Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mekanik Değerlendirme için İnsan Musculus Tibialis Anterior Üstün Bölmesi İskelet Kas Biyopsileri Toplama

Published: September 27, 2020 doi: 10.3791/61598
Automatic Translation
1,4, 1,2, 3
1Faculty of Sport Science, Human Movement Science, Ruhr University Bochum, 2School of Human Movement and Nutrition Sciences, The University of Queensland, 3Faculty of Sport Science, Sports Medicine and Sports Nutrition, Ruhr University Bochum, 4Institute of Physiology II, University of Muenster

Summary

Bu teknik rapor, lif hasarını sınırlayan musculus tibialis anterior biyopsisi için modifiye Bergström tekniğinin bir varyasyonu açıklanmaktadır.

Abstract

İskelet liflerinin mekanik özellikleri genel kas sağlığı, fonksiyon ve performansın önemli göstergeleridir. İnsan iskelet kas biyopsileri genellikle bu çabalar için toplanır. Ancak, biyopsi prosedürleri nispeten az teknik açıklamalar, yaygın olarak kullanılan musculus vastus lateralis dışında, mevcuttur. Biyopsi teknikleri genellikle çalışma altında her kas özelliklerini karşılamak için ayarlanmış olsa da, birkaç teknik raporlar büyük topluluk için bu değişiklikleri paylaşmak. Böylece, insan katılımcıların kas dokusu genellikle operatör tekerleği yeniden icat olarak israf edilir. Çeşitli kaslardan biyopsiler üzerinde mevcut malzeme genişletilmesi başarısız biyopsiler olayını azaltabilir. Bu teknik rapor, musculus tibialis anterior üzerindeki modifiye Bergström tekniğinin lif hasarını sınırlayan ve mekanik değerlendirme için yeterli lif uzunluklarını sağlayan bir varyasyonu açıklamaktadır. Ameliyat bir saat içinde tamamlanabilecek bir ayakta tedavi prosedürüdür. Bu işlem için iyileşme süresi hafif aktivite için hemen (yani, yürüyüş), normal fiziksel aktivitenin devamı için üç güne kadar, ve yara bakımı için yaklaşık bir hafta. Çıkarılan doku mekanik kuvvet deneyleri için kullanılabilir ve burada temsili aktivasyon verileri salıyoruz. Bu protokol çoğu toplama amacıyla uygundur, potansiyel olarak diğer iskelet kaslarına uyarlanabilir ve toplama iğnesindeki değişikliklerle geliştirilebilir.

Introduction

Klinik veya araştırma amaçlı insan kas fizyolojisi çalışma genellikle kas biyopsisi gerektirir. Örneğin, insan kas fizyolojisi ve biyomekanik önemli bir sorun arasında ayrım yapmak ve egzersiz kas performansı çeşitli adaptasyonları anlamaktır. Performans adaptasyonları sadece yapısal adaptasyonları içermez (örneğin, kontraktil proteinlerdeki değişiklikler, kas mimarisi) ama aynı zamanda insan kaslarında sağlam test yaparken ayrı ayrı değerlendirmek için çok zor, imkansız olmayan sinirsel adaptasyonlar1'ide içerir. Lif düzeyindedeneyler bu yüksek seviye bileşenleri kaldırmak ve kas kasılması daha doğrudan değerlendirilmesi için izin ve biyopsi teknikleri ile toplanabilir. Kas biyopsileri en az 18682yılından beri toplanmıştır. Bugün, kas biyopsileri toplamak için baskın teknik modifiye Bergström tekniği3,4,5, diğer teknikler bir Weil-Blakesley conchotome kullanımı da dahil olmak üzere kullanılabilir olmasına rağmen6 veya sözde ince iğne7,8. Tüm bu teknikler kas içine geçmek ve doku bir parça kesmek için tasarlanmış özel iğne benzeri aletler kullanın. Özellikle, modifiye Bergström tekniği büyük bir modifiye iğne kullanır (5 mm iğne boyutu burada; Şekil 1) bu iğne ucuna yakın bir pencere ve iğne pencereden geçerken kas kesme, aşağı ve aşağı iğne hareket eden daha küçük bir iç trocar vardır. Bu hallow trocar içinde yukarı ve aşağı trocar şaft hareket eder ve iğne penceresine doğru biyopsi iter bir ramrod olduğunu. İğne penceresiiçine kas çekmek için, bir emme hortumu, hangi iğne hava emer ve negatif basınç ile iğne penceresiiçine kas çeker eklenir.

Kas biyopsileri genellikle protein içeriği değişiklikleri incelemek için elde edilir, gen ekspresyonu, ya da morfoloji hastalığın neden olduğu ya da bir egzersiz programına yanıtolarak 1,9,10,11. Kas biyopsileri için bir diğer kritik kullanım, lif kontraktil kuvvetinin ölçülmesi, kas lifsertliği ve geçmişe bağlı kas özellikleri12,,13,,14,15,16gibi mekanik deneylerdir. Tek elyaf veya lif demeti mekaniği aynı anda kuvvet ölçerken lif uzunluğunu kontrol özel teçhizatları üzerinde bir uzunluk motoru ve kuvvet transdüser arasında lifler takArak ölçülür. Geçirimsizleştirici (örn. deri yüzme) lifleri ile sarkolemma membran, banyo çözeltisindeki kimyasallara geçirilebilir hale gelir ve kalsiyum konsantrasyonunu değiştirerek aktivasyon kontrolü sağlar. Ayrıca, kontraktil özelliklerinin kimyasallar/farmasötikler/diğer proteinler üzerindeki etkisi, söz konusu reaktifin banyo çözeltisine eklenmesiyle kolayca değerlendirilebilir. Ancak, bu teknik son derece diğer hayvan modellerinde kullanılırken, belirgin daha az çalışma insan kas biyopsileri17,18,,19derili lifler üzerinde mekanik testler yaptı. Bunun nedenlerinden biri, biyopsi araçları nın ve protokollerinin doku çıkarma sırasında oluşan yapısal hasar seviyesine daha az göz önünde bulundurularak mümkün olduğunca çok kas dokusunu çıkarmak üzere tasarlanmış olmasıdır. Nitekim, yeni bir biyopsi protokolü kas içine biyopsi iğne sürücü vekas3 2-4 parçaları toplamak öneriyor. Sürecin kendisi DNA veya protein materyaline çok az zarar verir, ancak genellikle lif ve sarkoerik yapıları kas liflerinin aktivasyonu kararsız veya imkansız hale gelir şekilde yok eder. Ayrıca biyopsi deki liflerin göreceli uzunluğu genellikle kısadır (<2 mm) ve mekanik testler için kolayca işlenmez. Mekanik testler için ideal lifler uzundur (3-5 mm) ve yapısal olarak hasar görmemişlerdir.

Daha gelişmiş doku çıkarma teknikleri lif hasarı sınırlamak için kullanılabilir. Örneğin,20 kişilik bir grup, kasların tam olarak maruz kaldığı ve bir cerrahın kas yapısını görselleştirebildiği ve nispeten büyük ve yapısal olarak hasar görmemiş kas dokusu (15 mm x 5mm x 5 mm) örneklerini dikkatlice inceleyebildiği ön kolların önceden planlanmış "açık ameliyatlarından" (örn. kemik kırığı onarımı) yararlandı. Bu "açık biyopsi" tekniği, katılımcılar daha önce planlanmış bir prosedürden geçerken tercih edilir ve bu nedenle, özellikle sağlıklı yetişkinler için, aksi takdirde hiçbir ameliyat ların gerçekleşeceği potansiyel katılımcıların havuzunu sınırlar. Böylece, araştırma amaçlı yapılan birçok biyopsi ayakta tedavi işlemi olarak yapılırken, enfeksiyon, yara izi ve iyileşme süresini sınırlamak için kesi bölgesi mümkün olduğunca küçük tutulmaktadır. Bu nedenle, en biyopsiler körü körüne toplanır (yani, operatör kas içine fasya geçer gibi toplama iğne görmek mümkün değildir). Bu biyopsi kalitesi neredeyse tamamen operatör beceri ve deneyime dayalı olduğu anlamına gelir. Her kas doku toplarken kendi zorlukları vardır, sinirler ve kan damarları ihlal riskleri gibi, ideal bir toplama derinliği ve yer seçimi, ve mümkün olduğunca gevşek kas tutmak için uygun bir vücut pozisyonu karar. Ne yazık ki, kas özgü skillsets çoğu yazılı değildir ve bu yüzden her hekim onlara yeni kaslar üzerinde biyopsi yaparken "tekerleği yeniden icat" gerekir. Hekim bu kas biyopsiler için en iyi uygulamaları tanımlayana kadar deneyim Bu eksikliği genellikle düşük kaliteli çeşitli koleksiyonlara yol açar. Acemi hekimler genellikle daha deneyimli meslektaşları ile konuşmaları yoluyla beceri öğrenmek, ancak nispeten az bilgilendirici ve hakemli metinler bu konuda var, geleneksel biyopsi toplama için kullanılmayan kaslar için özellikle. Yukarıdaki bilgileri göz önünde bulundurursak, biyopsiler için insan gönüllüleri işe almanın zorluğu ile birlikte, her katılımcı için başarı şansını en üst düzeye çıkaran daha fazla öğretim bilgisine ihtiyaç duyulduğu açıktır.

Bu yazının amacı, mekanik testler için uzun, hasarsız lif parçaları ile kas biyopsilerinin başarılı bir şekilde toplanması için protokoller sağlayan bir kas biyopsisi tekniği sunmaktır. İnsan kas biyopsileri genellikle yapılır, ve biyopsi eğitim materyalinin toplu, musculus vastus lateralis. Onun nispeten büyük kas boyutu ve cilde göre yüzeysel konumu yeterli kas dokusunun toplanması için izin verir, hasta rahatsızlık ve fiziksel travma en aza indirirken1,21. Ancak, uzunlamasına eğitim çalışmaları için vastus lateralis kullanarak bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, bir eğitim programı içeren deneysel protokoller sırasında, katılımcılar genellikle 2-6 ay aşan bir süre için çalışma dışında ek eğitim kaçınmalısınız. Sporcular için bu genellikle mümkün değildir, çünkü vastus lateralis genellikle tipik egzersizler sırasında (örneğin, çömelmeler, atlar) veya genellikle spor için kullanılır (örn. koşu, bisiklet) için kullanılır. Çalışmanın amacından uzak bu ayrı eğitim deneyimleri kas mekaniği, mimari ve fizyolojiyi kas özellikleri üzerinde çalışmanın deneysel protokolünün gerçek etkisini bilmek zor ya da imkansız bir şekilde değiştiren kas adaptasyonlarına neden olabilir. Çalışmaların bu tür için, genellikle eğitim alayları odak noktası olmayan bir hedef kas seçmek için ideal olacaktır. Musculus tibialis anterior (TA) yukarıdaki gereksinimleri karşılayan ideal bir hedef kastır. Buna ek olarak, eğitim müdahaleleri bir dinamometre kullanımı gibi kontrol edilebilir yaklaşımlar kullanılarak TA'ya yönelik olarak hedeflenebilir. TA kas biyopsisi ile ilgili neredeyse hiçbir eğitim materyali yoktur. Bu nedenle, ta nispeten hasarsız kas biyopsileri toplamak için değiştirilmiş bir protokol geliştirdi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Aşağıda, devam eden ayrı bir çalışmaya kaydolan gönüllülerin TA mekanik olarak hasarsız liflerin hasat için bir protokol anahat. Bu protokol, vastus lateralis'te modifiye edilmiş Bergström tekniğini tanımlayan Shanely ve ark.3tarafından tanımlanan protokole benzer. Burada sunulan bilgiler araştırma grubumuz tarafından geliştirildi, ancak tüm laboratuvar grupları veya organizasyonel kurulumlar için ideal olmayabilir. Sadece yönergeler veriyoruz ve biyopsi toplamaya yeni gelen laboratuvarların herhangi bir insan deneyi denemeden önce deneyimli laboratuvar gruplarına danışmalarını öneriyoruz.

Bu yazıda yapılan tüm çalışmalar Ruhr Üniversitesi Bochum Spor Bilimleri Fakültesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Katılımcılar çalışmaya katılmadan önce ücretsiz yazılı bilgilendirilmiş onay verdiler.

1. Deneysel hazırlık

  1. Katılımcı konsültasyonu sırasında katılımcının ayrıntılı tıbbi geçmişini alırken dışlama kriterlerini değerlendirin (aşağıya bakın).
    1. Biyopsiye kadar geçen 6 hafta boyunca hedef kasta bir sakatlık geçiren katılımcıları hariç tinler. Katılımcıların genellikle sağlıklı olduğundan, kas veya pıhtılaşma bozukluğu olmadığını ve şu anda kan incelmesine (örneğin aspirin) neden olan ilaçlardan haberdar olmalarını sağlayın.
      NOT: Burada orta derecede aktif olan ve biyopsiden en az 3 gün önce yoğun veya alışık olmayan bacak egzersizlerinden kaçınmaları talimatı nı veren katılımcıları seçtik. Ancak, diğer araştırma soruları için, bu kriterler değişebilir.
  2. Alman yasaları ve yaygın uygulama tarafından düzenlenen ve takım hekimi tarafından denetlenen22,23,sterilizasyon ve aseptik teknikler, uymak . Bu işlem genellikle bir "başucu" prosedürü olarak veya ayakta tedavi cerrahi paketi yapılabilir. Rehberlik için yerel düzenleyici kuruma danışın.
  3. Biyopsi ekibini oluşturun. Biyopsi ekibinde 4 kişiden oluşan bir biyopsi çalışması öneriyoruz. Bir hekim (veya biyopsi toplama eğitimli birey), hekim ile çalışan bir tıbbi asistan, izleyen ve katılımcı ile etkileşim bir asistan, ve ekstraksiyon hemen sonra kas biyopsisi kolları bir asistan. Bu sayılarla, işlem sırasında tıbbi bir acil durum oluşursa hızlı hasta bakımı uygulanabilir. Prosedür ile rahat ise, o zaman takım sadece iki kişiden yapılmış olabilir: hekim ve tıbbi asistan, birlikte hasta bakımı ve doku işleme aynı anda alacak.
  4. Katılımcının kullanıcı onay formunu gözden geçirmek, tartışmak ve imzalamak için proje lideri/hekimle görüşmesini sağlamak. Ayrıntılı bir tıbbi geçmişi (alerji, yaralanma veya alt ekstremite ve TA ameliyatları) alın ve herhangi bir dışlama kriterlerini karşılıyorsa katılımcıhariç. İyileşme ve kesi hijyenini iyice tartışın.
    1. Katılımcıya, ameliyattan hemen sonra yanacaklarını ancak yürüyebileceklerini açıklayın; yamaçlarda veya merdivenlerden aşağı yürümek genellikle ilk 48 saat boyunca rahatsız edicidir ve genellikle 72 saat sonra tam aktivite geri döner. Son olarak, enfeksiyon ve mekanik aşınmaları sınırlamak için, kesi bölgesinin en az 1 hafta bandajlı kalması ve temiz tutulması gerektiğini açıklayın.

2. B-mode Ultrason ile Anterior Tibialis Görselleştirin

  1. Katılımcıya rahat bir supine pozisyonunda uzanmasını ve bacak kaslarını mümkün olduğunca gevşetmesini öğretin. Özel yapım bir cihaz kullanın (aşağıya bakın) veya asistanın biyopsi sırasında yapılacak ları taklit etmek için ayak bileğini hafif çesitli bir pozisyonda tutmasını bekleyin.
    NOT: Katılımcının işlem sırasında kas özelliklerini taklit edebilmeleri için rahat bir TA'ya sahip olması önemlidir. Sınav sırasında, kas mimarisindeki değişikliklerin not edilebilsin diye katılımcıdan kas sözleşmesini yapmasını ve kaslarını gevşetmesini isteyin.
  2. TA'nın yüzeysel ve derin bölmelerini görselleştirmek, kas mimarisini incelemek ve saldırının derinliğine ve iğne açısına karar vermek için ultrason sondası kullanın(Şekil 2A-B). Ciltteki simgeleri belirtin.
    1. Majör damarlar, arterler veya sinirler önler bir hedef alanı seçimiözellikle dikkat verin.
    2. TA kas göbeği içinde merkezi aponeurosis belirlemek amacıyla kas kesitini değerlendirmek (yaklaşık 1/3 bacak, diz distal, ve tibial arması 2 cm lateral) (Şekil 2B). Merkezi aponeurosis'in (genellikle 1,5-3 cm) yerini ve derinliğini kaydedin, böylece toplama (Bergström) iğnesini bu noktadan geçmemeye özen gösterebilir.
    3. Ultrason probu hedef konuma proksimal-distal oryantasyonda yerleştirin ve fasikül pennation ve kas kalınlığıgörselleştirmek(Şekil 2A). Başarılı bir şekilde (körü körüne) kas karnına toplama iğne sürücü yardımcı olmak için bu bilgileri kullanın. Cerrahi işlem sırasında ileride referans için her iki düzlemde de hedef sitenin görüntülerini kaydedin.
  3. Bu bilgilerle, hedef alana doğru iğne hareketi için bir plan oluşturun.
    1. Kesiyi hedef biyopsi bölgesinden 1-3 cm distal yapmayı planlayın. İğne kas içine geçtikten sonra, ekstremite uzun ekseni boyunca cilde ~ 45% açı iğne döndürün, ve daha sonra biyopsi alanına doğru proksimal tahrik. Bu strateji, iğne çok sert itilirse, iğneyi merkezi aponeurosis içine sürme şansını sınırlar. Ayrıca, iğne operatörünün el inebağlı olarak, iğne distal veya proksimal olarak sürülebilir.

3. Biyopsi prosedürü

  1. Katılımcıya ameliyat masasına supine bırakmasını ve bacak kaslarını gevşetmesini öğretin. Katılımcının biyopsi bölgesine görüş alanının bir perde tarafından kapatıldıklarından emin olun.
    1. Katılımcının uzvunu hafif dorsifle edilmiş bir pozisyona (nötrden 0-5°) sabitleyen bir cihaza yerleştirerek kas karnındaki pasif gerilimi ortadan kaldırın; Şekil 3). Hastaya hala kaslarını gevşetip gevşetemeyeceklerini sorun, çünkü çok fazla dorsifleksiyon rahatlamayı zorlaştırabilir.
      NOT: Dorsiflexed ayaktan biyopsi toplamanın, en fazla 5° nötr (yani, ayağın sapına dik taban) daha plantar esnemiş ayak bileği açılarından daha tutarlı ve daha büyük biyopsiler ürettiğini bulduk. Ayak bileği dorsiflexed tutan cihaz özel yapım bir cihazdır. Ancak, (ucuz) cihazların herhangi bir sayı hala istenilen sonucu üretmek imal edilebilir.
  2. Standart uygulamalara göre seçilen kesi alanını tıraş edin, temizleyin24ve dezenfekte edin.
    NOT: Katılımcının "temiz" alanı önerilen kesi bölgesinin yaklaşık 20 cm proksimal-distal ve 10 cm medial-lateral dir. Ancak, bu konuda her zaman kurumun ve/veya ulusal yönetmeliklere (varsa) danışın. Dezenfeksiyon protokolü, cildin temizlenmesini ve daha sonra tıbbi dereceli dezenfeksiyon spreyinin liberal kullanımıyla dört kez dezenfekte edilip dezenfekte edilebiyi içerir. Katılımcı herhangi bir nedenle masadan ayrılırsa, dezenfeksiyon protokolü yeniden başlatılmalıdır.
  3. Lokal anestezik ve vazokonstriktör işlevi gören biyopsi yerinde Epinefrin ile %2 Xylocitin olmak üzere 1.5 cc suprafassiyal enjeksiyon uygulayın. ~20-30 dk'lık ayrılan etki süresini bekleyin.
    NOT: Bu ilaçlar miyotoksiktir ve bu nedenle asla kas içine enjekte edilmemelidir, sadece deri altı doku. Vazokonstriksiyona bir tepki olarak, enjeksiyon bölgesinin alanı beyaz (açık ten tonları) veya gri (koyu cilt tonları) açabilirsiniz.
  4. Steril bir neşter ile deri perdeleri ve nazik dürtme ler ile ilaç etkisini doğrulayın.
  5. Daha önce işaretlenmiş biyopsi yerinde, deri ve fasya ile keser steril bir neşter ile 1 cm proksimal-distal kesi yapmak, kas karın açığa. İğne künt ve fasya geçmeyecek çünkü tam fasya kesmek için özen.
  6. Biyopsi iğnesini cilde dik bir oryantasyonla kas içine 0,5-1,0 cm itin(Şekil 2C, 2E).
    NOT: Operatör farklı doku tipleri ile iğne götürmek için gerekli gerginlik bir değişiklik hissedeceksiniz. Yağ dokusu kolaydır, fasya en zor, ve kas arasında (ama değişken olabilir, katılımcıya göre).
  7. İğneyi bacağın uzun ekseni boyunca cilde ~45° açı konumuna getirin(Şekil 2D, 2F). İğne ucu kas içinde hedef konumda olana kadar kas içine başka bir 1-2 cm iğne itin.
    NOT: Hekim kas boyutlarıbireysel varyasyon uhesaba kaydedilen ultrason görüntüleri kullanmalıdır. Kesi sadece iğneyi sokacak kadar büyük olduğundan, doktor iğneyi körü körüne deriye doğru sürüklüyor. Biyopsi operatörünün deneyimle kazandığı bir "his" vardır. Bir acemi eğitimli bir biyopsi operatörü (tartışma bu konuda daha fazla) beceri öğrenmek gerekir.
  8. Biyopsi iğnesine 100 mL şırınga ve hortum takın(Şekil 1G). İğnede negatif bir basınç oluşturmak ve kas dokusunu iğne penceresine emerek şırınganın pistonunu yaklaşık 15-20 mL çekerek Bergström iğnesine emme uygulayın. Daha sonra, iğne penceresi üzerinde trocar hızlı bir itme (es) ile kas çıkarmak.
    NOT: Emmeden önce ve sırasında, kasın iğneye girmesine yardımcı olmak için iğne penceresinin hemen üzerinde cilde hafif basınç yerleştirmek bazen yararlıdır.
  9. İğneyi yavaşça bacaktan çıkarın, yavaşça döndürün. İğne çıkarılırken sadece ışık direnci olmalıdır. Daha fazla direnç varsa, bu kısmi biyopsi kesilmesine işaret edebilir. Bu oluşur, hedef konuma ihtiyacı dönmek ve doku toplama yeniden girişimi.
  10. İç ramrod kullanarak iğne penceresine doğru excised doku itin.
  11. Numuneyi dikkatlice iğneden çıkarın.
    NOT: İğnenin toplama çözeltisine batırış (lif hazırlama bölümüne bakınız) genellikle biyopsiyi iğneden çıkarır. Ayrıca, şırınga iğne ile hava sürücü ve örnek dışarı itmek için kullanılabilir. Bu teknikler biyopsiye cımbızla fiziksel olarak dokunma ihtiyacını ortadan kaldırır ve hasar olasılığını azaltır. İğneile temas eden aletler, eller (eldivenli veya değil) veya steril olmayan çözeltiler iğneyle temas ederse, işlem sırasında iğne ileri doğru kullanılamaz. Bu nedenle, ikinci bir acil biyopsi gerekiyorsa, o zaman yeni bir steril iğne kullanılmalıdır. Bu genellikle oluşur, bu yüzden rezerv birkaç steril iğneler korumak için en iyi uygulamadır.
  12. Kas olarak doku tanımlayın ve yağ veya bağ dokusu değil. Kas dokusu, koyu kırmızı rengi nedeniyle diğer dokulardan kolayca tanımlanır (Şekil 4A). Bazen, toplanan doku kas değil, yağ veya bağ dokusu.
    1. Yeterli miktarda kas dokusu toplanırsa, protokole devam edin. Yeterli kas yoksa, biyopsiyi tekrar deneyin.
    2. İkinci bir biyopsi gerekirse, katılımcıyı dikkatlice izleyin, çünkü ikinci bir iğne itme zaman zaman katılımcıyı ilkinden daha rahatsız eder.
  13. Kas örneklerini hemen bir toplama çözümünde yıkayın ve tek lif deneyleri için hazırlanın (bkz. kas biyopsisi işleme ve depolama).
    1. Deneyimli bir asistan örnek kalitesini kontrol (aşağıya bakın) ve ikinci bir biyopsi yapmak için ihtiyaç değerlendirmek var. Ayrı bir asistan biyopsiyi işleme için alır, takımın geri kalanı ise katılımcıyla devam eder.
  14. Kesi alanını kapatın.
    1. Kesi yarasını steril Lökostrip bandı ile kapatın. Kesi bölgesinin kenarlarını kesinin uzun eksenine dik tutarak birleştirmek için bir veya daha fazla parça kullanın ve daha sonra çok yönlü yüklemeye karşı korumak için yıldız şeklinde bir desen daha fazla şeritler yatıyordu.
      NOT: Bu adımın doğru şekilde işlenmesi yara izini azaltacaktır. Yaranın dikilmesi yapılabilir, ancak gerekli değildir. Diğer seçenekler yara tutkal içerir.
    2. Enfeksiyona karşı korumak için insizyon bölgesinin üzerine steril yara pansumanı (örn. Leucomed T plus) yerleştirin.
    3. İlk kanamayı sınırlamak ve dış mekanik darbelere karşı korunmak için bacağı uyumlu elastik bandajlarla (örn. Unihaft) sarın.
    4. Kanamayı önlemek ve daha derin sargıların gevşemesini veya yok olmasını önlemek için bacağı akrillastik kompresyon bandajlarıyla sarın.

4. Biyopsi sonrası bakım

  1. Katılımcıdan işlemden hemen sonra dolaşmasını isteyin. Lokalize ağrı olacak. Katılımcıya mümkün olduğunca normal yürümesini emredin.
  2. Katılımcıya bandajları çıkarmamasını veya bandajları suyla ıslatmamasını emretin. En az bir gün devam etmelidir: akrillastik bandaj için bir gün, uyumlu elastik bandaj için üç gün ve yara pansumaniçin yedi gün. Katılımcıya, gerekirse yeniden bandajlanabileceklerini bildirin.
    1. Bir katılımcının biyopsi sonrası bakımını bireyin ihtiyaçlarına göre uyar. Eğitimli bir asistan veya hekim katılımcıyı değerlendirin ve uygun bir biyopsi sonrası bakım planı yapın. Bu işlem için, TA'nın daha fazla in vivo nöromüsküler testinin biyopsiden en az bir hafta ile ayrılmasını öneriyoruz.

5. Kas biyopsisi işleme ve depolama

  1. Doku ekstraksiyonundan sonra, dokuyu hemen 5 mL'lik bir sertlik toplama çözeltisine yerleştirin (mM: Tris (50), KCl (2), NaCl (100), MgCl2 (2), EGTA (1), proteaz inhibitörü tableti (1), pH 7.0) ve kanı yıkamak için 4-6 dakika hafifçe çalkalayın.
  2. Taze sertlik için Rigor çözeltisi değiştirin, hafifçe 4-6 dakika sallayın ve sonra proteaz-inhibitör depolama çözeltisi ve kan değişimi sağlamak için 4 ° C 4 -6 h saklayın.
  3. Gecerigor için Exchange Rigor çözeltisi (mM: Tris (50), KCl (2), NaCl (100), MgCl2 (2), EGTA (1), proteaz inhibitörü tablet (1), 50:50 gliserol, pH 7.0) ve 12-18 saat boyunca 4 °C'de saklayın.
  4. 50:50 toplama katır için bir gecede rigor değişimi: gliserol ve -20 °C'de 3 aya kadar veya bir yıl -80 °C dondurucuda saklayın.
    NOT: Bu işlem, hücreiçine ve dışına manuel kalsiyum eklenmesine olanak sağlayan lif zarını permeabilize eder. Bu süreç zaman alır ve farklı kaslar ve türler arasında farklı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir katılımcı için tüm zaman taahhüdü yaklaşık bir saat (10 dk danışma, 10 dk ultrason, 20 dk cerrahi hazırlık ve anestezik uygulama, 10 dk cerrahi ve 10 dk kurtarma) idi. Çoğu zaman, katılımcılar bilinçsizce kendi TA aktive ve mümkün olduğunca rahat kas tutmak için tutarlı hatırlatmalar gerekli. Biyopsi iğnesi kasın içinde yken, katılımcılar genellikle biyopsi iğnesinin çevresindeki bölgede, ara sıra orta ve yoğun rahatsızlık dönemleri olan benzersiz bir "basınç" hissi bildirmiştir. Bir kez, bir katılımcının tonlarında işlem sırasında hafif çetrene, ancak iğne çıkarıldıktan hemen sonra durdu. Biyopsi boyutları genellikle ~50-100 mg (ıslak kütle) idi. Katılımcıların prosedüre tepkileri genellikle tahmin edilemezdi. Bazen, katılımcının işlem sırasında etkilenmemiş olması beklenirken, diğerleri sinirli yken bayılma belirtileri gösteriyordu, ancak işlem sırasında tamamen etkilenmemişlerdi. Böylece, katılımcıyı bir konuşmayla meşgul etmeyi veya cep telefonlarını kullanmalarına izin vermenin iyi bir uygulama olduğunu gördük, böylece tüm dikkatleri devam eden prosedüre odaklanmadı. Katılımcı ile konuşan asistan da sıkıntı, ağrı veya bayılma belirtileri için onları izledi. Bazen, biyopsi sadece yağ veya bağ dokusu içeriyordu (dokunun soluk-beyaz rengi ile tanımlanır, Şekil 4A). Bu durumlarda hemen ikinci bir biyopsi yapıldı (katılımcı tarafından onaylandıktan sonra). Genellikle başarılı bir biyopsi >%80 kas dokusu(Şekil 4A)verecektir.

Ameliyat sonrası katılımcıların çoğu 3-5 gün süren işlemden sonra rahatsızlık hissetti. Katılımcılar, TA'daki ağrının dik yamaçlarda bir gün yürüyüş yaptıktan sonra beklenilene benzediğini bildirdiler. Kesi bölgesine en az 5 gün boyunca mekanik basınç konmaması gerekir, yoksa yeniden açılabilir. Katılımcılar genellikle küçük bir yara izi ile kaldı, ama biz yükseltilmiş veya başka bir cilt tesih değil. Ayrıca, hiçbir katılımcı enfeksiyon gelişmemiştir.

Biyopsiler 6 hafta boyunca gliserol çözeltisi (1:1 gliserol karışımı: sertlik çözeltisi) permeabilize edildi (yani, derili) ve daha sonra deneyler gününde mekanik test için hazırlanmıştır. Liflerin Gliserol permeabilizasyonu lifler içine banyo çözeltisi difüzyon sağlar, hangi araştırmacı aktivasyon kontrolü verir ve aynı zamanda ilaç veya diğer kimyasallara kas tabi bir cadde sağlar. Ayrıca, gliserol bir anti-donma maddesi olarak işlev, kas uzun süreli depolama için soğuk sıcaklıklarda yer için izin, sınırlı hasar ile. Ancak, gliserol örnekleri nüfuz etmek için biraz zaman gereklidir, ve bu nedenle başlangıçta 4 ° C (ideal bir shake plaka üzerinde) bir gecede biyopsi örnekleri depolama ihtiyatlı olduğunu. Kaslar sadece bu kadar uzun süre kendi işlevi tehlikeye önce saklanabilir. Bu konudaki genel kılavuz, kasların gliserol çözeltisi içinde -20 °C'lik bir dondurucuda en az 3 ay veya -80 °C'lik bir dondurucuda bir yıl boyunca işlevlerini sürdüreceğidir.

Kas örnekleri diseksiyon mikroskobu altında görüntülendi. Bazı kas parçaları küçük veya hasarlı(Şekil 4B)ve çıkarıldı. Daha sonra, lif grupları herhangi bir yapısal hasar için değerlendirildi (görsel kırık veya ezilmiş fiber sarkoli, Şekil 4C). Bu demetlerden 3-10 elyaftan oluşan küçük lif demetleri parçalara çıkarıldı ve mekanik test donanımının deneysel odasına dikkatlice yerleştirildi (Şekil 4D). Yapısal olarak kullanılabilir lif uzunlukları genellikle 3-5 mm uzunluğundaydı. Bergström iğnesi 7 mm'lik bir toplama penceresine sahipti, bu yüzden biyopsi sadece maksimum olarak ~7 mm uzunluğunda lifler elde edebiliyordu. Böylece topladığımız yapısal olarak kullanılabilir lifler neredeyse mümkün olduğunca uzun du. Tipik olarak, biz 50 mg (toplanan) doku başına 5-10 lif demeti hazırlamak. Bu prosedürlerin tam ayrıntıları başka bir yerde bulunabilir14,15,25. Liflerin dayanıklılığını göstermek için, glisatlı TA lif demetleri kullanarak basit bir mekanik protokolün temsili verilerini gösteririz(Şekil 5). 10 katılımcının biyopsilerinden 40 lif demeti aktivasyon çözeltisi26 (yüksek [Ca2+], pCa < 4.2) 2.7 m sarcomere uzunluğunda 60 saniye aktif olarak aktive edildi ve sabit hal aktif stres 100.71 ± 11 mN mm-2 (ortalama ± SEM) olarak ölçüldü.

Figure 1
Şekil 1: Bergström iğnesi. Bu çalışmada kullanılan Bergström iğnesi iğnenin kendisi(A-F),emme hortumu (G), ve şırınga(F)oluşur. Bergström iğnesi, iğne ucuna yakın bir penceresi olan bir dış iğneden(A)oluşur, iğnenin yukarı ve aşağı hareket eden daha küçük bir iç trokar(B)ve iğne penceresinden geçerken kas keser (C) bu kadar yukarı ve aşağı trochanter hareket eder iğne den kas kaldırmak için. Bu parçalar iğneyi hava geçirmez yapan bir yıkayıcı(D)ile ayrılır ve çubuk ve trokar arasındaki bir boşluk kas biyopsisinin ezilmesine karşı korur.E Son olarak, bir emme hortumu adaptörü takılır. İğne penceresiiçine kas çekmek için, bir emme hortumu(G)iğne adaptörü ve şırınga eklenir. Bu iğne havayı emer ve negatif basınç la kasçeker, örnek toplama için izin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Ultrason görüntüleme ve iğne yerleştirme. TA aponeuroses tarafından tanımlanan yüzeysel ve derin bölmeleri oluşur. TA ultrason probu distal-proksimal odaklı ile görüntülenir (A) ve medial-lateral (B) böylece TA 3D şekli tanınabilir. Toplama için ideal iğne derinliği yatay kesik çizgiler arasındadır. İğne eklemenin çizgi film gösterimi C ve D panellerinde gösterilmiştir. Kesi yapıldıktan sonra, iğne ilk kas dik konumlandırılmış ve iğne penceresi kas(C)kadar kas içine itti. İğne daha sonra bacağın uzun ekseni boyunca ~ 45 ° açı ya yönlendirilir ve daha fazla kas içine itti, iğne derin aponeurosis nüfuz etmez dikkat dikkat(D). İşlem sırasında canlı resimler(E, F)karikatüre(C, D)atıfta bulunularak verilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Katılımcı yerleştirme. Katılımcı, operasyon masasının üzerinde bir supine pozisyonda yer alar. Baş konfor için yükseltilebilir. Sağ ayak, ayağı hafifçe dorsiflexed tutan özel bir cihaz yerleştirilir, kas gerginliğini azaltarak. İşlemi izleyemesinler diye katılımcının önüne bir perde yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Kas dokusunun temsili görüntüleri. (A) Biyopsiden hemen sonra, kas örneği yağ dokusu ve bağ dokusu (panelde etiketlenmiş) dahil olmak üzere diğer dokulardan daha koyu kırmızı olacaktır. (B) Hasarlı/kısa (üst) ve uygun (aşağıda) lif demetleri olan numunelerin diseksiyonu. (C) Hasar belirtileri için yüzeyi incelemek için uygun bir lif gruplandırma büyütme. (D) 6-fiber demet bu lif demeti uzak (kolay hareket için 6-0 dikiş ile ucunda bağlı ve mekanik cihaz bağlı kesilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Bir lif demeti hazırlama temsilcisi kuvvet çıkışları. Liflerin dayanıklılığını göstermek için, glisatlı TA lif demeti (3 lif) kullanarak basit bir mekanik protokolün temsili stres verilerini gösteriyoruz. Toplamda, 10 katılımcının biyopsilerinden elde edilen 40 lif demeti bolluktan 2,7 μm sarcomere uzunluğa kadar uzatıldı ve stres-gevşemeye olanak sağlamak için tutuldu. Daha sonra,26 (gölgeli alan; yüksek [Ca2+], pCa < 4.2) 2.7 m sarcomere uzunluğunda 60 saniye aktif gerilimde aktif hale getirildi ve sabit hal aktif gerilimi 100.71 ± 11 mN mm-2 (ortalama SEM) olarak ölçüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu raporda, TA'dan yapısal olarak hasar görmemiş kas dokusubiyopsisi için bir teknik tanımlanmıştır. Biz bu prosedür kullanılabilir kas lifleri kabul edilebilir bir içerik verimleri bulundu (5-10 lif demeti preparatları başına 50 toplanan doku mg) mekanik testler için. Ayrıca mekanik, genetik ve proteomik deneylerin takibi için yeterli dokuya sahiptik.

Genellikle kas biyopsileri 3,,4,3,6,27,28toplanması için kullanılan çeşitli yöntemler vardır. Sözde açık biyopsi20 en kaliteli lifleri üretir, çünkü bir cerrah kasları tamamen ortaya çıkarır ve numuneyi parçalar. Tabii ki, açık cerrahi oldukça invaziv bir işlemdir ve açık ameliyatlar ile ilgili potansiyel riskler nedeniyle, ne olursa olsun araştırma soru, sağlıklı katılımcılar göndermek için uygun bir prosedür değildir. En az invaziv biyopsi yöntemi ince iğne biyopsisi29,30, doku toplamak için nispeten daha küçük bir iğne kullanır. İnce iğne biyopsileri liflerin genetik / kimyasal / protein bileşenleri üzerinde deneyler yapmak için yeterlidir30,31, ama genellikle lif kalitesi çok kötü, mekanik test zor veya imkansız hale getirir. Bergström iğne tekniği, yukarıda açıklanan iki işlem arasında iyi bir uzlaşmadır, çünkü ameliyat açık biyopsiden daha az invazivdir, ancak yine de ince iğne biyopsilerinden daha büyük ve (potansiyel olarak) daha sağlam kas örnekleri toplar. Bergström iğne prosedürü önceki raporlar3,5 bu tekniği öğrenmek için büyük kaynaklar ama vastus lateralis için sadece mevcut protokoller. Raporumuz, mekanik testler için yapısal olarak bozulmamış liflerin yüksek verimlerinin toplanması üzerinde odaklanan TA tekniğini göstermektedir.

Ta biyopsilerinin toplanması hakkında detaylı bir yayın bulunmamaktadır. Yine de, standart uygulama katılımcı supine koymak ve onları mümkün olduğunca bacak dinlenmek zorunda. Bu pozisyonda rahat ayak doğal olarak plantarflexed, sonuç olarak TA uzatır ve gerginlik içine koyar. Biz herhangi bir kas gerginliği daha zor biyopsi iğne içine kas sürücü yapar bulmak, negatif basınç bile, ve bu nedenle gerginlik mümkün olduğunca en aza indirilmelidir. Bunu başarmak için, basit ama önemli değişiklik burada biraz dorsiflexed pozisyonda ayak bileği muhafaza özel olarak inşa edilmiş bir ayak plakası kullanmak oldu (0 - 5 ° nötr, TA bolluk tutmak ve toplama iyileştirilmesi. Klinisyenler ayak bileği aşırı dorsiflex için dikkatli olmalıdır, TA kontrolsüz cereyan edecek gibi, ilk etapta prosedüre karşı tabii ki gerginlik, artan. Katılımcı genellikle bu kas aktivasyon hissedebilirsiniz, bu yüzden iletişim anahtarıdır. Protokollerden, TA verimleri sadece ~ 25% doku daha yaygın olarak kullanılan vastus lateralis ile karşılaştırıldığında, ~ 100 mg ve ~ 400 mg, sırasıyla. Bu nedenle, TA doku örneğinin istenilen araştırma projesi (ler) için yeterince büyük olup olmayacağını göz önünde bulundurarak doku toplama boyutunu en üst düzeye çıkarmak önemlidir. Biz ilk hemen sonra ikinci bir örnek alarak herhangi bir ekstra komplikasyon veya katılımcılar için iyileşme süresi neden olmadığını bulduk.

Protokol diğer kas biyopsilerine yönelik bazı rehberlik ler vermesine rağmen, kas seçimi uygun prosedürü belirleyecektir. Bu nedenle, diğer araştırmacılara ve klinisyenlere biyopsi yöntemlerini tam olarak yayınlamalarını öneriyoruz. Deneyimlerinden, biz kas seçimi için birkaç önemli faktör belirlemek, araştırma soru dışında. İlk olarak, cilde yüzeysel olan ve derin veya kolayca önlenebilir ana arterlere/sinirlere sahip kasları göz önünde bulundurmanızı öneririz. İkinci olarak, katılımcılar işlem sırasında uyanık olduğundan, biyopsi prosedürünün hasta için çok rahatsız olup olmayacağını, hastanın ilk konumlandırılması ndan veya biyopsi iğnesinin basıncından dolayı, aynı zamanda daha derin kasları rahatsız edici bir şekilde iter. Biz vastus lateralis ve pektoralis ile başarılı oldu. Diğer potansiyel seçenekler trapezius, latissimus dorsi, ve gastroknemius (yüksek vaskülarize ve kanama yatkın olmasına rağmen). Hamstring kasları mümkündür ama hasta için rahatsız, ve zor çünkü biyopsi toplarken yanal hareket.

Bergström iğneleri üretimlerden satın alınabilse de, bazı laboratuvarlar kendi iğnelerini özel olarak yapar. Küçük, henüz akıllı, tasarım ayarlamaları uzun ve hasarsız kas liflerinin verimini artırabilir. Örneğin, burada kullanılan iğnenin toplama penceresi 7 mm x 5 mm (uzunluk x genişliği) idi. Bu kas küpü yakalamak için uygundur. Ancak, amaç uzun ve hasarsız lifleri (aynı hacimde) toplamaksa, uzunluk artırılabilir ve genişlik azaltılabilir (örn. 10 mm x 3,5 mm). İğne fasikül yönü boyunca yönlendirilirse, o zaman bu iğne uzun lif bölümleri toplamak olasıdır.

Kas biyopsileri genellikle güvenli bir ultrason görüntü rehberliği olmadan toplanır, vastus lateralis gibi büyük kaslar için özellikle. Bu durumda, düzgün deneyimli bir hekim kolayca en iyi kesi bölgesini bulmak için kas palpe edebilirsiniz. Ancak, hekim daha az hedef kas ile deneyimli olduğunda, ya da ekstra bakım büyük sinirler veya kan damarları önlemek için garanti edilir, ultrason büyük ve sadece uygulanan bir araçtır. Son olarak, biyopsi alanının post-op izleme hızlı bir ultrason yardımı ile gerçekleştirilebilir.

Pediatrik biyopsiler kesinlikle mümkündür ve yaygın olarak32,33,34. Ancak, yordamda genellikle birkaç değişiklik yapılır. Daha küçük bir ölçü iğnesi ve bilinçli sedasyon genellikle gereklidir ve prosedür bir hastane ortamında gerçekleşir. Genel olarak, deneyim sağlıklı pediatrik katılımcılar dahil etmek isteyen bir çocuk ve araştırma grupları için travmatik olabilir dikkatle çalışmanın potansiyel yararları karşı bu tartmak gerekir.

Lif demetleri veya kullanılmayan malzeme, lif mekaniğinden önce veya sonra diğer deneylere aktarılabilir. Örneğin, sarkoerik protein içeriğini değerlendiren veya izoform tipini sınıflandıran teknikler35'teyapılabilir. Ancak, protein bozulmasını sınırlamak ve analiz başarısını artırmak için, doku sıvı nitrojen de orijinal ekstraksiyon sonra, mekanik değerlendirme hemen sonra dondurulmuş flaş veya protein analizi için hemen işlenmiş olmalıdır. Lifler de immünohistokimya veya diğer görüntüleme teknikleri için hazırlanabilir36 lif içinde protein konumunun değerlendirilmesi için izin. Bu durumda, lifler fiksatif bir çözeltiye yerleştirilebilir (örneğin, pH 7'de fizyolojik tamponda %4 paraformaldehit/%0.25 glutaraldehit; immünohistokimya için glutaraldehit yok) mekanik test cihazında iken, sarkoerik yapıları istenilen sarcomere uzunluğunda korur. Mümkünse, orijinal biyopsi küçük bir parça hasat edilebilir, 10 dakika toplama çözeltisi şiddetle yıkanır ve daha sonra fiksatif çözelti içine yerleştirilir. Birçok grup, zararlı buz kristallerinin oluşumunu sınırlayan ve görsel değerlendirmeler için görüntü kalitesini artıran isopentane'de taze çekilmiş numuneleri hemen flaş dondurmayı tercih eder. Bu gerçekten flaş dondurma için altın standarttır; ancak, azot donma buz kristali hasarı sadece ekstra-miyofibril yapılar odaklanmış tır. Sıvı nitrojen de dondurulmuş örneklerde sarkoerik bileşenlerin tatmin edici yapısal bütünlüğü var, ve bu nedenle azot bir olasılık olduğunu düşünüyorum, özellikle daha kolay kullanılabilir, ya da cerrahi ekip / yerel kimyasal otorite isopentane kullanmak istemiyor. Görüntüleme için örnek hazırlama ile önemli ve genellikle bildirilmeyen bir sorun sarcomeres genellikle sözleşmeli / kısa, sarcomere kısa veya gözlemlenemeyen I-band bölgesi ile olmasıdır. Bunu aşmak için, araştırmacı elle sabitleme den önce lif örnekleri (test cihazı veya el ince cımbız kullanarak) germek gerekir. Genel bir kural olarak, düşük kalsiyum fizyolojik rahatlatıcı bir çözeltide ~3,2 μm sarcomere uzunluğuna (lazer kırınımı ile ölçülen) veya düşük kalsiyum fizyolojik rahatlatıcı çözeltide bolluk uzunluğunun ~%150'sine kadar uzanıyoruz. Son olarak, RNA ifade analizi için alt numuneler isteniyorsa, flaş dondurma yöntemi sonuçları etkilemez, ancak numuneler orijinal ekstraksiyondan hemen sonra dondurulmalı ve RNA çok kararsız olduğu için -80 °C'lik bir derin dondurucuya yerleştirilmelidir. Piyasada bazı RNA koruma depolama çözümleri vardır, ancak bunların kullanımı ile karışık sonuçlar bulduk, ve sadece flaş dondurma taze örnekleri.

Bir deneme sırasında toplanan bilgi miktarını en üst düzeye çıkarmak için, mekanik testler yaparken diğer verilerin eşzamanlı olarak toplanması tamamlanabilir. Örneğin, sarkoerik yapıların çalışma düşük açılı X-ışını kırınım görüntüleme kullanılarak mekanik testler sırasında yapılabilir, diğer hayvanlarda olduğu gibi37,38. Genetik deneyler için, dna / RNA proteinlere göre nispeten daha az kararlı olduğu için, bu amaç için hemen veya flaş dondurulmuş için ekscb'li kas işlenmesi gerekir.

Bazı sınırlamalar zaten yukarıda açıklanmıştır. Burada prosedürün kendisini tartışıyoruz. Çoğu grup için büyük bir sınırlama uygun biyopsi toplama eğitimli bir ekip üyesi olmasıdır. Ne olursa olsun kişinin mesleği (doktor, tıbbi asistan, teknisyen, ya da başka), araştırmacı körü körüne iğne sürücüler ve doğru iğne penceresi bulmak için "hissediyorum"3,,28 güvenmek gerekir, çünkü bu işlem zordur. Biyopsiler için rıza insan katılımcılar Seyrek olduğu için hatalar tolere edilemez, bir biyopsi birçok tercih edilir, ve hatalar vasküler veya sinir hasarına yol açabilir. Bu nedenle, herhangi bir eğitim olanakları bir insan biyopsisi yapıldı önce tamamlanmalıdır. Örneğin, iğne sürüş için bir "his" kazanmak için, deri hala bağlı domuz eti en bakkalsatın alınabilir ve insan cilt ve kas için bir proxy olarak kullanılır. Bir diğer değerli deneyim de eğitimli bir araştırma grubunu gölgelemektir.

Katılımcıların ağrılarını/rahatsızlıklarını daha niteliksel olarak değerlendirdik, algılanan acıyı değerlendirmek için hekimin deneyimlerine ve katılımcıyla yaptığı konuşmalara güvenerek. Ancak, ağrı ve biyopsi sonrası rahatsızlık değerlendirilmesi daha nicel ve doğrulanmış ağrı / rahatsızlık anketleri kullanımı ile bireyler ve çalışmalar arasında karşılaştırılabilir olabilir. Bu noktalar literatürde şaşırtıcı derecede az tedavi var. Ancak, yeni bir çalışmada ağrı39iyi kurulmuş anketler kullanarak, önce katılımcı ağrı / rahatsızlık ölçmek için bir yol sundu, sırasında, ve biyopsiler sonra. Biz bu kağıt hedef kas olarak vastus lateralis kullanılan dikkat, ve bu nedenle çalışmalar kaslar arasında ağrı değerlendirme karşılaştırmak için gerekli olan.

Ekstraksiyon yöntemi ne olursa olsun, Bergström tekniği lifler çok uzun olduğu için kastaki lifin toplam uzunluğunu çıkaramaz (~6-8 cm TA40, ~6.5-8 cm vastus lateralis40). Bu nedenle, toplanan lif uzun bir parça için, uçları biyopsi tekniği ile tahrip kaçınılmazdır. Genellikle, bir lif kullanılabilir merkezi kısmı küçük ve bu yüzden mekanik test etmek zordur. Teknik oldukça uzun merkezi bölgeler (3-5 mm) sağlasa da, araştırmacı, hasarlı liflerin kullanımı pasif veya aktif kuvvet çıkışlarını değiştireceği için diseksiyon sırasında lif demetlerinin kalitesini dikkatle kontrol etmelidir. Başarılı biyopsilerin görsel gözlemi, biyopsi işleminden zarar görmemiş liflerin bir kısmını gösterir. Geleneksel bir diseksiyon ışığı mikroskobundan bakıldığında, liflerin yüzeyi delik veya gözyaşı olmadan pürüzsüz görünecektir(Şekil 4). Ayrıca, lifler silindirik bakmak gerekir ve hiçbir düzleştirilmiş alanları var. Görünür olmamasına rağmen, kas kendisi çıkarma hemen sonra kas proteinlerini yıkmak için başlar doğal olarak meydana gelen proteazlar nedeniyle zaman içinde bozulacaktır. Bu nedenle, lifler ile kullanılan tüm çözeltiler proteaz inhibitörleri eklemek için önemlidir. Ayrıca, mümkün olduğunca çok kan çıkarmak için biyopsi ekstra yıkar öneririz.

Dikkatli hazırlık bile, lif hasarı oluşabilir ve kötü lif aktivasyonları yol açabilir. Lifler prosedürün hemen hemen her parçası için çok hassas olduğu için lif hasarı için birçok nedeni vardır. Örneğin, biyopsi sırasında, trokar yeterince keskin değilse, bu esneme ve lifleri yok keserek yerine çıkarma sırasında kas dokusu içine itebilir. Lifler ozmotik değişikliklere, pH'a ve sıcaklığa duyarlı olduğundan toplama çözeltisi uygun şekilde hazırlanmalıdır. Lifleri kullanırken, lifler üzerindeki basıncı tamamen sınırlamak için büyük özen gerekir. Bunun yerine, cımbız onun bağ dokusu ile biyopsi kapmak için kullanılmalıdır. Başka bir alternatif biyopsi kullanılmayan bir ucunu sarmak ve daha sonra işleme bu kapmak için bir boyut 0-7 ipek dikiş kullanmaktır. Son olarak, gliserol iki rol hizmet vermektedir: ilk -20 °C iken donma kas tutmak için ve ikinci lif için hafif bir deterjan olmaktır. Yani, gliserol dış çözeltiler için lif permeabilizes, kalsiyum akını için izin (bir aktivasyon çözeltisi yoluyla). Çoğu kas için, bu işlem ~ 10 gün sürer. Ancak, kollajen içeriği ve örnek boyutumiktarına bağlı olarak, bu kadar sürebilir 6 hafta. Lifler mekanik deneyler sırasında meydana gelen herhangi bir yüksek kalsiyum aktivasyonu için permeabilized olmalıdır. Lifler genellikle en az 3 ay kullanılabilir. Lif atıklarını sınırlamak için, DAHA uzun bir permeabilizasyon bekleme süresi (4-6 hafta) TA kas lifleri için önerilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Michaela Rau, Lea-Fedia Rissmann, Michael Marsh, Janina-Sophie Tennler, Kilian Kimmeskamp ve Wolfgang Linke'e projeye yardımcı olduklarından dolayı teşekkür ederiz. Bu projenin finansmanı MERCUR Vakfı (ID: An-2016-0050) tarafından DH'ye sağlanmıştır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe B. Braun Melsungen AG
Carl-Braun-Straße 1
34212 Melsungen, Hessen
Germany
 		 4606027V Drug administration
5mm Berstöm needle homemade N/A Tissue collection. Similar to other Berstöm needles
Acrylastic BSN medical GmbH
22771 Hamburg		 269700 elastic compression bandage
Complete protease inhibitor cocktail Roche Diagnostics, Mannheim, Germany 11836145001 Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue.
Cutasept PAUL HARTMANN AG
Paul-Hartmann-Straße 12
89522 Heidenheim
Germany		 9805630 Disenfectant spray for the skin
Leucomed T plus BSN medical GmbH
22771 Hamburg		 7238201 Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection
Leukostrip Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road,
Hull
Great Britain		 66002876 wound closure
Surgical disposable scalpels Aesculap AG
Am Aesculap-Platz
78532 Tuttlingen
Germany		 BA200 series Incision
Unihaft cohesive elastic bandage BSN medical GmbH
22771 Hamburg		 4589600 cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact
Xylocitin 2% with Epinephrin Milbe GmbH
Münchner Straße 15
06796 Brehna
Germany		 N/A Controlled substance anesthesia, vasoconstriction

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Franchi, M., et al. Architectural, functional and molecular responses to concentric and eccentric loading in human skeletal muscle. Acta Physiologica. 210 (3), 642-654 (2014).
  2. Duchene, G. B. A. De la paralysie musculaire pseudo-hypertrophique, ou paralysie myo-sclérosique / par le Dr Duchenne (de Boulogne). Archives of General Internal Medicine. 11 (30), (1868).
  3. Shanely, R. A., et al. Human skeletal muscle biopsy procedures using the modified Bergström technique. Journal of Visualized Experiments. (91), e51812 (2014).
  4. Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine and Science in Sports and Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
  5. Bergstrom, J. Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35 (7), 609-616 (1975).
  6. Baczynska, A. M., et al. Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome. Journal of Visualized Experiments. (109), e53075 (2016).
  7. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
  8. Buck, E., et al. High-resolution respirometry of fine-needle muscle biopsies in pre-manifest Huntington's disease expansion mutation carriers shows normal mitochondrial respiratory function. Plos One. 12 (4), 01175248 (2017).
  9. Murgia, M., et al. Single Muscle Fiber Proteomics Reveals Fiber-Type-Specific Features of Human Muscle Aging. Cell Reports. 19 (11), 2396-2409 (2017).
  10. Friedmann-Bette, B., et al. Effects of strength training with eccentric overload on muscle adaptation in male athletes. European Journal of Applied Physiology. 108 (4), 821-836 (2010).
  11. McPhee, J. S., et al. The contributions of fibre atrophy, fibre loss, in situ specific force and voluntary activation to weakness in sarcopenia. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 73 (10), 1287-1294 (2018).
  12. Nocella, M., Cecchi, G., Bagni, M. A., Colombini, B. Force enhancement after stretch in mammalian muscle fiber: no evidence of cross-bridge involvement. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (12), 1123-1129 (2014).
  13. Patel, J. R., McDonald, K. S., Wolff, M. R., Moss, R. L. Ca2+ binding to troponin C in skinned skeletal muscle fibers assessed with caged Ca2+ and a Ca2+ fluorophore. Invariance of Ca2+ binding as a function of sarcomere length. The Journal of Biological Chemistry. 272 (9), 6018-6027 (1997).
  14. Hessel, A. L., Joumaa, V., Eck, S., Herzog, W., Nishikawa, K. C. Optimal length, calcium sensitivity and twitch characteristics of skeletal muscles from mdm mice with a deletion in N2A titin. The Journal of Experimental Biology. 222, Pt 12 (2019).
  15. Joumaa, V., Herzog, W. Calcium sensitivity of residual force enhancement in rabbit skinned fibers. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (4), 395-401 (2014).
  16. Joumaa, V., Rassier, D. E., Leonard, T. R., Herzog, W. The origin of passive force enhancement in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 294 (1), 74-78 (2008).
  17. Hilber, K., Galler, S. Mechanical properties and myosin heavy chain isoform composition of skinned skeletal muscle fibres from a human biopsy sample. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 434 (5), 551-558 (1997).
  18. Miller, M. S., et al. Chronic heart failure decreases cross-bridge kinetics in single skeletal muscle fibres from humans. The Journal of Physiology. 588, Pt 20 4039-4053 (2010).
  19. Pinnell, R. A. M., et al. Residual force enhancement and force depression in human single muscle fibres. Journal of Biomechanics. 91, 164-169 (2019).
  20. Einarsson, F., Runesson, E., Fridén, J. Passive mechanical features of single fibers from human muscle biopsies--effects of storage. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 3, 22 (2008).
  21. Flann, K. L., LaStayo, P. C., McClain, D. A., Hazel, M., Lindstedt, S. L. Muscle damage and muscle remodeling: no pain, no gain. The Journal of Experimental Biology. 214, Pt 4 674-679 (2011).
  22. Commission for Hospital Hygiene and Infection Prevention (KRINKO), Federal Institute for Drugs and Medical Devices (BfArM). Anforderungen an die Hygiene bei der Aufbereitung von Medizinprodukten [Hygiene requirements for the reprocessing of medical devices]. Bundesgesundheitsblatt, Gesundheitsforschung, Gesundheitsschutz. 55 (10), 1244-1310 (2012).
  23. Koch-Institut, R. Ergänzung zur Empfehlung Anforderungen an die Hygiene bei der Aufbereitung von Medizinprodukten. RKI-Bib1. , Robert Koch-Institut. (2018).
  24. Rutala, W. A., Weber, D. J. Disinfection and sterilization in healthcare facilities. Practical Healthcare Epidemiology. , 58-81 (2018).
  25. Rassier, D. E., MacIntosh, B. R. Sarcomere length-dependence of activity-dependent twitch potentiation in mouse skeletal muscle. BMC Physiology. 2, 19 (2002).
  26. Mounier, Y., Holy, X., Stevens, L. Compared properties of the contractile system of skinned slow and fast rat muscle fibres. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 415 (2), 136-141 (1989).
  27. Henriksson, K. G. Semi-open muscle biopsy technique. A simple outpatient procedure. Acta Neurologica Scandinavica. 59 (6), 317-323 (1979).
  28. Dietrichson, P., et al. Conchotome and needle percutaneous biopsy of skeletal muscle. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 50 (11), 1461-1467 (1987).
  29. Iachettini, S., et al. Tibialis anterior muscle needle biopsy and sensitive biomolecular methods: a useful tool in myotonic dystrophy type 1. European Journal of Histochemistry. 59 (4), 2562 (2015).
  30. Cotter, J. A., et al. Suction-modified needle biopsy technique for the human soleus muscle. Aviation, Space, and Environmental Medicine. 84 (10), 1066-1073 (2013).
  31. Edwards, R. H., Round, J. M., Jones, D. A. Needle biopsy of skeletal muscle: a review of 10 years experience. Muscle & Nerve. 6 (9), 676-683 (1983).
  32. Gibreel, W. O., et al. Safety and yield of muscle biopsy in pediatric patients in the modern era. Journal of Pediatric Surgery. 49 (9), 1429-1432 (2014).
  33. Cuisset, J. M., et al. Muscle biopsy in children: Usefulness in 2012. Revue Neurologique. 169 (8-9), 632-639 (2013).
  34. Nilipor, Y., et al. Evaluation of one hundred pediatric muscle biopsies during a 2-year period in mofid children and toos hospitals. Iranian Journal of Child Neurology. 7 (2), 17-21 (2013).
  35. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  36. Wang, K., Wright, J. Architecture of the sarcomere matrix of skeletal muscle: immunoelectron microscopic evidence that suggests a set of parallel inextensible nebulin filaments anchored at the Z line. The Journal of Cell Biology. 107 (6), 2199-2212 (1988).
  37. Ma, W., Gong, H., Irving, T. Myosin head configurations in resting and contracting murine skeletal muscle. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
  38. Ma, W., Gong, H., Kiss, B., Lee, E. J., Granzier, H., Irving, T. Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle. Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).
  39. Bonafiglia, J. T., et al. A comparison of pain responses, hemodynamic reactivity and fibre type composition between Bergström and microbiopsy skeletal muscle biopsies. Current Research in Physiology. 3, 1-10 (2020).
  40. Wickiewicz, T. L., Roy, R. R., Powell, P. L., Edgerton, V. R. Muscle architecture of the human lower limb. Clinical Orthopaedics and Related Research. (179), 275-283 (1983).

Tags

Biyoloji Sayı 163 Tibialis anterior kas biyopsisi ultrason insan lif mekaniği biyomekanik modifiye Bergström tekniği
Mekanik Değerlendirme için İnsan Musculus Tibialis Anterior Üstün Bölmesi İskelet Kas Biyopsileri Toplama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hessel, A. L., Hahn, D., de… More

Hessel, A. L., Hahn, D., de Marées, M. Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation. J. Vis. Exp. (163), e61598, doi:10.3791/61598 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter