס) מעל אתר החתך כדי להגן מפני זיהום.
- עטפו את הרגל בתחבושות אלסטיות מקובדות (לדוגמה, Unihaft) כדי להגביל את הדימום הראשוני ולהגן מפני פגיעה מכנית חיצונית.
- עטו את הרגל בתחבושות דחיסה קרילסטיות כדי למנוע דימום ולהגן על התחבושות העמוקות יותר מפני התרופפות או השמדתן.
- סגור את פצע החתך עם קלטת לוקוסטר סטרילית. השתמש בפיסה אחת או יותר כדי להצטרף לקצוות של אתר החתך על-ידי הנחתם בניצב לציר הארוך של החתך, ולאחר מכן הנח רצועות נוספות בתבנית בעלת צורה של כוכבים כדי להגן מפני טעינה רב-כיוונית.
4. טיפול לאחר ביופסיה
- בקשו מהמשתתפים להסתובב מיד לאחר ההליך. יהיה כאב מקומי. הנחה את המשתתף ללכת כרגיל ככל האפשר.
- הנחה את המשתתף לא להסיר את התחבושות או לאפשר למים להשרות את התחבושות. יש לשמור אותם לפחות: יום אחד לתחבושת הקרילסטית, שלושה ימים לתחבושת האלסטית המגושבת, ושבעה ימים לתחבושת הפצע. הודע למשתתף שניתן לחבוש אותו מחדש במידת הצורך.
- התאם את הטיפול שלאחר הביופסיה של משתתף לצרכים של הפרט. יש עוזר או רופא מיומן להעריך את המשתתף ולהכין תכנית טיפול מתאימה לאחר ביופסיה. להליך זה, אנו מציעים כי כל עוד בדיקות נוירו-שריריות של ת"א מופרדות על ידי לפחות שבוע מן הביופסיה.
5. טיפול ביופסיה שריר ואחסון
- לאחר הפקת רקמות, מיד למקם את הרקמה לתוך בקבוקון 5 מ"ל המכיל פתרון איסוף קשיחות (ב mM: Tris (50), KCl (2), NaCl (100), MgCl2 (2), EGTA (1), טבלית מעכב פרוטאז (1), pH 7.0) ולנער קלות במשך 4-6 דקות כדי לשטוף את הדם.
- החליפו את פתרון הקשיחות בהקפדה טרייה, לנער קלות במשך 4-6 דקות ולאחר מכן לאחסן ב 4 °C עבור 4-6 שעות כדי לאפשר חילופי תמיסת אחסון מעכבי פרוטאז ודם.
- פתרון קשיחות Exchange עבור קשיחות לילה (ב mM: Tris (50), KCl (2), NaCl (100), MgCl2 (2), EGTA (1), מחשב מעכב פרוטאז (1), 50:50 גליצרול, pH 7.0), ולאחסן ב 4 ° C עבור 12-18 שעות.
- החלף קשיחות לילה עבור 50:50 הקשיות איסוף: גליצרול ומאוחסן ב -20 °C עבור עד 3 חודשים, או שנה אחת במקפיא -80 ° C.
הערה: תהליך זה מחלחל קרום הסיבים המאפשר תוספת ידנית של סידן לתוך ומחוץ לתא. תהליך זה לוקח זמן והוא יכול להיות שונה בין שרירים ומינים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההתחייבות הזמן כולו למשתתף היה כשעה אחת (10 דקות ייעוץ, 10 דקות אולטרסאונד, 20 דקות הכנה לניתוח ומינהל הרדמה, 10 דקות ניתוח, ו 10 דקות התאוששות). לעתים קרובות, המשתתפים הפעילו באופן לא מודע את ת"א שלהם ונזקקו לתזכורות עקביות כדי לשמור על השריר רגוע ככל האפשר. כאשר מחט הביופסיה הייתה בתוך השריר, המשתתפים דיווחו בדרך כלל על תחושה ייחודית "לחץ" באזור סביב מחט הביופסיה, עם תקופות מזדמנות של אי נוחות בינונית עד אינטנסיבית. פעם אחת, ההונות של המשתתף התכווצו מעט במהלך ההליך, אבל מיד הפסיק לאחר הסרת המחט. גדלי ביופסיה היו בדרך כלל ~ 50-100 מ"ג (מסה רטובה). תגובות המשתתפים להליך היו לעתים קרובות בלתי צפויות. לעתים, המשתתף ציפה להיות מושפע במהלך ההליך, אבל אז הראה סימנים של התעלפות, בעוד אחרים היו עצבניים אבל לגמרי לא המום במהלך ההליך. לפיכך, מצאנו את זה להיות תרגול טוב כדי לשמור על המשתתף עסוק עם שיחה או לתת להם להשתמש בטלפון הנייד שלהם, כך מלוא תשומת הלב שלהם לא התמקדה בהליך המתמשך. העוזר ששוחח עם המשתתף גם עקב אחריהם אחר סימני מצוקה, כאב או התעלפות. לפעמים, ביופסיה הכילה רק שומן או רקמת חיבור (מזוהה על ידי צבע לבן חיוור של הרקמה, איור 4A). במקרים אלה, ביופסיה שנייה נלקחה מיד (לאחר אישור ניתנה על ידי המשתתף). בדרך כלל, ביופסיה מוצלחת תניב >80% רקמת שריר(איור 4A).
לאחר הניתוח, רוב המשתתפים הרגישו אי נוחות לאחר ההליך משך 3-5 ימים. המשתתפים דיווחו כי כאב ת"א דומה למה שצפוי לאחר יום של טיולים תלולים. אין להפעיל לחץ מכני באתר החתך לפחות 5 ימים, או שהוא יכול להיפתח מחדש. המשתתפים נותרו בדרך כלל עם צלקת קטנה, אבל לא ראינו שינויים מוגבהים או חריגים אחרים בעור. כמו כן, אף אחד מהמשתתפים לא פיתח זיהומים.
הביופסיות היו חרובות (כלומר, עור) בתמיסת גליטרול (1:1 תערובת של גליטרול: פתרון קשיחות) במשך 6 שבועות ולאחר מכן מוכן לבדיקות מכניות ביום הניסויים. חירוש Glycerol של סיבים מאפשר את דיפוזיה של תמיסת האמבטיה לתוך הסיבים, אשר נותן את בקרת ההפעלה של החוקר וגם מספק שדרה לחשוף את השריר לתרופות או כימיקלים אחרים. יתר על כן, גליקרול פונקציות כסוכן נגד הקפאה, המאפשר לשריר להיות במקום בטמפרטורות קרות לאחסון לטווח ארוך, עם נזק מוגבל. עם זאת, יש צורך זמן מה כדי לאפשר גליצטרול לחדור את הדגימות, ולכן בתחילה אחסון דגימות ביופסיה לילה ב 4 מעלות צלזיוס (אידיאלי על צלחת שייק) הוא זהיר. ניתן לאחסן את השרירים רק זמן רב עד שתפקודם ייפגע. ההדרכה הכללית בנושא היא כי השרירים ישמרו על תפקודם בתוך פתרון גליצרול לפחות 3 חודשים במקפיא -20 ° C, או שנה אחת במקפיא -80 °C.
דגימות שרירים היו חזותית תחת מיקרוסקופ פירוק. חלק מחתיכות השריר היו קטנות אופגומות (איור 4B)והוסרו. לאחר מכן, קבוצות של סיבים הוערכו עבור כל נזק מבני (סרקומה סיבים שבורים חזותית או כתוש, איור 4C). מתוך חבילות אלה, חבילות סיבים קטנים יותר של 3-10 סיבים נותחו והונחו בזהירות לתוך התא הניסיוני של אסדת הבדיקההמכנית (איור 4D). אורכי סיבים שנויים מבחינה מבנית היו בדרך כלל 3-5 מ"מ אורך. מחט Bergström היה חלון אוסף של 7 מ"מ, כך הביופסיה יכול רק להניב ~ 7 מ"מ סיבים ארוכים. לכן, הסיבים לשימוש מבני שאספנו היו כמעט ככל האפשר. בדרך כלל, אנו מכינים 5-10 סיבים צרור לכל 50 מ"ג של (שנאספו) רקמה. פרטים מלאים של הליכים אלה ניתן למצואבמקום אחר 14,15,25. כדי להפגין עמידות של הסיבים, אנו מציגים נתונים מייצגים של פרוטוקול מכני פשוט באמצעות חבילות סיבים TA גליקט(איור 5). 40 חבילות סיבים מהביופסיות של 10 משתתפים הופעלובתמיסת הפעלה 26 (גבוה [Ca2+], pCa < 4.2) ב 2.7 μm sarcomere אורך במשך 60 שניות ומתח פעיל במצב יציב נמדד כמו 100.71 ± 11 mNמ"מ -2 (אומר ± SEM).
איור 1: מחט ברגסטרום. מחט Bergström בשימוש במחקר זה מורכב המחט עצמה(A-F), צינור יניקה (G), ומזרק (F). מחט Bergström מורכב מחט החוצה(A)כי יש חלון קרוב לקצה המחט, trocar פנימי חלול קטן יותר (ב) כי נע למעלה ומטה המחט וחותך את השריר בעת עובר את חלון המחט, ומוט (C) כי נע למעלה או מטה trochanter כדי לעזור להסיר את השריר מהמחט. חלקים אלה מופרדים על ידי מכונת כביסה(D)שעושה את המחט אטומה, ו- spacer(E)בין המוט לוטרוקאר מגן מפני ריסוק ביופסיית השריר. לבסוף, מחובר מתאם צינור יניקה. כדי למשוך את השריר לתוך חלון המחט, צינור יניקה (G) מחובר מתאם מחט ומזרק. זה שואב את האוויר מהמחט וממשוך את השריר לתוך חלון המחט באמצעות לחץ שלילי, המאפשר איסוף מדגם. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הדמיית אולטרסאונד ומיקום מחט. ת"א מורכבת מתאי שטחי ועמוק המוגדרים על ידי אפונירוס. ת"א מדמיינות את גשושית האולטרסאונד הכיוון בנקודות המבט הדיסטליות-פרוקסימליות (A) והדיאליות(B),כך שניתן יהיה לזהות את צורת ה-3D של ת"א. עומק מחט אידיאלי לאיסוף הוא בין הקווים המ מקווקווי אופקי. ייצוג קריקטורה של החדרת המחט מוצג בלוחות C ו-D. לאחר החתך נעשה, המחט ממוקמת תחילה בניצב לשריר ונדחפת לתוך השריר עד חלון המחט הוא בשריר (ג). המחט לאחר מכן reoriented לזווית ~ 45 ° לאורך הציר הארוך של הרגל, ודחף לתוך השריר עוד יותר, תוך מתן תשומת לב זהירה כי המחט אינה חודרת aponeurosisעמוק (D). תמונות חיות(E, F)במהלך ההליך ניתנות בהתייחסות לקריקטורה (C, D). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מיקום משתתף. המשתתף מונח בעמדה סופית על שולחן הפעולה. הראש יכול להיות מורם לנוחות. כף הרגל הימנית ממוקמת במכשיר מותאם אישית ששומר על הרגל מעט dorsiflexed, הפחתת מתח שרירים. וילון מונח מול המשתתף כך שהם לא יכולים לצפות בהליך. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תמונות מייצגות של רקמת שריר. (א)מיד לאחר הביופסיה, דגימת השריר תהיה אדומה כהה יותר מרקמות אחרות, כולל רקמת שומן ורקמות חיבור (המסויגות בפאנל). (ב)פירוק דגימות עם נזק/קצר (למעלה) וחבילות סיבים מעשיות (להלן). (ג)הגדלה של קיבוץ סיבים קיימא כדי לבדוק את פני השטח לסימנים של נזק. (D)חבילה של 6 סיבים נותקה הרחק מחבילת סיבים זו (קשורה בקצוות עם תפר 6-0 לתנועה קלה ומצורפת לציוד המכני. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תפוקת כוח מייצגת של הכנת חבילת סיבים. כדי להדגים את העמידות של הסיבים, אנו מציגים נתוני מתח מייצגים של פרוטוקול מכני פשוט באמצעות חבילת סיבים TA גליקט (3 סיבים). בסך הכל, 40 חבילות סיבים מהביופסיות של 10 משתתפים נמתחו מ רפוי 2.7 μm אורך sarcomere והחזיקו כדי לאפשר הרפיה מתח. לאחר מכן, סיבים הופעלובתמיסת הפעלה 26 (אזור מוצל; גבוה [Ca2+], pCa < 4.2) ב 2.7 μm sarcomere אורך במשך 60 שניות ומתח פעיל במצב יציב נמדד ב 100.71 ± 11 mNמ"מ -2 (כלומר ± SEM). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדו"ח זה, תיארנו טכניקה לביופסיה של רקמת שריר לא פגומה מבחינה מבנית מת"א. מצאנו כי הליך זה מניב תוכן מקובל של סיבי שריר שנויים (5-10 תכשירים חבילת סיבים לכל 50 מ"ג של רקמה שנאספו) לבדיקות מכניות. יתר על כן, היו לנו מספיק רקמות לניסויים מכניים, גנטיים ופרוטונומיים למעקב.
ישנן מספר שיטות המשמשות בדרך כלל לאוסף של ביופסיותשרירים 3,4,6,27,28. מה שנקרא ביופסיה פתוחה20 מייצרת את הסיבים באיכות הגבוהה ביותר כי מנתח חושף באופן מלא את השריר ומנתח את הדגימה. כמובן, ניתוח פתוח הוא הליך פולשני למדי והוא לא הליך מתאים להגיש משתתפים בריאים, ללא קשר לשאלת המחקר, בגלל הסיכונים הפוטנציאליים הקשורים ניתוחים פתוחים. שיטת הביופסיה הפחות פולשנית היא ביופסיהמחט בסדר 29,30, אשר משתמשת מחט קטנה יחסית כדי לאסוף רקמות. ביופסיות מחט בסדר מספיק כדי לערוך ניסויים על רכיבים גנטיים / כימיים / חלבון שלסיבים 30,31,אבל לעתים קרובות איכות הסיבים הוא עני מאוד, מה שהופך בדיקות מכניות קשה או בלתי אפשרי. טכניקת מחט Bergström היא פשרה טובה בין שני ההליכים מוסבר לעיל כי הניתוח הוא פחות פולשני מאשר ביופסיה פתוחה, אבל עדיין אוסף דגימות שרירים כי הם גדולים (פוטנציאל) יותר מבני שלמים מאשר ביופסיות מחט בסדר. דיווחים קודמים של הליך מחט Bergström3,5 הם משאבים גדולים עבור אלה הלומדים את הטכניקה, אבל רק להציג פרוטוקולים עבור לוואלטוס lateralis. הדו"ח שלנו מדגים את הטכניקה של ת"א המתמקדת באיסוף תשואות גבוהות של סיבים מבניים שלמים לבדיקות מכניות.
למיטב ידיעתנו אין פרסומים מפורטים על איסוף הביופסיות של ת"א. אף על פי כן, הנוהג המקובל הוא להניח את המשתתף ולרגיע את הרגל ככל האפשר. הרגל הרגועה בתנוחה זו היא באופן טבעי plantarflexed, אשר כתוצאה מכך להאריך את ת"א ומכניס אותו למתח. אנו מוצאים כי כל מתח שרירים מקשה על כונן שריר לתוך מחט הביופסיה, אפילו עם לחץ שלילי, ולכן מתח צריך להיות ממוזער ככל האפשר. כדי להשיג זאת, השינוי הפשוט אך העיקרי כאן היה להשתמש בצלחת רגל מותאמת אישית ששמרה על הקרסול בתנוחה מעט דורסיפלקסית (0-5° מנייטרלי), תוך שמירה על מרווח ת"א ושיפור האיסוף. על המרפאות להיזהר שלא להגזים בקרסול, מכיוון שת"א תופעל ללא שליטה, מה שכמובן מנוגד להליך מלכתחילה. המשתתף יכול בדרך כלל להרגיש הפעלת שריר זה, כך תקשורת היא המפתח. מהפרוטוקולים, ת"א מניבה רק ~ 25% רקמה לעומת נפוץ יותר vastus lateralis, ~ 100 מ ג ו ~ 400 מ ג, בהתאמה. לכן, חשוב למקסם את גודל איסוף הרקמות תוך כדי גם לשקול אם מדגם רקמת ת"א יהיה גדול מספיק עבור פרויקט המחקר הרצוי(ים). מצאנו כי נטילת דגימה שנייה מיד לאחר הראשון אינה גורמת לסיבוכים נוספים או זמן ריפוי עבור המשתתפים.
למרות הפרוטוקול נותן כמה הדרכה לקראת ביופסיות שרירים אחרות, בחירת השריר יכתיב את ההליך המתאים. לפיכך, אנו ממליצים בהתרעות לחוקרים ורופאים אחרים לפרסם, במלואם, את שיטות הביופסיה שלהם. מניסיון, אנו מזהים מספר גורמים חשובים לבחירת שרירים, מחוץ לשאלת המחקר. ראשית, אנו מציעים לשקול את השרירים כי הם שטחיים לעור יש עורקים / עצבים ראשיים כי הם עמוק או קל להימנע. שנית, מכיוון שהמשתתפים ערים במהלך ההליך, חשוב לשקול אם הליך הביופסיה יהיה מאוד לא נוח למטופל, בין אם בגלל המיקום הראשוני של המטופל, או בגלל הלחץ של מחט הביופסיה, שגם דוחפת לשרירים עמוקים יותר בצורה לא נוחה. הייתה לנו הצלחה עם ה"ווסטוס לוואליס" ו"חזה". אפשרויות פוטנציאליות אחרות הן טרפז, latissimus dorsi, ו gastrocnemius (אם כי מאוד כלי דם נוטה דימום). שרירי המיתר אפשריים אך לא נוחים למטופל, וקשים כי הם נעים לרוחב בעת איסוף הביופסיה.
למרות מחטי Bergström ניתן לרכוש מייצור, כמה מעבדות בהתאמה אישית לעשות משלהם. התאמות קטנות אך חכמות לעיצוב עשויות להגביר את התשואה של סיבי שריר ארוכים ולא ניזונים. לדוגמה, חלון האיסוף של המחט המשמשת כאן היה 7 מ"מ x 5 מ"מ (אורך x רוחב). זה מתאים ללכוד קוביית שרירים. עם זאת, אם המטרה היא לאסוף סיבים ארוכים ולא ניזמים (באותו נפח), אז האורך יכול להיות מוגבר, ואת הרוחב ירד (כלומר, 10 מ"מ x 3.5 מ"מ). אם המחט היא מונחה לאורך הכיוון fascicle, אז סביר להניח כי מחט זו תאסוף מקטעים סיבים ארוכים יותר.
ביופסיות שריר נאספות לעתים קרובות בבטחה ללא ההדרכה של תמונת אולטרסאונד, במיוחד עבור שרירים גדולים יותר כמו לוואלטוס lateralis. במצב זה, רופא מנוסה כראוי יכול בקלות לחלחלשר כדי למצוא את אתר החתך הטוב ביותר. עם זאת, כאשר הרופא הוא פחות מנוסה עם שריר היעד, או טיפול נוסף מוצדק כדי למנוע עצבים גדולים או כלי דם, אולטרסאונד הוא כלי גדול ופשוט מיושם. לבסוף, ניטור לאחר הניתוח של אזור הביופסיה יכול להתבצע במהירות בעזרת אולטרסאונד.
ביופסיות ילדים הן בהחלט אפשריות ומבוצעות בדרךכלל 32,33,34. עם זאת, בדרך כלל בוצעו מספר שינויים בהליך. מחט מד קטן יותר וההרמה מודעת נדרשים לעתים קרובות, וההליך מתרחש בסביבת בית חולים. באופן כללי, החוויה יכולה להיות טראומטית עבור ילד וקבוצות מחקר שרוצים לכלול משתתפי ילדים בריאים צריך לשקול בזהירות את זה נגד היתרונות הפוטנציאליים של המחקר.
חבילות סיבים או חומרים שאינם נמצאים בהן נוהים ניתן להעביר לניסויים אחרים לפני או אחרי מכניקת סיבים. לדוגמה, ניתן לבצע 35 טכניקות המעריכות תוכן חלבון סרקומרי או מסווגות סוגisoform. עם זאת, כדי להגביל את השפלה חלבון ולשפר את הצלחת הניתוח, רקמה צריך להיות פלאש קפוא חנקן נוזלי או לאחר החילוץ המקורי, מיד לאחר הערכה מכנית, או מעובד באופן מיידי לניתוח חלבון. סיבים יכולים גם להיות מוכנים לכימותרפיה חיסונית או טכניקות הדמיהאחרות 36 המאפשרות הערכה של מיקום החלבון בתוך הסיבים. במקרה זה, ניתן למצוא סיבים בתמיסה קיבענית (למשל, 4% paraformaldehyde/0.25% גלוטרלדהייד בחיץ פיזיולוגי ב pH 7; אין גלוטראלדהייד עבור אימונוהיסטוכימיה) בעוד עדיין על מכשיר הבדיקה המכנית, שמירה על המבנים הסרקומריים באורך sarcomere הרצוי. במידת האפשר, חתיכה קטנה של הביופסיה המקורית ניתן לקצור, לשטוף במרץ בפתרון איסוף במשך 10 דקות ולאחר מכן ממוקם לתוך פתרון קיבעון. קבוצות רבות מעדיפות להקפיא באופן מיידי דגימות שנמחקו לאחרונה באיזופנטן, המגבילה את היווצרות גבישי קרח מזיקים, ומשפרת את איכות התמונה להערכות חזותיות. זהו אכן תקן הזהב להקפאת הבזק; עם זאת, אנו מוצאים כי נזק גביש הקרח מחנקן-הקפאה מתמקד רק במבנים מיו-בריאן חוץ. יש לנו שלמות מבנית משביעת רצון של רכיבים סרקומריים בדגימות גם קפוא חנקן נוזלי, ולכן אנחנו חושבים כי חנקן הוא אפשרות, במיוחד אם הוא זמין יותר, או צוות כירורגי / הרשות הכימית המקומית אינה מוכנה להשתמש איזופנטן. בעיה חשובה ולעתים קרובות לא מדווחת עם הכנת דגימות לצפייה היא כי הסרקומרים הם לעתים קרובות חוזה / קצר, עם אזור I-band של sarcomere קצר או בלתי ניתן לתכלית. כדי להתגבר על כך, על החוקר למתוח באופן ידני את דגימות הסיבים (על ידי מתקן הבדיקה או ביד באמצעות פינצטה עדינה) לפני התיקון. ככלל, אנו נמתחים ל ~ 3.2 μm אורך sarcomere (נמדד באמצעות מפזר לייזר), או למתוח ~ 150% של אורך רפוי, בתמיסה מרגיעה פיזיולוגית סידן נמוך. לבסוף, אם דגימות משנה מבוקשים לניתוח ביטוי RNA, השיטה של הקפאת הבזק אינה משפיעה על התוצאות, אבל דגימות יש להקפיא מיד לאחר החילוץ המקורי והנחית במקפיא -80 ° C, כמו RNA הוא מאוד לא יציב. יש כמה פתרונות אחסון הגנה RNA בשוק, אבל מצאנו תוצאות מעורבות עם השימוש שלהם, ורק פלאש להקפיא דגימות טריות.
כדי למקסם את כמות המידע שנאסף במהלך ניסוי אחד, ניתן להשלים איסוף בו-זמני של נתונים אחרים בעת ביצוע בדיקות מכניות. לדוגמה, ניתן לבצע את המחקר של מבנים סרקומריים במהלך בדיקות מכניות באמצעות הדמיית מפזר רנטגן בזווית נמוכה, כפי שנעשה בבעלי חייםאחרים 37,38. עבור ניסויים גנטיים, שריר ים יש לעבד באופן מיידי למטרה זו או פלאש קפוא כי DNA / RNA הם יציבים יחסית פחות חלבונים.
מגבלות מסוימות מתוארות כבר לעיל. כאן אנו דנים בהליך עצמו. מגבלה גדולה עבור רוב הקבוצות היא שיש חבר צוות אשר מאומן כראוי באוסף ביופסיה. ללא קשר למקצועו של האדם (רופא, עוזר רפואי, טכנאי, או אחר), הליך זה קשה כי החוקר נוהג במחט באופן עיוור וחייב להסתמך על"להרגיש" 3,,28 כדי לאתר את חלון המחט במדויק. טעויות אינן נסבלות כי הסכמה של משתתפים אנושיים לביופסיות היא דלילית, ביופסיה אחת עדיפה על רבים, וטעויות עלולות להוביל לנזק לכלי דם או עצביים. לכן, יש להשלים את כל אפשרויות האימון לפני ביצוע ביופסיה אנושית. לדוגמה, כדי לקבל "תחושה" לנהיגה במחט, בשר חזיר עם עור עדיין מחובר ניתן לרכוש מרוב חנויות המכולת ולהשתמש בו פרוקסי לעור ושרירים אנושיים. ניסיון יקר נוסף הוא לעקוב אחר קבוצת מחקר מיומנת.
הערכנו את הכאב/אי הנוחות של המשתתפים בצורה איכותית יותר, תוך הסתמכות על ניסיונו של הרופא ושיחותיו עם המשתתף כדי להעריך את הכאב הנתפס. עם זאת, ההערכה של כאב ואי נוחות לאחר ביופסיה יכול להיות יותר מכמת ודומה על פני אנשים מחקרים באמצעות סקרי כאב / אי נוחות מאומתים. לנקודות אלה יש יחס מועט באופן מפתיע בספרות. עם זאת, מחקר אחד שפורסם לאחרונה הציג דרך לכמת כאב/אי נוחות של משתתף לפני, במהלך ואחרי ביופסיות, על ידי ניצול סקרים מבוססים היטב שלכאב 39. נציין כי נייר זה השתמש בvasvas lateralis כשריר היעד, ולכן מחקרי מעקב נדרשים כדי להשוות הערכות כאב בין השרירים.
ללא קשר לשיטת החילוץ, טכניקת ברגסטרום אינה יכולה לתבל את האורך הכולל של הסיבים בשריר מכיוון הסיבים ארוכים מדי (כ-6-8 ס"מבת"א 40, כ-6.5-8 ס"מ ב-vastus lateralis40). לכן, זה בלתי נמנע כי עבור חתיכה ארוכה של סיבים שנאספו, הקצוות נהרסים על ידי טכניקת הביופסיה. לעתים קרובות, החלק המרכזי שאף של סיב הוא קטן ולכן קשה לבדוק מכנית. למרות הטכניקה מספקת אזורים מרכזיים ארוכים למדי (3-5 מ"מ), החוקר חייב לבדוק בקפידה את איכות חבילות הסיבים במהלך הניתור כי השימוש בסיבים פגומים ישנה תפוקות כוח פסיבי או אקטיבי. תצפית חזותית על ביופסיות מוצלחות תהראה חלק של סיבים שלא ניזזו מהליך הביופסיה. כאשר מסתכלים ממיקרוסקופ אור ניתוח מסורתי, פני השטח של סיבים ייראה חלק, ללא חורים או דמעות(איור 4). יתר על כן, סיבים צריכים להיראות גליליים ואין להם אזורים שטוחים. למרות שלא נראה לעין, השריר עצמו יהיה לרדת לאורך זמן בגלל proteases טבעי להתחיל לשבור את חלבוני שריר כמעט מיד לאחר החילוץ. לכן, זה קריטי להוסיף מעכבי פרוטאז לכל הפתרונות המשמשים עם הסיבים. יתר על כן, אנו מציעים גם שטיפה נוספת של הביופסיות כדי להסיר דם רב ככל האפשר.
גם עם הכנה זהירה, נזק לסיבים יכול להתרחש ולהוביל להפעלות סיבים עניים. ישנן סיבות רבות לנזק לסיבים כי סיבים רגישים מאוד כמעט לכל חלק של ההליך. לדוגמה, במהלך הביופסיה, אם trocar אינו חד מספיק, זה יכול לדחוף לתוך רקמת השריר במהלך החילוץ במקום לחתוך דרכו, אשר יכול למתוח ולהרוס את הסיבים. יש להכין את פתרון האיסוף כראוי מכיוון הסיבים רגישים לשינויים אוסמוטיים, pH, וטמפרטורה. בעת טיפול בסיבים, יש לנקוט בזהירות רבה כדי להגביל לחלוטין את הלחץ על הסיבים. במקום זאת, פינצטה צריך לשמש כדי לתפוס את הביופסיה על ידי רקמת החיבור שלה. חלופה נוספת היא להשתמש בתפר משי בגודל 0-7 כדי לעטוף קצה בלתי שאף של הביופסיה ולאחר מכן לתפוס את זה בעת הטיפול. לבסוף, גליצרול משרת שני תפקידים: הראשון הוא לשמור על השריר מקפוא בעוד ב -20 °C והשני הוא להיות חומר ניקוי מתון לסיבים. כל זאת, גליצטרול permeabilizes הסיבים לפתרונות חיצוניים, המאפשר זרם של סידן (באמצעות פתרון הפעלה). עבור רוב השרירים, תהליך זה לוקח ~ 10 ימים. עם זאת, בהתאם לכמות תוכן הקולגן וגודל המדגם, זה יכול לקחת עד 6 שבועות. סיבים חייבים להיות חבולים עבור כל הפעלת סידן גבוהה להתרחש במהלך ניסויים מכניים. סיבים הם בדרך כלל שנויים לפחות 3 חודשים. כדי להגביל את בזבוז הסיבים, זמן המתנה ארוך יותר ליציבות (4-6 שבועות) מוצע לסיבי שריר של ת"א.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים למיכאלה ראו, ללאה-פדיה ריסמן, מייקל מארש, ג'נינה-סופי טנלר, קיליאן קימסקאמפ ווולפגנג לינק על שסייעו בפרויקט. המימון לפרויקט זה סופק על ידי קרן MERCUR (מזהה: An-2016-0050) ל-DH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe | B. Braun Melsungen AG Carl-Braun-Straße 1 34212 Melsungen, Hessen Germany |
4606027V | Drug administration |
| 5mm Berstöm needle | homemade | N/A | Tissue collection. Similar to other Berstöm needles |
| Acrylastic | BSN medical GmbH 22771 Hamburg |
269700 | elastic compression bandage |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics, Mannheim, Germany | 11836145001 | Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue. |
| Cutasept | PAUL HARTMANN AG Paul-Hartmann-Straße 12 89522 Heidenheim Germany |
9805630 | Disenfectant spray for the skin |
| Leucomed T plus | BSN medical GmbH 22771 Hamburg |
7238201 | Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection |
| Leukostrip | Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road, Hull Great Britain |
66002876 | wound closure |
| Surgical disposable scalpels | Aesculap AG Am Aesculap-Platz 78532 Tuttlingen Germany |
BA200 series | Incision |
| Unihaft cohesive elastic bandage | BSN medical GmbH 22771 Hamburg |
4589600 | cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact |
| Xylocitin 2% with Epinephrin | Milbe GmbH Münchner Straße 15 06796 Brehna Germany |
N/A | Controlled substance anesthesia, vasoconstriction |
References
- Franchi, M., et al. Architectural, functional and molecular responses to concentric and eccentric loading in human skeletal muscle. Acta Physiologica. 210 (3), 642-654 (2014).
- Duchene, G. B. A. De la paralysie musculaire pseudo-hypertrophique, ou paralysie myo-sclérosique / par le Dr Duchenne (de Boulogne). Archives of General Internal Medicine. 11 (30), (1868).
- Shanely, R. A., et al. Human skeletal muscle biopsy procedures using the modified Bergström technique. Journal of Visualized Experiments. (91), e51812 (2014).
- Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine and Science in Sports and Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
- Bergstrom, J. Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35 (7), 609-616 (1975).
- Baczynska, A. M., et al. Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome. Journal of Visualized Experiments. (109), e53075 (2016).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Buck, E., et al. High-resolution respirometry of fine-needle muscle biopsies in pre-manifest Huntington's disease expansion mutation carriers shows normal mitochondrial respiratory function. Plos One. 12 (4), 01175248 (2017).
- Murgia, M., et al. Single Muscle Fiber Proteomics Reveals Fiber-Type-Specific Features of Human Muscle Aging. Cell Reports. 19 (11), 2396-2409 (2017).
- Friedmann-Bette, B., et al. Effects of strength training with eccentric overload on muscle adaptation in male athletes. European Journal of Applied Physiology. 108 (4), 821-836 (2010).
- McPhee, J. S., et al. The contributions of fibre atrophy, fibre loss, in situ specific force and voluntary activation to weakness in sarcopenia. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 73 (10), 1287-1294 (2018).
- Nocella, M., Cecchi, G., Bagni, M. A., Colombini, B. Force enhancement after stretch in mammalian muscle fiber: no evidence of cross-bridge involvement. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (12), 1123-1129 (2014).
- Patel, J. R., McDonald, K. S., Wolff, M. R., Moss, R. L. Ca2+ binding to troponin C in skinned skeletal muscle fibers assessed with caged Ca2+ and a Ca2+ fluorophore. Invariance of Ca2+ binding as a function of sarcomere length. The Journal of Biological Chemistry. 272 (9), 6018-6027 (1997).
- Hessel, A. L., Joumaa, V., Eck, S., Herzog, W., Nishikawa, K. C. Optimal length, calcium sensitivity and twitch characteristics of skeletal muscles from mdm mice with a deletion in N2A titin. The Journal of Experimental Biology. 222, Pt 12 (2019).
- Joumaa, V., Herzog, W. Calcium sensitivity of residual force enhancement in rabbit skinned fibers. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (4), 395-401 (2014).
- Joumaa, V., Rassier, D. E., Leonard, T. R., Herzog, W. The origin of passive force enhancement in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 294 (1), 74-78 (2008).
- Hilber, K., Galler, S. Mechanical properties and myosin heavy chain isoform composition of skinned skeletal muscle fibres from a human biopsy sample. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 434 (5), 551-558 (1997).
- Miller, M. S., et al. Chronic heart failure decreases cross-bridge kinetics in single skeletal muscle fibres from humans. The Journal of Physiology. 588, Pt 20 4039-4053 (2010).
- Pinnell, R. A. M., et al. Residual force enhancement and force depression in human single muscle fibres. Journal of Biomechanics. 91, 164-169 (2019).
- Einarsson, F., Runesson, E., Fridén, J. Passive mechanical features of single fibers from human muscle biopsies--effects of storage. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 3, 22 (2008).
- Flann, K. L., LaStayo, P. C., McClain, D. A., Hazel, M., Lindstedt, S. L. Muscle damage and muscle remodeling: no pain, no gain. The Journal of Experimental Biology. 214, Pt 4 674-679 (2011).
- Commission for Hospital Hygiene and Infection Prevention (KRINKO), Federal Institute for Drugs and Medical Devices (BfArM). Anforderungen an die Hygiene bei der Aufbereitung von Medizinprodukten [Hygiene requirements for the reprocessing of medical devices]. Bundesgesundheitsblatt, Gesundheitsforschung, Gesundheitsschutz. 55 (10), 1244-1310 (2012).
- Koch-Institut, R. Ergänzung zur Empfehlung Anforderungen an die Hygiene bei der Aufbereitung von Medizinprodukten. RKI-Bib1. , Robert Koch-Institut. (2018).
- Rutala, W. A., Weber, D. J. Disinfection and sterilization in healthcare facilities. Practical Healthcare Epidemiology. , 58-81 (2018).
- Rassier, D. E., MacIntosh, B. R. Sarcomere length-dependence of activity-dependent twitch potentiation in mouse skeletal muscle. BMC Physiology. 2, 19 (2002).
- Mounier, Y., Holy, X., Stevens, L. Compared properties of the contractile system of skinned slow and fast rat muscle fibres. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 415 (2), 136-141 (1989).
- Henriksson, K. G. Semi-open muscle biopsy technique. A simple outpatient procedure. Acta Neurologica Scandinavica. 59 (6), 317-323 (1979).
- Dietrichson, P., et al. Conchotome and needle percutaneous biopsy of skeletal muscle. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 50 (11), 1461-1467 (1987).
- Iachettini, S., et al. Tibialis anterior muscle needle biopsy and sensitive biomolecular methods: a useful tool in myotonic dystrophy type 1. European Journal of Histochemistry. 59 (4), 2562 (2015).
- Cotter, J. A., et al. Suction-modified needle biopsy technique for the human soleus muscle. Aviation, Space, and Environmental Medicine. 84 (10), 1066-1073 (2013).
- Edwards, R. H., Round, J. M., Jones, D. A. Needle biopsy of skeletal muscle: a review of 10 years experience. Muscle & Nerve. 6 (9), 676-683 (1983).
- Gibreel, W. O., et al. Safety and yield of muscle biopsy in pediatric patients in the modern era. Journal of Pediatric Surgery. 49 (9), 1429-1432 (2014).
- Cuisset, J. M., et al. Muscle biopsy in children: Usefulness in 2012. Revue Neurologique. 169 (8-9), 632-639 (2013).
- Nilipor, Y., et al. Evaluation of one hundred pediatric muscle biopsies during a 2-year period in mofid children and toos hospitals. Iranian Journal of Child Neurology. 7 (2), 17-21 (2013).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Wang, K., Wright, J. Architecture of the sarcomere matrix of skeletal muscle: immunoelectron microscopic evidence that suggests a set of parallel inextensible nebulin filaments anchored at the Z line. The Journal of Cell Biology. 107 (6), 2199-2212 (1988).
- Ma, W., Gong, H., Irving, T. Myosin head configurations in resting and contracting murine skeletal muscle. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
- Ma, W., Gong, H., Kiss, B., Lee, E. J., Granzier, H., Irving, T. Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle. Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).
- Bonafiglia, J. T., et al. A comparison of pain responses, hemodynamic reactivity and fibre type composition between Bergström and microbiopsy skeletal muscle biopsies. Current Research in Physiology. 3, 1-10 (2020).
- Wickiewicz, T. L., Roy, R. R., Powell, P. L., Edgerton, V. R. Muscle architecture of the human lower limb. Clinical Orthopaedics and Related Research. (179), 275-283 (1983).
