Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

منصة غشاء نموذج لإعادة تشكيل ديناميات غشاء الميتوكوندريا

Published: September 2, 2020 doi: 10.3791/61620
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Chemistry, University of Akron, 3Department of Genetics, Harvard Medical School

Summary

الانصهار الميتوكوندريا هو رد فعل هام في الحالة المثلية الكامنة في ديناميات الميتوكوندريا. هو موضح هنا هو نظام إعادة تشكيل في المختبر لدراسة الميتوكوندريا الداخلية الغشاء الانصهار التي يمكن حل الربط الغشاء، والالتحام، hemifusion، وفتح المسام. وتناقش براعة هذا النهج في استكشاف أنظمة غشاء الخلية.

Abstract

ديناميات الميتوكوندريا أمر ضروري لوظائف الجهاز المتنوعة والاستجابات الخلوية. الغشاء الميتوكوندريا المزدحم والمعقد مكانياً هو بيئة صعبة للتمييز بين العوامل التنظيمية. يمكن أن تساعد السيطرة التجريبية على مكونات البروتين والدهون في الإجابة على أسئلة محددة للتنظيم. ومع ذلك، فإن التلاعب الكمي بهذه العوامل يشكل تحدياً في عمليات الفحص الخلوي. للتحقيق في الآلية الجزيئية للدمج داخل الغشاء الميتوكوندريا، قدمنا منصة إعادة تشكيل في المختبر الذي يحاكي البيئة الدهنية للغشاء الداخلي الميتوكوندريا. هنا نحن وصف خطوات مفصلة لإعداد ثنائيات الدهون وإعادة تكوين بروتينات غشاء الميتوكوندريا. سمحت المنصة بتحليل الوسيطات في الانصهار الداخلي للغشاء الميتوكوندريا، والحركيات للتحولات الفردية، بطريقة كمية. يصف هذا البروتوكول تلفيق الطبقات الثنائية ذات التركيب غير المتماثل للدهون ويصف الاعتبارات العامة لإعادة تكوين بروتينات التعقيب إلى طبقة ثنائية مُوسَّدة. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة أنظمة الأغشية الأخرى.

Introduction

غشاء تقسيم هو السمة المميزة للخلايا eukaryotic1 (الشكل 1A). الأغشية البيولوجية هي المعترف بها على نحو متزايد باعتبارها أكثر من مذيب ثنائي الأبعاد، وتعتبر بيئة تلعب أدوارا حاسمة في تنظيم وظيفة البروتين ومجمعات الماكرو الجزيئاتالمجمعة 2،3. الدهون الأصلية هي يغاندس التي تنظم نشاط البروتين الغشائي3,4. التنظيم المكاني غشاء وقدرة الأغشية على أن تكون منحوتة في أشكال متنوعة هي الخصائص الفيزيائية الهامة لاختيار وظائف جديدة3،5.

منصات غشاء نموذج هي نظم المحاكاة الحيوية التي يمكن أن تساعدنا على فهم بنية الغشاء الخلوية، وديناميات، ودالة6،,7،,8. أغشية النموذج عادة ما تشمل خليط من الدهون تكوين واضح المعالم، مع خصائص بيوفيزيائية محددة (صلابة، سمك، ومرونة). إلى جانب التصوير المفلور، تسمح منصات الغشاء النموذجي بإجراء تحليل كمي لهيكل الغشاء والوظائف9و10,,و11. وقد استخدمت استراتيجيات إعادة تشكيل ثنائي الطبقات الدهون لدراسةالانصهارالغشاء 9 -10،الانصهار غشاء الحمض النووي بوساطة12، والانصهار الفيروسي11،13. ومن مزايا هذه الأساليب إمكانية الحصول على معلومات حركية عن الخطوات الوسيطة التي تسبق حدث رد فعل يمكن ملاحظته14.

وقد درس غشاء البلازما على نطاق واسع باستخدام أغشية نموذج. Bilayers مع فصل مرحلة الدهون وقد وضعت لدراسة هياكل طوف الدهون الهامة في الإشارات الخلوية11،15،16. Micropatterned الدهون ثنائية الطبقات17,18 وقد استخدمت للتحقيق في تنظيم مستقبلات الخلايا. وقد استخدمت البوليمر أو الأغشية المعتمدة هلام كأنظمة المحاكاة الحيوية لدراسة منظمة غشاء-cytoskeleton، غشاء تقسيم البروتين أثناء إشارات الخلية، والهجرة في اتصالات الخلية الخلية19.

كما يتم تطبيق أنظمة الأغشية الاصطناعية لدراسة العضيات دون الخلوية20. تتميز العضيات بـ morphologies المميزة التي تخلق بيئات فرعية متميزة. شبكة إندوبلاسميك (ER) شبكة (ER) هو مثال واحد. عند إعادة تشكيل الـ reticulons في ليبوسومات، يتم تشكيل هياكل الغشاء الأنبوبي مع خصائص مشابهة لـ ERالخلوية 21. إضافة أطلستين، بروتين الانصهار ER، يمكن أن تحفز أنابيب الدهون من liposomes لتشكيل شبكة20. هذا هو مثال واحد لكيفية proteoliposomes يمكن أن توفر نظرة وظيفية في مورفولوجيا الجهازية والديناميات.

الانصهار الغشاء الميتوكوندريا والانشطار ضرورية لصحة السكان الميتوكوندريا22,23,24,25. مجموعة من dynamin الأسرة GTPases يحفز الميتوكوندريا غشاء الانصهار. mfn 1/2 يحفز الانصهار الخارجي للغشاء. Opa1 يتوسط داخل الغشاء الانصهار26 (الشكل 1B). Opa1 له شكلان: شكل طويل (l-Opa1)، عبر الميمبرين الراسية على الغشاء الداخلي الميتوكوندريا، وشكل قصير "قابل للذوبان" (s-Opa1)، موجود في الفضاء intermembrane. يتم تنظيم نسبة من أشكال Opa1 اثنين من النشاط من اثنين من proteases, Oma1 و Yme1L27,28,29,30. أسئلة هامة في تنظيم Opa1 تشمل: كيف أن شكلين من Opa1، (قصيرة وطويلة) توسط الانصهار الغشاء والتفاعل التنظيمي28،29،31،32،33.

هنا نحن وصف استراتيجية إعادة تشكيل تطبيقها بنجاح للتحقيق في الاندماج داخل الغشاء الميتوكوندريا التي أوضحت أدوار ل- وS-Opa1 في الانصهار داخل الغشاء. قمنا بتطوير منصة تحاكي الغشاء الداخلي الميتوكوندريا باستخدام ثنائية الدهون البوليمر المربوطة و 200 نانومتر يونيميللار vesicles. فوائد حبل البوليمر تحت ثنائي الدهون وتشمل ما يلي. أولاً، يحافظ على بروتين الأراضي المُرَمَرَس المعاد تشكيله، والذي قد يتعطل لولا ذلك بسبب القرب من الشريحة الزجاجية34. ثانيا، فإنه يخدم طبقة المياه السميكة بين ثنائي الدهون وركيزة الزجاج، مما يسهل الدراسات من فتح المسام9، وثالثا طبيعة اللزوجة من البوليمر PEG يسمح غشاء انحناء التغييرات35. استخدمنا التصوير المفلور ثلاثي الألوان لتوصيف الخطوات في الانصهار الغشاء(الشكل 1C-F).

Figure 1
الشكل 1: رصد الانصهار الغشاء الميتوكوندريا.
(أ)العضيات هي مقصورات الغشاء الخلوي. (ب) الخطوات المتتابعة من الانصهار غشاء الميتوكوندريا. يتم تحفيز الانصهار في الغشاء الخارجي للميتوكوندريا بواسطة Mfn1 و /أو Mfn2 ، في حين يتم توسط الانصهار داخل الغشاء بواسطة Opa1. (C-F) التخطيطي لمنصة إعادة تشكيل في المختبر لدراسة الانصهار غشاء الميتوكوندريا. تتضمن المنصة جزأين: بروتيوليبوس وbilayer الدهون المربوطة بالبوليمر ، وكلاهما مع l-Opa1 المعاد تشكيلها. تساعد تسميات الفلورسنت، بما في ذلك نوعان مختلفان من الأصباغ الفلورية وعلامة المحتوى، في تمييز الخطوات أثناء الانصهار الغشاء. علامة الغشاء اثنين (Cy5-PE (الأحمر) و TexasRed PE (البرتقالي) جعل زوج فريت، والتي يمكن أن تقدم تقريرا عن الالتحام غشاء وثيق. نشر TexasRed-PE أن تسميات proteoliposome هو مؤشر على نصف الدهون (هدم). يتم مراقبة إصدار المحتوى من خلال إزالة نقش إشارة الكالسين (الموضح باللون الأخضر). تم إنشاء اللوحات A و B باستخدام Biorender. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

1- إعداد مخاليط الدهون

  1. إعداد محلول الأسهم الدهنية عن طريق حل 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3phosphocholine (DOPC)، 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (POPE)، L-α-phosphatidylinositol (الكبد PI)، cardiolipin، و 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-فوسفوثينولامين-N-[ميثوكسي(بولي ايثيلين جلايكول)-2000] (18:1 PEG2000 PE) في الكلوروفورم بتركيز 25 ملغ/مل. قم بذوبان الدهون ذات الصبغة الفلورية (تكساسريد DHPE و Cy5 DOPE) كلوروفورم بتركيز 1 ملغ/مل. تخزين محلول الدهون في قارورة العنبر مع بطانة مقاومة الكلوروفورم، مختومة كذلك مع الشريط متعددtetrafluoroethylene. يمكن الاحتفاظ بالمحل عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  2. جعل الحلول A و B.
    1. مزيج الدهون لإعداد الحل A (التركيز النهائي 1 ملغ / مل) الذي يحتوي على DOPC (52.8 مول٪) ، POPE (20 مول ٪) ، الكبد PI (7 مول٪ ) و cardiolipin (20 مول٪),و 0.2 mol٪ فلوريفورو.
    2. جعل الحل باء (التركيز النهائي 1 ملغ / مل) التي تحتوي على DOPC (47.8 مول٪)، POPE (20 مول٪) ، PI الكبد (7 مول٪) ، cardiolipin (20 مول٪) و DOPE-PEG2000 (5 مول٪)، و 0.2 مول فلوروهور.
    3. توليد خليط الدهون عن طريق إضافة حجم محسوب من محلول التخزين في قارورة العنبر باستخدام حقنة الزجاج. طابق حجم النهائي بإضافة الكلوروفورم إضافية في قوارير.
      ملاحظة: بالنسبة ل FCS (التحليل الطيفي للارتباط الفلوري)، قم بتقليل نسبة الدهون المترافقة بالصبغة إلى 0.002 مول٪ واستبدال الباقي بـ DOPC.

2. تلفيق ثنائيات الدهون

  1. خبز المجهر الشرائح الزجاجية في 520 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الخبز، تهدئة الشرائح الغطاء إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. تزن حوالي 10 غرام من هيدروكسيد الصوديوم وإضافة إلى 500 مل من الميثانول مع اثارة. اثارة ل 2 ساعة، والاستمرار في إضافة هيدروكسيد الصوديوم في المحلل حتى يبدأ الترسبات تظهر. تأكد من ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة خلال العملية بأكملها.
  3. تنظيف الشرائح الزجاجية في 10٪ محلول دوديسيل الصوديوم كبريتات؛ الميثانول المشبعة هيدروكسيد الصوديوم; و 50 mM حمض الهيدروكلوريك، بالتسلسل (حمام سونيكيشن تحت كل شرط لمدة 30 دقيقة). تنظيف الشريحة الزجاجية في الماء فائقة الpure لمدة 10 دقيقة بين كل حالة.
    ملاحظة: على الرغم من أنه يوصى بشدة باستخدام حلول جديدة لإعداد الشرائح الزجاجية، يمكن إعادة استخدام كل حل حتى 5x أو في غضون شهر واحد، أيهما يأتي أولاً. تأكد من إثارة مزيج الحل قبل كل استخدام.
  4. تخزين الزجاج غطاء تنظيفها مختومة في حل HCl تصل إلى 2 أسابيع لضمان نوعية ثنائية الطبقات جيدة. إذا تم تخزينها في الماء فائق الخطورة، استخدم الشرائح في غضون أسبوع.
  5. تنظيف الحوض الصغير متعدد الاثيلين من نظام غمس Langmuir-Blodgett باستخدام الكلوروفورم والمياه فائقة السخ حتى يلاحظ لا التبول على الحوض الصغير. رش الكلوروفورم على سطح الحوض الصغير، مسح جيدا مع السليلوز مناديل 3x. شطف مع الماء فائقة الخطورة وإزالة المياه عن طريق الشفط. كرر 3x.
  6. غطي سطح الحوض الصغير بالماء النقي.
  7. خذ قطعتين من زجاج الغطاء المعالج السطحي من محلول التنظيف أو الماء فائق الخطورة، وشطف الشريحة الزجاجية بالماء فائق الخطورة لمدة 30 s تقريبًا.
  8. ضع زجاج الغطاء بطريقة من الخلف إلى الخلف. استخدام المشبك الركيزة لعقد الشرائح الزجاجية. غمر الشريحة الزجاجية تحت سطح الماء بالنقر يدويًا على "الغطاس لأسفل" على برنامج التحكم في Langmuir.
  9. صفر توازن الفيلم، ونشر بعناية الحل B قطرة قطرة في واجهة الهواء والماء(الشكل 2A). تأكد من أن الدهون تنتشر فقط في واجهة الهواء والماء، مع عدم وجود قطرات كلوروفورم والدهون تغرق إلى الجزء السفلي من سطح البوليتيترافلورو إيثيلين.  الفشل في ضمان هذا سيخلق "قناة" الدهون ومنع تشكيل monolayer.
  10. وقف إضافة الدهون حتى الفيلم رصيد قراءات حول ~ 15-20 م/ م، والانتظار ل ~ 10-15 دقيقة. بدء وحدة تحكم الحاجز لتغيير مساحة السطح عن طريق النقر على "بدء التجارب"، حتى قراءة توازن الفيلم إلى 37 mN/ m. الحفاظ على الضغط لمدة ~ 20-30 دقيقة(الشكل 2B).
  11. رفع غطاء الزجاج في سرعة 22 مم / دقيقة مع الحفاظ على التوتر السطحي عند 37 mN / m. وسيتم نقل monolayer الدهون مع الربط البوليمر من واجهة الهواء والماء إلى سطح الزجاج غطاء من خلال عملية غمس Blodgett (الشكل 2C). هذا يشكل نشرة أسفل من ثنائي الدهون.
  12. تنظيف واجهة الهواء والماء عن طريق الشفط، شطف الحوض الصغير مع الماء فائقة الpure.
  13. قم بتنظيف شريحة زجاجية ذات رفاهية واحدة (مثل شريحة شايفر) باستخدام الكلوروفورم والإيثانول والماء فائق السخ قبل الاستخدام. تعيين الشريحة الزجاجية النظيفة على الحوض الصغير مع الماء فائقة الpure تحت طبقة المياه. تأكد من أن البئر يواجه واجهة الهواء والماء وصب الماء النقي فائق ال قرب حتى يتم تغطية الشريحة الزجاجية بالكامل. كرر الخطوة 2.8.
  14. عقد غطاء الزجاج مع monolayer الدهون من الخطوة 2.4 باستخدام كوب شفط السيليكون (تأكد من جانب monolayer بعيدا عن كوب الشفط)، ودفع بلطف monolayer الدهون إلى واجهة الهواء والماء، وعقد الزجاج غطاء ل~ 2-3 s في واجهة، ثم دفع الزجاج غطاء ضد الشريحة(الشكل 2D). أخرج الشريحة بشريحة غلاف.
    ملاحظة: سيتم عقد bilayer الدهون في سطح غطاء الزجاج التي تواجه المنطقة تقع بين الشرائح اثنين (الشكل 2E).
  15. خذ غطاء الزجاج مع bilayer إلى مجهر epifluorescence. صورة ثنائية الدهون. إذا لوحظ توزيع متجانس للصبغة الدهنية، photobleach مساحة صغيرة من bilayer لمدة 30 ثانية، إيقاف مصدر الضوء ل~ 30 s-1 دقيقة، ثم صورة مرة أخرى لمراقبة الانتعاش. سوف تظهر طبقة الدهون الانتعاش fluorescence.
    ملاحظة: لا ينبغي استخدام الأغشية التي بها عيوب أو استعادة الفلورسينس سيئة لإجراء المزيد من التجارب.

Figure 2
الشكل 2: خطوات في صنع ثنائي الدهون البوليمر المربوطة.
خطوات صنع ثنائيات الدهون باستخدام Langmuir-Blodgett غمس (A -C) وLanmuir - شيفر نقل (D)التقنيات. (E) النهائي "ساندويتش" تحتوي على ثنائية الدهون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. البروتين إعادة تشكيل في البوليمر- المربوطة الدهون ثنائي الطبقات

  1. إعداد طبق تبلور يحتوي على المياه فائقة السخ. إعداد حلقة صورة المجهر نظيفة ومكان تحت الطبق.
  2. تزج "ساندويتش" من شريحة شايفر وغطاء الزجاج التي تحتوي على ثنائي الدهون تحت الماء، وفصل بلطف شريحة شايفر والزجاج غطاء، وعقد الشريحة الزجاجية الغطاء من أسفل، بعيدا عن الجانب bilayer، ونقل الزجاج غطاء في حلقة الصورة، وإغلاق حلقة الصورة.
    ملاحظة: تأكد من أن غطاء الزجاج مع ثنائي الدهون هو دائما في الماء، والحلقة مختومة بشكل جيد.
  3. استبدال المياه فائقة الpure في حلقة الصورة مع حاجز الـ Bis-Tris NaCl، تأكد من عدم تعرض ثنائي الدهون لأي فقاعات هوائية. إضافة 1.1 × 10-9 M ن-أوكتيل-β-D-Glucopyranoside إلى ثنائي الدهون. على الفور إضافة خليط من 1.2 × 10-9 م من DDM و 1.3 × 10-12 مول تنقية l-Opa136 في حلقة الصورة. احتضان عينة على شاكر benchtop في سرعة منخفضة لمدة 2 ساعة (الشكل 3).
    ملاحظة: قد تختلف المنظفات حسب البروتين الذي سيتم إعادة تكوينه.
  4. توزيع 30 ملغ SM-2 الراتنج الخرز في 3 مل من البيس تريس العازلة ويهز قبل تطبيق. استخدام ماصة بلاستيكية لإضافة 5 ~ 10 ميكرولتر من الخرز الراتنج SM-2 إلى حلقة الصورة، احتضان لمدة 10 دقيقة، وإزالة الخرز الراتنج عن طريق الشطف. الحجم النهائي للمخزن المؤقت في حلقة الصورة هو 1.5 مل.

Figure 3
الشكل 3: إجراء لإعادة تشكيل l-Opa1 في ثنائي الدهون البوليمر المربوطة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. إعداد بروتيوليبوسسومات

  1. إعداد 1 ملغ من خليط الدهون A في محلول الكلوروفورم. يتبخر الكلوروفورم تحت تدفق النيتروجين لمدة 20 دقيقة والاحتفاظ تحت فراغ بين عشية وضحاها وتشكيل فيلم الدهون.
  2. إعداد 50 mM calcein التي تحتوي على العازلة عن طريق حل 15.56 غرام من الكالسين إلى 50 مل من 1.5 مول NaOH الحل، واثارة في درجة حرارة الغرفة حتى يذوب تماما calcein، وأضاف 12.5 mM بيس تريس والمياه فائقة السخ إلى الحجم النهائي لل 500 مل. ضبط درجة اله pH إلى 7.5.
  3. تعليق فيلم الدهون في كالسين التي تحتوي على العازلة، هيدرات تماما من الدهون عن طريق تسخين تعليق في 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. يتم تشكيل 200 نانومتر liposomes من خلال البثق باستخدام غشاء البولي.
  4. إضافة 2 ميكروغرام من l-Opa1 في 0.5 μM DDM إلى 0.2 ملغ ليبوزوم واحتضان في 4 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة. قم بإزالة السطحي عن طريق غسيل الكلى باستخدام كاسيت غسيل الكلى 3.5 كيلو Da مقابل 250 مل من 25 mM Bis-Tris و 150 mM NaCl و 50 mM buffer في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها، وتغيير المخزن المؤقت مرتين.
  5. إزالة calcein اضافية باستخدام PD-10 إزالة التشبع العمود.

5- التصوير وتحليل البيانات

  1. الحصول على صور TIRF باستخدام هدف الغمر النفطي 100x (N.A 1.4). استخدام الليزر 543 نانومتر و488 نانومتر ليزر لتحليل ريبوسومات اسيس تكساسريد- PE المسمى وproteoliposomes مغلفة بالكالسين. استخدام ليزر 633 نانومتر لتحليل Cy5-PE جزءا لا يتجزأ من ثنائي الدهون بلانكار.
  2. محاذاة زاوية TIRF باستخدام ثنائي الدهون للحصول على أقصى قدر من الانبعاثات. ويلاحظ نوعية ثنائي الدهون بعد إعادة تشكيل باستخدام هدف 100x النفط في 25 درجة مئوية. يتم تحديد معامل انتشار phospholipid وbilayer المعاد تشكيلها باستخدام FCS مع بروتوكول وصف في مكان آخر37.
  3. إضافة 10 ميكرولتر من 2 ملغ / مل proteoliposomes إلى حلقة الصورة وتعيين لمدة 10 دقائق قبل الصورة. يضاف إلى حلقة التفاعل 1 mM MgCl2 و 1 مللي أم من النيوكليوتيدات.
  4. لتحديد تأثير s-Opa1 في الانصهار الغشاء، titrate s-Opa1 في عينة ثنائي الطبقات proteoliposome/المدعومة التي تحتوي على l-Opa1، وتسجيل أحداث الانصهار.
  5. يتم تحقيق التصوير المتزامن لـ TexasRed-DHPE والكالسين من خلال نظام تقسيم الحزم. يتم تطبيق كل من 488 نانومتر و 543 نانومتر الليزر في وقت واحد على العينة كمصادر الإثارة دقيق. ثم يتم تقسيم ضوء الانبعاثات باستخدام مقسم شعاع 560 نانومتر. ثم يتم تصفية ضوء الانبعاثات المنقسم بواسطة فلتر 510 نانومتر مع عرض نطاق ترددي 42 نانومتر ومصفاة 609 نانومتر مع عرض نطاق ترددي 40 نانومتر. ومن المتوقع أن شعاع المصفاة إلى اثنين من المناطق المجاورة على رقاقة الكاميرا.
  6. يتم تسجيل الانبعاثات الفلورية في وقت واحد من خلال مرشح 609 انبعاثات مع عرض نطاق ترددي 40 نانومتر، ومرشح 698 انبعاث مع عرض نطاق ترددي من 70 نانومتر. وقد تم تجهيز نظام المجهر مع كاميرا CMOS الحفاظ على -10 درجة مئوية.
  7. يمكن إجراء تحديد الجسيمات من الليبوزومات باستخدام خوارزمية التعرف على الجسيمات الغاوسية. يتم تحليل توزيع الجسيمات وكثافتها قناة من قناة. يتم استخدام إشارة ثنائية الطبقات الدهنية كقناع لعزل الجسيمات.

Representative Results

ينتشر البروتين المُعاد تشكيله عبر المُسَرَّع بحرية ويُوزَّع بشكل متجانس في الغشاء.

مثال على صور ثنائية الدهون وسيلتها الدهنية التي تم التحقق من صحتها بواسطة المجهر epifluorescence يظهر في الشكل 4. توزيع الدهون في bilayer قبل وبعد يظهر photobleaching في الشكل 4A, B. تم تصور التجانس من ثنائي الطبقات الدهنية باستخدام مجهر epifluorescence قبل وبعد إعادة تشكيل (الشكل 4D, E). L-Opa1 إعادة تشكيلها في ثنائي الدهون تم التحقق من صحة من قبل التحليل الطيفي ارتباط الفلوريسنس (FCS). نستخدم الدهون صبغ مترافق لتقييم انتشار الدهون من bilayer. تم تسمية Opa1 المعاد تشكيلها باستخدام جسم مضاد مضاد لـ Opa1 C-Terminal الموسوم بالفلورسنت. تم قياس انتشار الدهون Bilayer على النحو 1.46 ± 0.12 ميكرومتر2/ ق، في حين أن معامل انتشار ثنائي الطبقات-إعادة تشكيل l-Opa1 كان 0.88 ± 0.10 ميكرومتر2/ s. قراءة كثافة من منحنيات FCS المشار 75٪ من L-Opa1 إعادة تشكيلها في ثنائي الدهون(الشكل 4G, H). وتشير هذه النتائج إلى أن l-Opa1 ينشر بحرية في ثنائي الدهون البوليمر المربوطة مع إمكانية التجمع الذاتي في مجمعات وظيفية.

Figure 4
الشكل 4: توزيع الدهون والبروتين المعاد تشكيلها في الغشاء النموذجي.
(أ - ج) مثال على صور ثنائية الدهون وسيولة الدهون التي تم التحقق من صحتها عن طريق المجهر epifluorescence. (أ)توزيع الدهون متجانسة في bilayer قبل photobleaching. (B) لقطة مباشرة بعد photobleaching. (C) Bilayer صورة بعد انتعاش fluorescence يشير إلى سيولة الدهون جيدة من الغشاء بعد إعادة تشكيل. (D, E) صور تمثيلية لتوزيع الدهون قبل (D)، وبعد (E) l-Opa1 إعادة تشكيل تشير إلى أن عملية إعادة تشكيل لم يخلق عيوب في bilayer. ممثل TIRF صورة ل-Opa1 المسمى مع اليكسا 488 الأجسام المضادة المقترنة (F) تظهر توزيعا متجانسا من Opa1 عند إعادة تشكيل. ز. ممثل الفوتون الخام التهم من l-Opa1 إشارة عن طريق التحليل الطيفي ارتباط الفلورسنت. في السيطرة، لم يتم إعادة تشكيل L-Opa1 في الطبقات، في حين تم إضافة الأجسام المضادة وشطفها. انتشار l-Opa1 أبطأ بكثير من الدهون في الغشاء، بما يتفق مع إعادة تشكيل ناجحة من transmembrane l-Opa1 (H). شريط مقياس: 10 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وأشارت تبييض خطوة Fluorescence في المتوسط 2-3 نسخ من l-Opa1 أعيد تشكيلها في ليبوزوم معين(الشكل 5A, B). تم اختبار حجم توزيع Opa1 proteoliposomes المعاد تشكيلها بعد إعادة تشكيل باستخدام DLS (الشكل 5C). كما تم التحقق من إعادة تشكيل Opa1 في proteoliposomes باستخدام FCS. وكان معامل انتشار الأجسام المضادة الحرة 164 ± 22 ميكرومتر2/s; وكان معامل انتشار الليبوزومات المسمى مع صبغة الدهون 2.22 ± 0.33 μm2/ s، ومعامل الانتشار لL-Opa1 proteoliposomes ملزمة تكساسRed المسمى المضادة له كان 2.12 ± 0.36 μm2/ s.

Figure 5
الشكل 5: تلفيق وتوصيف البروتوليبويسومات.
(أ)خطوات في تصنيع البروتيوليبومات مع مغلفة، calcein مطفأة. (ب) تظهر البيانات التمثيلية لتبييض خطوة الفلورسنت ما متوسطه 2-3 نسخ من l-Opa1 جزءا لا يتجزأ من liposome. (C) توزيعات الحجم التمثيلي للبروتيوليوسومات (الأحمر) دون أي النيوكليوتيد 1 ح بعد حضانة GTP (الأخضر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكشف عن الربط الغشاء، دهن نصف الدهون / هيفوسيشن، وفتح المسام عن طريق المجهر الفلورسنت.

يتم رصد الربط الغشاء من خلال مراقبة إشارة TexasRed على سطح ثنائي الطبقات الدهون باستخدام المجهر TIRF (الشكل 6A). تم رصد غشاء الدهون (غشاء الدم) السلوك من خلال TexasRed كما تنتشر صبغة من liposomes في ثنائي الدهون. Calcein dequenching يساعد على التمييز بين تكوين المسام الانصهار الكامل من نصف الدهون فقط. وهذا يسمح بالمقارنة بين الظروف حيث الجزيئات المماطلة في الفوة (الشكل 6B)، والجسيمات التي تنتقل إلى الانصهار الكامل(الشكل 6C).

يشار إلى الربط الغشاء من قبل إشارة الدهون مستقرة من liposomes. ويمكن تقييم المسافة على أساس إشارة فريت بين تسميات اثنين من الأغشية36. إشارة hemifusion ميزات لا dequenching في إشارة calcein(الشكل 6B، الصف السفلي) ، ولكن الاضمحلال السريع لإشارة TexasRed يشير إلى انتشار الصبغة في ثنائي الطبقة الدهنية(الشكل 6B الصف العلوي). الانصهار الكامل (مع فتحة المسام) ميزات كل من اضمحلال الدهون والمحتوى الإفراج(الشكل 6C). يمكن تتبع كثافة تكساسريد وكثافة الكالسين بطريقة تعتمد على الوقت لتوفير التفاصيل الكمية لحركيات الانصهار الغشاء36.

Figure 6
الشكل 6: النتائج التمثيلية التي تبين ربط الجسيمات (A، شريط مقياس 10 ميكرومتر)، وثنوية (B، شريط مقياس 0.5 ميكرومتر)، والانصهار (C، شريط مقياس 0.5 ميكرومتر).
(أ)Proteoliposomes المربوطة إلى ثنائي الدهون Opa1 المعاد تشكيلها قبل إضافة GTP. (B) مثال على التهوية. يظهر الصف العلوي في B نصف الدهون (إشارة TexasRed، أحمر)، الصف السفلي في B يظهر أي إصدار المحتوى (إشارة calcein، الأخضر) في ظل هذه الظروف. (C) وهو أثر تمثيلي للبروتيوليبوسي مع ثنائي الطبقات الدهنية. يمكن ملاحظة إصدار المحتوى من الصور في الصف السفلي من إظهار إزالة الظلب من الكالسين (الصف السفلي، الأخضر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

في المختبر نموذج غشاء نظم يمكن أن تصف عمليات الأغشية المعقدة في ظل ظروف محددة جيدا. هذه الأنظمة يمكن أن تميز الحد الأدنى من المكونات اللازمة للعمليات الجزيئية المعقدة للكشف عن الآليات الجزيئية6،15،20،38. بالنسبة للبروتينات الغشائية، فإن الليبوسومات والطبقات الثنائية المدعومة من البلاونات هي أنظمة إعادة تشكيل شائعة. على النقيض من ثنائيات الدهون المدعومة من المواد الصلبة ، فإن وسادة البوليمر بين الركيزة والغشاء المدعوم في الطبقات الثنائية المربوطة بالبوليمر تسمح بحرية التنقل من بروتينات الأغشية الكبيرة ، وبروتينات الغشاء المُجمب لنشر وتجميعها بحرية34. هذه الميزات ساعدتنا على التحقيق في حركية الميتوكوندريا داخل الغشاءالانصهار 36.

أعددنا ثنائي ثنائية الدهون البوليمرية المربوطة باستخدام تقنيات Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer (LB/LS). وهذا يسمح لنا بإعداد ثنائي الطبقات مع مكونات الدهون غير المتماثلة. الأغشية الخلوية لها تكوين منشور غير متماثل، والنهج LB /LS يسمح بدراسة هذه الطبقات. مع نقل شيفر، يمكن تغطية الركيزة الزجاجية بأكملها من قبل ثنائي الدهون. من المهم إعداد سطح نظيف لإعداد الطبقات. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يأخذ الممارسة لتنفيذ نقل شايفر بشكل صحيح. نقل شيفر غير ناجحة يمكن أن تخلق عيوب غير مرغوب فيها في ثنائي الدهون. في هذا البروتوكول، الضغط المضافة إلى توازن الفيلم ينطبق على bilayer تحتوي على 20٪ cardiolipin. بالنسبة للطبقات الثنائية مع المكونات الأخرى، راجع ايزوثرم مساحة الضغط السطحي للمكونات الرئيسية. طريقة بديلة هي طريقة الانصهار Langmuir-Blodgett/vesicle (LB/VF)، حيث يتم نقل الطبقة الدهنية السفلية من واجهة الهواء والماء من حوض لانغموير على ركيزة نظيفة، ثم ليبوسومات الصمامات إلى أعلى طبقة الدهون المدعومة وتشكيل الطبقة الثنائية النهائية39. إعادة تكوين البروتينات الغشاء باستخدام طريقة LB / VF هو أكثر مباشرة من LB / LS، كما يمكن إجراء إعادة تشكيل من خلال الانصهار من proteoliposomes. ومع ذلك، يتطلب الانصهار الحاسوس إضافة ليبوسومات زائدة، مما قد يعقد دراسة أحداث الغشاء التي تعتمد على التفاعلات البروتينية البروتينية المعتمدة على التركيز.

إعادة تشكيل ناجحة من البروتينات عبر مثقب في كل من البوليمر المربوطة ثنائية الدهون والليبوسومات في التوجه الوظيفي المفضل المهم, ولكن من الصعب إنفاذ. وهناك حاجة إلى ضوابط تجريبية لحساب هذا. بالنسبة للبوليمرات ذات طبقات الدهون المربوطة، من المهم أيضًا الحفاظ على سلامة الطبقة الدهنية الثنائية أثناء إعادة التشكيل. يجب أن تبقى تركيزات السطح منخفضة نسبيا لمنع تذويب ثنائي الدهون، ولكن عالية بما يكفي لمنع denaturation من البروتين الفائدة37،40. الطريقة الموصوفة هنا مثالية لإعادة تكوين البروتينات الغشاء لدراسات جزيء واحد ولكن ليس بالضرورة قابلة للتطوير للدراسات على نطاق أوسع. اختيار السطحي هو اعتبار مهم آخر. في كثير من الأحيان، السطحي المستخدمة لتنقية وتخزين نقطة انطلاق جيدة. التركيز الأقصى من السطحي عادة ما يكون ~200 مرات أقل من CMC36، في نطاق حيث يحافظ على استقرار البروتين ويمنع تجميع البروتين ، مع الحفاظ على سلامة الغشاء36. ويمكن النظر في الكوكتيلات التي تحتوي على 2 أو 3 مواد سطحية. لإعادة تشكيل في ليبوسومات، تركيز منخفض من السطح ليس من الضروري. ومع ذلك، فإن تركيزات السطح تحت CMC هي الأفضل للحفاظ على حجم موحد وتوزيع مورفولوجيا للليبوسومات. لمنع تسرب صبغة المحتوى ، فمن الضروري أن تطلب ضد العازلة التي تحتوي على صبغ.

على النقيض من المقايسات الانصهار القائم على الليبسومات، منصة أنشأنا يوفر نهجا للتحقيق في حركة كل خطوة من الانصهار الغشاء. توفر هذه الطريقة القدرة على دراسة بروتينات الانصهار عبر المُربَط في ظل ظروف شبه أصلية. يمكن تطبيق منصات الغشاء النموذجي لدراسة تجميع البروتين الغشائي و oligomerization ، والغشاء "النحت" ، وتفاعلات البروتينات الدهنية من البروتينات في البيئات دون الخلوية ، مثل الغشاء الداخلي الميتوكوندريا. هذه الطريقة تسمح أيضا استكشاف الظروف الفسيولوجية الهامة في التفاعل بين الغشاء والبروتين، مثل عدم التماثل تكوين ثنائي الطبقات. دور الدهون الميتوكوندريا الرئيسية, cardiolipin, في خصائص bilayer من كل من liposomes والبوليمر المدعومة bilayers لا يزال يتعين تحديدها. خصائص مثل القوة الأيونية، سمك الغشاء، صلابة الغشاء، انحناء الغشاء، وخصائص اللزوجة المرنة للغشاء قد تؤثر جميعها على قدرة البروتينات على التجمع في حالات وظيفية محددة. الدراسات المستقبلية تطبيق خلاق نظم غشاء نموذج لديها القدرة على الكشف عن جوانب جديدة من تنظيم البروتين الغشائي وظيفة.

Disclosures

اي.

Acknowledgments

يعترف المؤلفون بالدعم المقدم من جائزة تشارلز ه. هود لأبحاث صحة الطفل والدعم السخي من قسم البيولوجيا الجزيئية في مستشفى ماساتشوستس العام.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) Avanti polar lipid Cat #: 810335C1mg membrane fluorescent markers
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) Avanti Polar lipids Cat #: 880130P lipid molecules
1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) Avanti Polar lipids Cat #: 710335P lipid molecules
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) Avanti Polar lipids Cat #: 850375P lipid molecules
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar lipids Cat #: 850757P lipid molecules
Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit ThermoFisher Scientific A20181
Amber vial with PTFE liner Fisher scientific 14-955-332 sample vials to keep lipid solutions
Calcein Sigma-Aldrich Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 fluorescent dye
Chloroform Fisher scientific 298-500/ C295-4 Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works.
Concavity slide (1 well) Electron Microscopy Science 71878-05 applied as Schaefer Slide
FCS analysis tool Smith Lab, University of Akron software tool
Fiji /ImageJ Fiji SCR_002285 software tool
Fisherbrand Cover Glasses: Circles Fisher scientific 12-545-102 Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M
GTP Disodium salt SIGMA-ALDRICH INC Cat #: 10106399001
Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough Biolin Scientifc KN2002
L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) Avanti Polar lipids Cat #: 850091P lipid molecules
Mini Extruder Avanti Polar lipids 610020
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside Anatrace Cat #: D310 25 GM surfactant for reconstitution
n-Octyl-α-D-Glucopyranoside Anatrace Cat #: O311HA 25 GM surfactant for reconstitution
PC Membranes 0.2μm Avanti Polar Lipids 610006
Rabbit Anti-Opa1 antibody NOVUS BIOLOGICALS Cat #: NBP2-59770 antibody for Opa1 C-terminal detection
Slidebook Intelligent imaging RRID: SCR_014300 software tool
Teflon threaded seal tape Fisher Scientific NC0636085 taflon tape for sample storage
Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) ThermoFisher Scientific Cat #: T1395MP membrane fluorescent markers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sackmann, E. Biological membranes architecture and function. Structure and Dynamics of Membranes. Lipowsky, R., Sackmann, E. 1, Elsiever. 1-63 (1995).
  2. Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118, Pt 6 1099-1102 (2005).
  3. Schink, K. O., Tan, K. W., Stenmark, H. Phosphoinositides in Control of Membrane Dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 143-171 (2016).
  4. Gu, R. X., Ingolfsson, H. I., de Vries, A. H., Marrink, S. J., Tieleman, D. P. Ganglioside-Lipid and Ganglioside-Protein Interactions Revealed by Coarse-Grained and Atomistic Molecular Dynamics Simulations. Journal of Physical Chemistry B. 121 (15), 3262-3275 (2017).
  5. Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
  6. Chan, Y. H., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  7. Biswas, K. H., Groves, J. T. Hybrid Live Cell-Supported Membrane Interfaces for Signaling Studies. Annual Reviews in Biophysics. 48, 537-562 (2019).
  8. Pick, H., Alves, A. C., Vogel, H. Single-Vesicle Assays Using Liposomes and Cell-Derived Vesicles: From Modeling Complex Membrane Processes to Synthetic Biology and Biomedical Applications. Chemical Reviews. 118 (18), 8598-8654 (2018).
  9. Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophysical Journal. 99 (12), 4047-4055 (2010).
  10. Kiessling, V., et al. Rapid fusion of synaptic vesicles with reconstituted target SNARE membranes. Biophysical Journal. 104 (9), 1950-1958 (2013).
  11. Yang, S. T., Kiessling, V., Tamm, L. K. Line tension at lipid phase boundaries as driving force for HIV fusion peptide-mediated fusion. Nature Communication. 7, 11401 (2016).
  12. Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophysical Journal. 101 (8), 37 (2011).
  13. Chao, L. H., Klein, D. E., Schmidt, A. G., Pena, J. M., Harrison, S. C. Sequential conformational rearrangements in flavivirus membrane fusion. Elife. 3, 04389 (2014).
  14. Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions. Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).
  15. Sezgin, E., Schwille, P. Model membrane platforms to study protein-membrane interactions. Molecular Membrane Biology. 29 (5), 144-154 (2012).
  16. Ge, Y., Gao, J., Jordan, R., Naumann, C. A. Changes in Cholesterol Level Alter Integrin Sequestration in Raft-Mimicking Lipid Mixtures. Biophysical Journal. 114 (1), 158-167 (2018).
  17. Dutta, D., Kam, L. C. Micropatterned, multicomponent supported lipid bilayers for cellular systems. Methods in Cell Biology. 120, 53-67 (2014).
  18. Groves, J. Supported Lipid Bilayers as Mimics for Cell Surfaces and as Tools in Biotechnology. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Ferrari, M., Desai, T., Bhatia, S. , Springer. Boston, MA. (2006).
  19. Shoaib, T., Nalam, P. C., He, Y., Chen, Y., Espinosa-Marzal, R. M. Assembly, Morphology, Diffusivity, and Indentation of Hydrogel-Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 33 (28), 7105-7117 (2017).
  20. Wang, N., Rapoport, T. A. Reconstituting the reticular ER network - mechanistic implications and open questions. Journal of Cell Science. 132 (4), 227611 (2019).
  21. Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).
  22. Chan, D. C. Fusion and fission: interlinked processes critical for mitochondrial health. Annual Reviews of Genetics. 46, 265-287 (2012).
  23. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  24. Wai, T., Langer, T. Mitochondrial Dynamics and Metabolic Regulation. Trends in Endocrinology Metabolism. 27 (2), 105-117 (2016).
  25. Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 872-884 (2010).
  26. Chen, H., et al. Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development. Journal of Cell Biology. 160 (2), 189-200 (2003).
  27. Ishihara, N., Fujita, Y., Oka, T., Mihara, K. Regulation of mitochondrial morphology through proteolytic cleavage of OPA1. EMBO Journal. 25 (13), 2966-2977 (2006).
  28. Anand, R., et al. The i-AAA protease YME1L and OMA1 cleave OPA1 to balance mitochondrial fusion and fission. Journal of Cell Biology. 204 (6), 919-929 (2014).
  29. Mishra, P., Carelli, V., Manfredi, G., Chan, D. C. Proteolytic cleavage of Opa1 stimulates mitochondrial inner membrane fusion and couples fusion to oxidative phosphorylation. Cell Metabolism. 19 (4), 630-641 (2014).
  30. Baker, M. J., et al. Stress-induced OMA1 activation and autocatalytic turnover regulate OPA1-dependent mitochondrial dynamics. EMBO Journal. 33 (6), 578-593 (2014).
  31. DeVay, R. M., et al. Coassembly of Mgm1 isoforms requires cardiolipin and mediates mitochondrial inner membrane fusion. Journal of Cell Biology. 186 (6), 793-803 (2009).
  32. Rainbolt, T. K., Lebeau, J., Puchades, C., Wiseman, R. L. Reciprocal Degradation of YME1L and OMA1 Adapts Mitochondrial Proteolytic Activity during Stress. Cell Reports. 14 (9), 2041-2049 (2016).
  33. Ban, T., et al. Molecular basis of selective mitochondrial fusion by heterotypic action between OPA1 and cardiolipin. Nature Cell Biology. 19 (7), 856-863 (2017).
  34. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  35. Shilts, K., Naumann, C. A. Tunable cell-surface mimetics as engineered cell substrates. Biochimica Biophysica Acta Biomembrane. 1860 (10), 2076-2093 (2018).
  36. Ge, Y., et al. Two forms of Opa1 cooperate to complete fusion of the mitochondrial inner-membrane. Elife. 9, 50973 (2020).
  37. Ge, Y., Siegel, A. P., Jordan, R., Naumann, C. A. Ligand binding alters dimerization and sequestering of urokinase receptors in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysical Journal. 107 (9), 2101-2111 (2014).
  38. Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 269-295 (2004).
  39. Kiessling, V., Liang, B., Tamm, L. K. Reconstituting SNARE-mediated membrane fusion at the single liposome level. Methods in Cell Biology. 128, 339-363 (2015).
  40. Siegel, A. P., Kimble-Hill, A., Garg, S., Jordan, R., Naumann, C. A. Native ligands change integrin sequestering but not oligomerization in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysics Journal. 101 (7), 1642-1650 (2011).

Tags

هذا الشهر في JoVE، العدد 163، الميتوكوندريا الداخلية الغشاء، Opa1، البوليمر المربوطة الدهون ثنائية الطبقات، في إعادة تشكيل في المختبر، الانصهار الغشاء، TIRF المجهرية
منصة غشاء نموذج لإعادة تشكيل ديناميات غشاء الميتوكوندريا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ge, Y., Boopathy, S., Smith, A.,… More

Ge, Y., Boopathy, S., Smith, A., Chao, L. H. A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics. J. Vis. Exp. (163), e61620, doi:10.3791/61620 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter