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Zweidimensionale Visualisierung und Quantifizierung von labilen, anorganischen Pflanzennährstoffen und Verunreinigungen im Boden

Published: September 1, 2020 doi: 10.3791/61661
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,3
1Department General, Analytical and Physical Chemistry, Chair of General and Analytical Chemistry, Montanuniversität Leoben, 2Department of Forest and Soil Sciences, Institute of Soil Research, Rhizosphere Ecology and Biogeochemistry Group, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, 3Department of Crop Sciences, Institute of Agronomy, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna

Summary

Dieses Protokoll stellt einen Workflow für die Sub-mm-2D-Visualisierung mehrerer lamitischer anorganischer Nährstoff- und Schadstoffspezies mit diffusiven Gradienten in Dünnschichten (DGT) in Kombination mit Massenspektrometrie-Bildgebung dar. Solute Probenahme und hochauflösende chemische Analyse werden detailliert für die quantitative Kartierung von Gelösten in der Rhizosphäre von terrestrischen Pflanzen beschrieben.

Abstract

Wir beschreiben ein Verfahren zur zweidimensionalen (2D) Visualisierung und Quantifizierung der Verteilung von labile (d.h. reversibel adsorbierten) anorganischen Nährstoffen (z. B. P, Fe, Mn) und Kontaminanten (z. B. As, Cd, Pb) gelösten Arten im Boden, die an Pflanzenwurzeln (die "Rhizosphäre") bei submillimeter bedingter Raumauflösung angrenzen. Das Verfahren kombiniert die senksenkende Solute-Probenahme durch die diffusiven Gradienten in Dünnschichten (DGT) mit räumlich aufgelöster chemischer Analyse mittels laserablationsinduktiv gekoppelter Plasmamassenspektrometrie (LA-ICP-MS). Die DGT-Technik basiert auf dünnen Hydrogelen mit homogen verteilten Analyt-selektiven Bindungsphasen. Die Vielfalt der verfügbaren Bindungsphasen ermöglicht die Herstellung verschiedener DGT-Geltypen nach einfachen Gelherstellungsverfahren. Für den Einsatz von DGT-Gelen in der Rhizosphäre werden Pflanzen in flachen, transparenten Wachstumsbehältern (Rhizotronen) angebaut, die minimalinvasiven Zugang zu einem bodengewachsenen Wurzelsystem ermöglichen. Nach einer Vorwachstumsphase werden DGT-Gele auf ausgewählte Regionen von Interesse für in situ-Solute-Proben in der Rhizosphäre angewendet. Anschließend werden DGT-Gele abgerufen und für die anschließende chemische Analyse der gebundenen Gelösten mittels LA-ICP-MS Line-Scan-Bildgebung vorbereitet. Die Anwendung der internen Normalisierung mittels 13C und die externe Kalibrierung mit Matrix-matched Gel-Standards ermöglichen die Quantifizierung der 2D-Gelöstenflüsse. Diese Methode ist einzigartig in ihrer Fähigkeit, quantitative 2D-Bilder von Mehrelement-Gelösten in Boden-Pflanzen-Umgebungen zu erzeugen, die die erreichbare räumliche Auflösung anderer Methoden zur Messung von gelösten Gradienten in der Rhizosphäre wesentlich übersteigen. Wir stellen die Anwendung und Bewertung des Verfahrens zur Abbildung mehrerer kationischer und anionischer soluteArten in der Rhizosphäre terrestrischer Pflanzen vor und weisen auf die Möglichkeit hin, diese Methode mit komplementären solute bildgebenden Verfahren zu kombinieren.

Introduction

Die Nährstoffaufnahme durch Kulturpflanzen ist ein Schlüsselfaktor für die Bestimmung der Ernteproduktivität. Die Prozesse für die effiziente Aufnahme von Nährstoffen durch Kulturen wurden intensiv untersucht, insbesondere die Mechanismen zur Kontrolle der Nährstoffverfügbarkeit und der Nährstoffinternalisierung durch Pflanzenwurzeln an der Bodenwurzelschnittstelle, der Rhizosphäre, werden für ihre Rolle bei der Erfassung von Pflanzennährstoffen anerkannt. Wichtige Prozesse für die Aufnahme von Pflanzennährstoffen sind: Nährstofftransport zur Wurzel; dynamische Sorptionsgleichgewichte zwischen Arten, die sich im Bodenporenwasser gelöst haben, und Arten, die an feste Bodenoberflächen gebunden sind; mikrobielle Konkurrenz um Nährstoffe; mikrobielle Mineralisierung von Nährstoffen, die in organischen Bodenstoffen enthalten sind; und Nährstoffinternalisierung in das Wurzelsymplasma. Die Aufnahme von anorganischen Spurenmetall(oid) Verunreinigungen wird weitgehend durch die gleichen Mechanismen gesteuert.

Je nach Verfügbarkeit von Nährstoffen und Schadstoffen, Pflanzenbedarf und Diffusivität im Boden können differenzielle Nährstoffmuster in der Rhizosphäre beobachtet werden. Für stark sorbierende Elemente mit vergleichsweise hohen Internalisierungsraten (z.B. P, Fe, Mn, Zn, As, Cd, Pb), Erschöpfung der labilen (d.h. reversibel adsorbierten) Elementfraktion im Vergleich zum Schüttgutboden gefunden, wobei die Erschöpfungszonen oft ≤1 mm betragen, während sich für mobilere Nährstoffe wie NO3-Erschöpfungszonen bis zu mehrerenZentimeternerstrecken können. Darüber hinaus wurde die Anhäufung von Elementen wie Al und Cd beobachtet, wenn die Verfügbarkeit die AufnahmeratenderAnlage 2,3übersteigt.

Angesichts der Bedeutung von Rhizosphärenprozessen im Nährstoff- und Schadstoffkreislauf wurden mehrere Techniken zur Messung der pflanzenverfügbaren Elementfraktion mit hoher räumlicher Auflösung entwickelt4,5. Die Messung kleiner labiler Solute-Verteilungen hat sich jedoch aus mehreren Gründen als herausforderunglich erwiesen. Eine große Schwierigkeit besteht darin, sehr kleine (niedrige L-Bereich) Volumen von Boden und/oder Porenwasser an definierten Positionen neben lebenden Pflanzenwurzeln zu beproben, um die steilen Nährstoffgradienten in der Rhizosphäre zu beheben. Ein Ansatz, um dieses Problem anzugehen, ist die Verwendung von Mikrosaugnäpfen für die Extraktion von Porenwasserproben6. Mit dieser Methode maßen A. Göttlein, A. Heim und E. Matzner7 die Porenwassernährstoffkonzentrationen in der Nähe von Quercus robur L. Wurzeln mit einer räumlichen Auflösung von 1 cm. Eine Schwierigkeit bei der Analyse der Boden- oder Bodenlösungsvolumina besteht darin, dass diese kleinen Probenvolumina in Kombination mit den geringen Konzentrationen aller bis auf die wichtigsten Nährstoffarten hochsensible chemische Analysetechniken erfordern.

Ein alternatives System, das in der Lage ist, Nährstoffgradienten mit einer Auflösung von bis zu 0,5 mm aufzulösen, besteht darin, eine Wurzelmatte auf der Oberfläche eines Bodenblocks zu züchten, wobei eine dünne hydrophile Membranschicht den Boden von den Wurzeln8,9trennt. In dieser Konfiguration können Solutes durch die Membran passieren und Wurzeln können Nährstoffe und Verunreinigungen aus dem Boden aufnehmen, während Wurzelausscheidungen in den Boden diffundieren können. Nach dem Aufbau einer dichten Wurzelschicht kann der Bodenblock beprobt und in Scheiben geschnitten werden, um Bodenproben für die nachfolgende Extraktion von Elementfraktionen zu erhalten. Auf diese Weise können eindimensionale Nährstoffe und Schadstoffgradienten, die über eine relativ große Fläche gemittelt sind (ca. 100 cm2), analysiert werden.

Eine weitere Herausforderung besteht darin, Proben der lamitischen, pflanzenverfügbaren Elementfraktion zu erhalten, da die meisten chemischen Bodenextraktionstechniken sehr unterschiedlich arbeiten als die Mechanismen, mit denen Pflanzen Nährstoffe und Verunreinigungen aufnehmen. In vielen Bodenextraktionsprotokollen wird der Boden mit einer Extraktanlösung vermischt, um ein (Pseudo-)Gleichgewicht zwischen gelöster und sorbierter Elementfraktion herzustellen. Pflanzen verinnerlichen jedoch kontinuierlich Nährstoffe und erschöpfen daher oft zunehmend den Boden der Rhizosphäre. Obwohl Gleichgewichtsextraktionsprotokolle weithin als Bodentests angenommen wurden, da sie einfach umzusetzen sind, stellt die extrahierte Nährstofffraktion oft nicht die pflanzenverfügbare Nährstofffraktion gut10,11,12,13dar. Sinkmethoden, die den beprobten Boden kontinuierlich für Nährstoffe aufbrauchen, wurden als vorteilhafte Methoden vorgeschlagen und können dem zugrunde liegenden Nährstoffaufnahmemechanismus besser ähneln, indem sie die Wurzelaufnahmeprozesse10,11,14,15imitieren.

Zusätzlich zu den oben beschriebenen Methoden wurden echte Bildgebungsanwendungen entwickelt, die in der Lage sind, kontinuierliche Parameterkarten mit Auflösungen≤100 m über Sichtfelder von mehreren cm2 hinweg zu messen. Die Autoradiographie kann verwendet werden, um die Elementverteilung in der Rhizosphäre abzubilden, sofern geeignete Radioisotope verfügbar sind16. Planare Optodes ermöglichen die Visualisierung wichtiger bodenchemischer Parameter wie pH undpO 217,18,19, und Enzymaktivität oder totale Proteinverteilungen können mit fluoreszierenden Indikator-Bildgebungstechniken wie Bodenzymographie20,21,22,23 und/oder Wurzelblotting-Methoden24abgebildet werden. Während Zymographie und Autoradiographie auf die Messung eines einzelnen Parameters beschränkt sind, können pH- und pO2-Bildgebung mit planaren Optoden gleichzeitig durchgeführt werden. Die traditionelleren Root-Mat-Techniken liefern nur 1D-Informationen, während Mikrosaugnäpfe Punktmessungen oder 2D-Informationen mit niedriger Auflösung bereitstellen, jedoch ermöglichen beide Ansätze eine Multi-Elemente-Analyse. In jüngerer Zeit präsentierten P. D.Ilhardt , et al.25 einen neuartigen Ansatz mit hilfe der laserinduzierten Abbauspektroskopie (LIBS), um 2D-Gesamt-Multielementverteilungen mit einer Auflösung von 100 m in Bodenwurzelkernproben zu kartieren, bei denen die natürliche Elementverteilung durch sorgfältige Probenvorbereitung erhalten wurde.

Die einzige Technik, die in der Lage ist, gezielt 2D-Proben von mehreren Nährstoff- und Schadstoffsolutes bei hoher räumlicher Auflösung durchzuführen, sind die diffusiven Gradienten in der Thin-Films-Technik (DGT), eine senklassbasierte Probenahmemethode, die labile Spurenmetall(loid) In-situ auf einem in eine Hydrogelschicht eingebetteten Bindungsmaterial26,27immobilisiert. DGT wurde als chemische Spezifiationstechnik zur Messung von Labile-Solutes in Sedimenten und Gewässern eingeführt und bald für den Einsatz in Böden28eingeführt. Es ermöglicht eine Sub-mm-Skala multi-Elemente-Solute-Bildgebung, die ursprünglich in einem Flusssediment29demonstriert wurde und für seine Anwendung in Pflanzenrhizosphären30,31,32,33weiterentwickelt wurde.

Für die DGT-Probenahme wird ein Gelblech von einer Größe von ca. 3 cm x 5 cm auf eine einzelne Pflanzenwurzel aufgetragen, die in der Oberflächenschicht eines Bodenblocks wächst und eine hydrophile Membran das Gel vom Boden trennt. Während der Kontaktzeit diffundieren labile Nährstoffe und/oder Verunreinigungen in Richtung Gel und werden sofort durch das im Gel enthaltene Bindungsmaterial gebunden. Auf diese Weise wird ein Konzentrationsgradient und damit ein kontinuierlicher Nettofluss zum Gel festgestellt und setzt sich während der Probenahmezeit durch. Nach der Probenahme kann das Hydrogel mit einer analytischen chemischen Technik entfernt und analysiert werden, die eine räumlich aufgelöste Analyse ermöglicht. Eine hochspezialisierte und häufig eingesetzte Technik ist die laserablation induktiv gekoppelte Plasmamassenspektrometrie (LA-ICP-MS). In einigen frühen Studien wurde auch die mikropartikelinduzierte Röntgenemission (PIXE) verwendet29. Die DGT-Probenahme in Kombination mit der LA-ICP-MS-Analyse ermöglicht eine chemische Multielement-Bildgebung bei einer räumlichen Auflösung von 100 m. Werden hochsensible ICP-MS-Techniken (z. B. Sektorbereich ICP-MS) eingesetzt, können außergewöhnlich niedrige Nachweisgrenzen erreicht werden. In einer Studie über die Wirkung von Liming auf Zn und Cd-Aufnahme durch Mais15konnten wir labile Cd in der Maisrhizosphäre in nicht kontaminierten Böden mit einer Nachweisgrenze von 38 pg cm-2 cd pro Gelfläche kartieren. DGT, planare Optodes und Zymographie basieren auf der Diffusion des Zielelements aus dem Boden in eine Gelschicht, die für die kombinierte Anwendung dieser Methoden genutzt werden kann, um gleichzeitig oder nacheinander eine große Anzahl von Parametern abzubilden, die für die Aufnahme von Pflanzennährstoffen und Kontaminanten relevant sind. Detaillierte Informationen über analytische chemische Aspekte der DGT-Bildgebung, über das Potenzial der Kombination von DGT und anderen bildgebenden Verfahren sowie über ihre Anwendungen werden in Ref.34,35umfassend geprüft.

In diesem Artikel beschreiben wir, wie ein solute Imaging-Experiment mit der DGT-Technik an Wurzeln von terrestrischen Pflanzen in einer ungesättigten Bodenumgebung durchgeführt wird, einschließlich Pflanzenanbau, Gelherstellung, Gelanwendung, Gelanalyse und Bilderzeugung. Alle Schritte werden detailliert ausgearbeitet, einschließlich Anmerkungen zu kritischen Schritten und experimentellen Alternativen.

Protocol

1. Herstellung von DGT-Gelen

HINWEIS: Für die 2D-Bildgebung labiler gelöster Arten mit hoher (sub-mm) räumlicher Auflösung35stehen mehrere DGT-Geltypen zur Verfügung. Hierbei wird die Herstellung von drei gut charakterisierten hochaufgelösten (HR)-DGT-Bindungsgelen, die in solute Imaging-Anwendungen verwendet werden, kurz zusammengefasst. Laborverfahren zur Spurenelementanalyse sowie detaillierte Herstellungsverfahren aller vorgestellten HR-DGT-Gele sind in den Abschnitten Unterstützende Informationen (SI) S1 und S2beschrieben.

  1. Polyurethan-basiertes Mischanionen- und Kationenbindungs-Gel (HR-MBG; SI S2.1)31
    1. Bereiten Sie eine Polyurethan-Gelsuspension mit homogen dispergierten Zirkonium (IV)-Hydroxid- und Iminodiacetat-Phasen (IDA) vor.
    2. Die Gelsuspension in einem dünnen Film auf eine Glasplatte aufziehen und die Gelbildung durch Lösungsmittelverdampfung initiieren, um ein 0,1 mm dünnes, reißfestes Mischanionen- und Kationenbindungsgel (HR-MBG) zu erhalten.
  2. Polyacrylamid-Zirkonion-Anionen-Bindungsgel (HR-ABG; SI S2.2)36
    1. Herstellung eines 0,4 mm dünnen Agarose-Kreuz-Linked-Polyacrylamid-Gels (APA) nach etablierten Gelgussverfahren37 (siehe SI S2.4 für ein detailliertes Protokoll der APA-Fertigung).
    2. Ausscheidungs-Zirkonium(IV)-Hydroxidphasen in das vorgefertigte APA-Gel, um ein 0,4 mm dünnes Anionenbindungsgel (HR-ABG) zu erhalten.
  3. Polyacrylamid-Iminodiacetat-Kationenbindungs-Bindungsgel (HR-CBG; SI S2.3)38
    1. Bereiten Sie eine Polyacrylamid-Gelsuspension mit homogen dispergierten IDA-Phasen vor.
    2. Gießen Sie das Gel zwischen zwei Glasplatten und initiieren Sie die Polymerisationsreaktion, um ein 0,4 mm dünnes Kationenbindungsgel (HR-CBG) zu erhalten, bei dem die IDA-Phasen auf eine Seite des Gels abgerechnet werden.

2. Pflanzenanbau

HINWEIS: Das experimentelle System verwendet Rhizotrone4 (Abbildung 1), um Pflanzen in ungesättigten Böden für die unbesarische Bildgebung anzubauen. Zuerst werden Rhizotron-Bodenfüllung und Bewässerung beschrieben, dann werden Details zum experimentellen Pflanzenwachstum gegeben. Details zur Rhizotron-Konstruktion und Bodensubstratpräparation vor dem Einfüllen in das Rhizotron finden Sie im SI-Abschnitt S3.

Figure 1
Abbildung 1: Rhizotron-Design (nicht zu skalieren). (A) Explosionsansicht eines Rhizotron-Wachstumsbehälters. (B) Montiertes Rhizotron während des Pflanzenwachstums. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Rhizotron-Bodenfüllung
    1. Vor dem Befüllen des Rhizotrons mit vorbefeuchtetem Boden (gravimetrischer Wassergehalt, Equation 6 , ist bekannt; siehe SI S3.2), schließen Sie die Bewässerungslöcher an der Rückseite des Rhizotrons mit Klebeband und entfernen Sie die Frontplatte und ihre Befestigungsschienen und Schrauben.
    2. Wiegen Sie das leere Rhizotron (ausgenommen Frontplatte, Schienen und Schrauben), acht 5 cm x 11 cm Acrylplatten und 16 Klemmen (Materialtabelle)und erfassen Sie die Summe der Gewichte.
    3. Befestigen Sie eine kleine Acrylplatte an der Unterseite des Rhizotrons mit zwei Klemmen auf jeder Seite, wobei der Druck der Klemmen auf den Rhizotronrahmen gerichtet ist, so dass sich die Platte nicht nach innen biegt und das Volumen konstant ist.
    4. Das Rhizotron leicht in Richtung der kleinen Kunststoffplatte neigen und mit vorfeuchtem Boden bis zu einer Höhe von 4 cm füllen (Abbildung 2A). Verteilen Sie den Boden im Rhizotron, indem Sie das Rhizotron leicht aufhemmen und den Boden vorsichtig um einige mm (je nach den spezifischen Bodeneigenschaften) mit einem Verdichtungswerkzeug komprimieren (Abbildung 2B).
    5. Wiederholen Sie 2.1.3 - 2.1.4, bis das Rhizotron mit Erde gefüllt ist (Abbildung 2C). Lassen Sie eine Lücke von 3 cm an der Spitze für die anschließende Pflanzung von Sämlingen in das Rhizotron.
    6. Wiegen Sie das bodengefüllte Rhizotron (darunter 8 kleine Platten und 16 Klemmen) und erfassen Sie das Gewicht. Subtrahieren Sie daraus das in 2.1.2 erhaltene leere Rhizotrongewicht und erfassen Sie die Gewichtsdifferenz, d.h. die Masse feuchter Böden Equation 7 (g), im Rhizotron.
    7. Berechnen Sie die Masse des trockenen Bodens im Equation 8 Rhizotron,(g), nach Eq. 1, und berechnen Sie dann die trockene Bodenmassendichte Equation 9 (g cm-3), im Rhizotron nach Eq. 2.
      Equation 1
      Equation 2
      Hierist Equation 10 (cm3) das gesamte Innenvolumen des Rhizotrons.
      HINWEIS: Typische Equation 9 Werte im Rhizotron liegen zwischen 1,0-1,4 g cm-3. Überschreiten Sie 1,5 g cm-3 nicht, da das Wurzelwachstum über diesem Wert behindert werden könnte.
    8. Legen Sie das bodengefüllte Rhizotron auf eine Stützbox und entfernen Sie alle Klemmen und kleinen Platten aus dem Rhizotron (Abbildung 2D). Reinigen Sie den Rhizotronrahmen (d. h. Kanten) sorgfältig mit Tissuepapier, da verbleibende Bodenpartikel am Rahmen Leckagen verursachen können.
      HINWEIS: Die exponierte Bodenoberfläche muss homogen sein und ohne Risse oder Lücken mit dem Rhizotronrahmen nivelliert sein. Wenn nicht, leeren Sie das Rhizotron und wiederholen Sie 2.1.2 - 2.1.8.
    9. Schneiden Sie zwei Stücke Polytetrafluorethylen (PTFE)(Materialtabelle)Folie auf 22 cm x 13 cm pro Stück. Schneiden Sie außerdem ein Stück Plastikfolie auf 46 cm x 15 cm. Zeichnen Sie die Summe der PTFE- und Kunststofffoliengewichte auf. Legen Sie das erste Stück PTFE-Folie auf die obere Hälfte der exponierten Bodenoberfläche in das Rhizotron und erstrecken sich über 1 cm über den Bodenniveau an der Oberseite des Rhizotrons.
    10. Befestigen Sie die PTFE-Folie vorsichtig mit Klebeband am Rhizotronrahmen (Abbildung 2E). Beginnen Sie mit der Befestigung einer Ecke an der Spitze des Rhizotrons zuerst, gefolgt von seiner gegenüberliegenden Ecke und schließlich den beiden Ecken weiter unten im Rhizotron. Tragen Sie Die Spannung auf, wenn Sie die Ecken 2-4 fixieren, um eine flache Folienoberfläche zu gewährleisten. Wenn Falten entstehen, öffnen und fixieren Sie das Band an einzelnen Ecken (nicht alle auf einmal), bis alle Falten entfernt sind und die PTFE-Folie flach und angrenzend an die Bodenoberfläche ist.
    11. Legen Sie das zweite Stück PTFE-Folie am unteren Ende des Rhizotrons, überlappen Sie das obere PTFE-Folienstück um 1 cm. Wiederholen Sie 2.1.10 für die Befestigung der zweiten PTFE-Folie am Rhizotron.
    12. Legen Sie die Kunststofffolie (46 cm x 15 cm) auf die PTFE-Folien. Befestigen Sie die Kunststofffolie mit dem Fixierungsverfahren, wie in 2.1.10 beschrieben.
    13. Legen Sie eine Frontplatte auf das mit Boden gefüllte und folienbedeckte Rhizotron. Legen Sie eine Schiene um jede Seite des Rhizotrons und ziehen Sie die Schrauben von Hand fest, um die Schienen und damit die Frontplatte am Rhizotron zu fixieren. Die Schrauben sind zur geschlossenen Seite des Rhizotrons positioniert, d.h. zur Seite mit den Bewässerungslöchern (Abbildung 1A).

Figure 2
Abbildung 2: Rhizotron-Montage und -Füllung zum Anbau von Pflanzen im Boden für die solute Bildgebung in der Rhizosphäre. (A) Bodenfüllung in das Rhizotron. (B) Verdichtung des gefüllten Bodens mit einem Verdichtungswerkzeug. (C) Bodengefülltes Rhizotron mit kleinen Acrylplatten und Klemmen. (D) Bodengefülltes Rhizotron mit exponierter Bodenoberfläche. (E) Bodengefülltes Rhizotron teilweise mit einer schützenden PTFE-Folie bedeckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Rhizotron-Handhabung und DGT-Gelanwendung. (A) Bodenbewässerung mit 10 ml Pipettenspitzen in den Bewässerungslöchern im hinteren Teil des Rhizotrons. (B) Pflanzung von Sämlingen (als grüne Flecken gekennzeichnet) in das bodengefüllte und geschlossene Rhizotron. (C) Rhizotron mit Salix smithiana-Stecklingen bepflanzt und vordere Platte und Kunststofffolienabdeckung entfernt. (D) Vor dGT-Gelauftragen die PTFE-Folienabdeckung vorsichtig abschälen. (E) Hochauflösendes Foto der Boden-Wurzel-Schnittstelle ROI. (F) Auftragen der mit dem DGT-Gel ausgestatteten Frontplatte auf das Rhizotron. (G) Foto des ROI mit dem DGT-Gel, das während der Probenahme aufgetragen wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Bewässerung des Bodens
    1. Bestimmen Sie die Wasseraufnahmekapazität (WHC) des Versuchsbodens im Rhizotron. Zu diesem Zweck zwei Rhizotrone mit offenem Boden herstellen und mit Erde gemäß Abschnitt 2.1 füllen. Diese offenen, bodengefüllten Rhizotrone vollständig sättigen, indem sie 16 h in einen Wasserbehälter getaucht werden und die Rhizotronen 8 h abtropfen lassen.
    2. Nehmen Sie eine zusammengesetzte Bodenprobe von 50 g aus zufälligen Positionen in den offenen Rhizotronen und trocknen Sie die Probe bei 105 °C, um Equation 6 nach Eq. S1 zu bestimmen. Der Equation 6 Ermittelte entspricht dem WHC des Bodens und wird daher als Equation 11 (g g-1 )ausgedrückt.
    3. Definieren Sie das Ziel Equation 6 im experimentellen Rhizotron. Legen Sie während der Wachstumsphase Equation 6 60 % des WHC (d. h. den WHC-Faktor Equation 12 ) fest, um Pflanzen mit einer ausreichenden Wassermenge zu versorgen und gleichzeitig anoxische Bedingungen im Rhizotron zu vermeiden.
    4. Berechnen Sie die Gesamtmasse des zuzurechnenden Wassers Equation 13 (g), um den Boden im Rhizotron am Ziel Equation 6 gemäß Eq. 3 zu bewässern. Berücksichtigen Sie die Wassermasse, die im Boden im Rhizotron vorhanden ist, Equation 14 (g).
      Equation 3
    5. Dividieren Sie Equation 13 durch die Anzahl der Rhizotronbewässerungslöcher (hier 14), um die Wassermasse zu erhalten, die in jedes Bewässerungsloch zugegeben werden soll. Fügen Sie Wasser hinzu, indem Sie 10 ml Pipettenspitzen in die Bewässerungslöcher schieben und das Wasser durch Schwerkraft in den Boden fließen lassen (Abbildung 3A).
  2. Pflanzenwachstum
    1. Vorkeimen von Samen der Versuchspflanze (z.B. auf Nassfilterpapier) entsprechend den spezifischen Samenkeimanforderungen bis zum Entstehen des Radikels (bis zu 1 cm lang).
    2. Pflanzen Sie bis zu zwei Sämlinge in das Rhizotron, wie in Abbildung 3Bangegeben. Bei der Pflanzung 5 ml Wasser direkt zu den Sämlingen geben, um ihr Wachstum zu unterstützen. Bedecken Sie die obere Öffnung des Rhizotrons für die ersten zwei Tage nach der Pflanzung mit einem transparenten, feuchtigkeitserhaltenden Film (Tabelle der Materialien). Wickeln Sie das Rhizotron in Aluminiumfolie, um mikrophytisches Wachstum zu verhindern.
      HINWEIS: Neben Sämlingen können Auch Pflanzenschnitte in Rhizotronen angebaut werden.
    3. Übertragen Sie das gepflanzte Rhizotron in einen Wachstumsraum, wobei die Umgebungsbedingungen (z. B. Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Lichtintensität) auf die spezifischen Pflanzenanforderungen eingestellt sind. Neigen Sie das Rhizotron bei 25°-35°, um die Wurzelentwicklung neben der Frontplatte über Gravitropismus zu gewährleisten.
    4. Während des Pflanzenwachstums wird der Zielwassergehalt im Rhizotron gravimetrisch durch periodische Bewässerung alle 2-4 Tage mit den Rhizotron-Bewässerungslöchern gemäß 2.2.5 beibehalten. Halten Sie die Bodenoberfläche an der oberen Öffnung feucht durch regelmäßige Zusätze von 5 ml Wasser.
      HINWEIS: Wenn Pflanzen über einen längeren Zeitraum angebaut werden und die pflanzende Biomasse die dem Rhizotron durch die vorgeschlagene Methode zugesetzte Wassermenge erheblich verringern wird, berücksichtigen Sie das Gewicht der pflanzenreichen Biomasse durch den Anbau von Pflanzen in separaten Rhizotron-Replikationen und die Ernte und Dasgewicht der Pflanzengewebe in definierten Intervallen.
    5. Sobald wurzeln einen geeigneten Ort entlang der Frontplatte erreichen, bevorzugt in der Mitte des Rhizotrons, tragen Sie DGT-Gele für die Probenahme der rhizosphärischen Solute-Verteilung auf.

3. Probenahme der gelösten Verteilung

  1. Gel-Anwendung
    1. Erhöhung Equation 6 des Rhizotrons von 60 % Equation 11 auf 80 % Equation 11 24 h vor der Gelanwendung gemäß 2.2.4.-2.2.5. Dies sorgt für einen guten Boden-Gel-Kontakt und ermöglicht eine solute Diffusion in das Gel bei gleichzeitiger Vermeidung anoxischer Bodenbedingungen bei der Probenahme.
    2. Nehmen Sie eine neue, säuregereinigte Frontplatte, richten Sie sie auf das für die Probenahme verwendete Rhizotron aus und markieren Sie die Bereiche von Interesse (ROIs) auf der Platte. Übertragen Sie die Platte in eine laminare Strömungsbank oder eine andere staub- und metallfreie Umgebung, unmarkiert nach oben.
    3. Schneiden Sie das DGT-Bindungsgel auf einem Acrylträger auf die erforderliche rechteckige Größe, die dem ROI entspricht, in der Regel etwa 3 cm × 5 cm, mit PTFE-beschichteten Rasierklingen. Schneiden Sie das Gel, indem Sie die Rasierklinge drücken, anstatt sie zu schieben, um einen klaren Schnitt zu gewährleisten. Legen Sie das rechteckige Gelstück auf die unmarkierte Seite der Platte an der markierten Position des ROI.
      HINWEIS: Wenn HR-MBG verwendet wird, kann unter dem Gel eine 100 m dünne Abstandsfolie hinzugefügt werden, um sicherzustellen, dass das Gel in gutem Kontakt mit dem Bodenwurzelsystem ist.
    4. Schneiden Sie eine 10 m dünne Polycarbonatmembran (0,2 m Porengröße; Materialtabelle) auf eine Größe, die die Gelgröße um ≥1 cm an jeder Seite verlängert und die Membran auf das Gel legen. Tragen Sie etwas Wasser auf, um Luftblasen aus dem Stapel zu entfernen.
    5. Befestigen Sie die Membran entlang aller vier Kanten mit Vinyl-Elektroband (Tabelle der Materialien). Entfernen Sie dabei sorgfältig Luftblasen, die zwischen dem Gel und der Membran mit einer Kunststoff-Pinzette eingeschlossen sind. Das Band darf nur mit der Membran und nicht mit dem Gel in Kontakt kommen.
      HINWEIS: Wenn das Band mit dem Gel in Berührung kommt, Luftblasen zwischen dem Gel und der Membran gefangen sind oder die endgültige Membranoberfläche Falten zeigt, muss der Gel/Membran-Stack wieder zusammengesetzt werden, da der diffusive Fluss von Gelösten in das Gel35 beeinträchtigt werden kann (Wiederholung 3.1.3 - 3.1.5).
    6. Legen Sie das Rhizotron auf einen Ständer, entfernen Sie die Schienen und heben Sie vorsichtig die Frontplatte ab (Abbildung 3C). Entfernen Sie die Kunststofffolie, schneiden Sie die PTFE-Folie an den Rändern des Rhizotrons ab und ziehen Sie die PTFE-Folie langsam ab, um Störungen des Bodenwurzelsystems zu vermeiden (Abbildung 3D).
    7. Nehmen Sie ein orthogonales Foto des ROI mit einer digitalen Single-Linsen-Reflex -Kamera (DSLR)(Tabelle der Materialien) auf, um die Interpretation und Darstellung der gelösten Verteilung basierend auf der Bodenstruktur und Wurzelmorphologie zu erleichtern (Abbildung 3E). Verwenden Sie einen Kameraständer und, falls verfügbar, ein Makroobjektiv. Richten Sie die Kamera so aus, dass die Mitte des Fotos dem Mittelpunkt des ROI entspricht und die Fokusebene der Kamera parallel zur Bodenoberfläche verläuft. Fügen Sie eine Maßstabsleiste (z. B. ein Lineal) in das Foto ein.
    8. Befestigen Sie die mit dem Gel/Membran-Stack ausgestattete Platte am offenen Rhizotron (Abbildung 3F). Richten Sie daher eine Kante der Platte mit einer Kante des Rhizotrons aus und "biegen" Sie die Platte sanft in Richtung Boden. Diese Art der Anwendung hilft, Luftblasen zwischen dem Gel/Membran-Stack und dem Bodenwurzelsystem zu vermeiden. Befestigen Sie die Frontplatte mit den Schienen und Schrauben.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend und muss sorgfältig ausgeführt werden. Die Platte kann nicht bewegt werden, nachdem sie den Kontakt zwischen dem Gel/Membran-Stack und dem Bodenwurzelsystem aufgenommen hat, ohne Boden und Wurzeln zu verdrängen.
    9. Zeichnen Sie die genaue Startzeit der Gel-Bereitstellung auf und machen Sie ein Foto des eingesetzten Gels am ROI gemäß 3.1.7 (Abbildung 3G). Das Rhizotron in Aluminiumfolie wickeln und bis zum Ende der Probenahmeperiode (oft 24 h) in den Wachstumsraum überführen.
  2. Gel-Retrieval
    1. Legen Sie das Rhizotron auf eine Stützbox, heben Sie vorsichtig die Frontplatte ab und spülen Sie den Gel/Membran-Stack auf der Platte mit Wasser ab, um haftende Partikel abzuwaschen (Abbildung 4A). Zeichnen Sie die genaue Endzeit der Gelbereitstellung auf. Proben Sie Boden aus dem ROI, um den tatsächlichen wBoden im Rhizotron nach Eq. S1 zu bestimmen.
    2. Übertragen Sie die Frontplatte in die laminare Fließbank, Gel/Membran-Stack nach oben. Holen Sie das Gel von der Frontplatte ab, indem Sie zuerst das Band entlang aller vier Kanten und dann die Polycarbonatmembran, die das Gel bedeckt, vorsichtig entfernen (Abbildung 4B). Tragen Sie Wasser auf, damit das Gel frei auf einem dünnen Wasserfilm auf der Platte schwimmt, wobei die bodenkontaktige Seite nach oben gerichtet ist.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Gelausrichtung zu verfolgen. Die Gelseite, die dem Boden und den Wurzeln ausgesetzt ist, muss immer nach oben (zum Benutzer) zeigen.
  3. Geltrocknung
    1. Schneiden Sie ein rechteckiges Stück Gel-Blotting-Papier (Tisch aus Materialien) und legen Sie ein etwas kleineres Stück einer Polyethersulfon-Membran (0,45 m Porengröße; Materialtabelle) oben.
    2. Übertragen Sie das Gel von der Platte auf den Gel-Blotting-Papier/Membran-Stack mit Einer Kunststoff-Pinzette, bodenkontaktgebundene Seite nach oben. Das Gel muss entspannt (d.h. nicht gedehnt) und völlig flach sein, ohne Luftblasen zwischen Gel und Membran. Tragen Sie etwas Wasser auf den Gel-Blotting-Papier/Membran-Stack auf, um den Geltransfer und die Positionierung zu erleichtern.
    3. Bedecken Sie den Gelblotting-Papier-/Membran-/Gelstapel vollständig mit einem Stück Plastikfolie und beschriften Sie die Gelprobe und ihre Ausrichtung auf der Kunststofffolie (Abbildung 4C). Legen Sie das Gel blotting Papier/Membran/Gel/Kunststofffolie Stapel in einem Vakuum-Gel-Trockner(Tabelle der Materialien) und trocknen, bis der Stapel vollständig ausgetrocknet ist (typischerweise 48-72 h). Stellen Sie für HR-MBG die Temperatur auf 50-55 °C ein, für HR-ABG und HR-CBG am besten trocken bei Raumtemperatur.
    4. Entfernen Sie das Gelblotting-Papier aus dem getrockneten Stapel und übertragen Sie das Gel, das nun untrennbar mit der Polyethersulfonmembran verschmolzen ist, in eine Reißverschlusstasche. Die Kunststofffolienabdeckung bleibt bis kurz vor der LA-ICP-MS-Analyse auf dem Gel.
    5. Fügen Sie ein Gelstück aus dem ursprünglichen Gelblatt als Methode Leerling, die nicht dem Boden ausgesetzt wird. Verarbeiten Sie das Verfahren roh gel identisch mit der Probe Gel nach 3.3.2 - 3.3.4.

Figure 4
Abbildung 4: DGT-Gelabruf und -zubereitung zum Trocknen bei gelöster Probenahme. (A) Platte mit dem DGT-Gel und Rhizotron direkt nach der Probenahme. (B) Abruf des DGT-Gels von der Platte in einer laminaren Fließbank. (C) Stapel von Gel-Blotting-Papier/Polyethersulfon-Membran/DGT-Gel/Kunststofffolienabdeckung für die Geltrocknung. Beachten Sie, dass das Gel nach seiner Einführung auf dem Rhizosphärenboden leicht gefärbt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Chemische Analyse des DGT-Bindungsgels

ANMERKUNG: In diesem Protokoll wird die Analyse der gelösten Verteilung auf dem DGT-Bindungsgel von LA-ICP-MS mit einem Nanosekunden-ArF-Excimer-LA-System durchgeführt, das mit einer zweibändigen Ablationszelle ausgestattet ist, die an ein Quadrupol-ICP-MS gekoppelt ist (Abbildung 5). Alle Instrumente sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt. Alternativ können Nanosekunden 213 nm oder 266 nm Festkörper-LA-Systeme angewendet werden36,39,40,41,42,43. Wenn eine erhöhte Empfindlichkeit oder Massenauflösung erforderlich ist, ist das Sektorfeld ICP-MS eine Alternative zu Quadrupol ICP-MS15,44. Einzelheiten zur Herstellung von DGT-Gelstandards für die externe Kalibrierung und Kopplung des LA-Systems an das Quadrupol ICP-MS sind in den SI-Abschnitten S4 und S5dargestellt.

Figure 5
Abbildung 5: LA-ICP-MS-Setup für die DGT-Gelanalyse. (A) Nanosekunde 193 nm ArF excimer LA-System und Quadrupol ICP-MS. (B) Getrocknete Gele, die auf Glasplatten montiert und auf der LA-Probenstufe befestigt sind und bereit für die Einbringung in die Ablationszelle sind. (C) Verneblergas (Ar) aus ICP-MS und Aerosolträgergas (He oder Ar) aus ablation cell, die über einen zweiseitig mit dem ICP verbundenen IcP über einen zweiseitig y-Splitter und einen Brenneradapter angeschlossen sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Probenvorbereitung für LA-ICP-MS
    1. Übertragen Sie die getrockneten Gelproben, Standards und Verfahrensrohlinge (die mit der Polyethersulfon-Membranstütze verschmolzen werden) auf einzelne Stücke von doppelseitigem Klebeband(Materialtabelle),Gelseite nach oben. Schneiden Sie überschüssige Bandteile zu, um Platz in der Ablationszelle zu sparen.
    2. Montieren Sie die getrockneten Gele auf Glasplatten. Verwenden Sie einzelne Glasplatten für jede Gelprobe, Standardserie oder Methode Rohling, um eine flexible Anordnung auf der LA-Probenstufe zu ermöglichen (typische Größe von 10 cm × 10 cm). Verwenden Sie einen Glasschneider, um die Glasplattengröße nach Bedarf anzupassen. Befestigen Sie die Glasplatten mit den Gelen auf der LA-Probenstufe (Abbildung 5B) mit Plasticin (Materialtabelle). Richten Sie die Geloberfläche, indem Sie den Bühnenboden anpassen, und sperren Sie die Probenstufe in die Ablationszelle.
  2. LA-ICP-MS Line-Scan-Analyse
    1. Koppeln Sie das LA-System mit dem ICP-MS, wie im SI-Abschnitt S5angegeben. In der LA-Software (Tabelle der Materialien) stellen Sie die Kameralichteinstellungen (d.h. 'Ring', 'Koax' und 'Übertragen') ein, um die Geloberfläche in der Ablationszelle zu beleuchten und sich auf die Geloberfläche zu konzentrieren, indem Sie den Abstand der Z-Achse einstellen. Wechseln Sie zu zufälligen Positionen in der Zelle, um sicherzustellen, dass alle Geloberflächen im Fokus stehen.
    2. Stellen Sie die LA-Parameter im Fenster"Laser Setup"der LA-Software ein. Typische Einstellungen, die in der LA-ICP-MS-Line-Scan-Analyse von DGT-Gelen verwendet werden, sind: Modus kontinuierlich; Energieleistung 20-30%; Wiederholungsrate 10-20 Hz; Spotdurchmesser 100-200 m; Scangeschwindigkeit 150-250 s-1.
      HINWEIS: Die Parameter müssen für die Art des verwendeten Gels optimiert werden und können variieren. Parameter können auch verbessert werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen, die räumliche Auflösung zu erhöhen oder die Erfassungszeiten abhängig vom experimentellen und instrumentellen Setup zu reduzieren. Verwenden Sie eine relativ niedrige Energieleistung (≤40 %) und Wiederholungsrate (≤25 Hz), um ein Eindringen durch die Gele in die Trägermaterialien zu vermeiden39. Stellen Sie sicher, dass die Laserscangeschwindigkeit ≤ den Spotdurchmesser geteilt durch die Gesamtdauer des ICP-MS-Scanzyklus (siehe 4.2.6) ist, um eine Komprimierung der Datenpunkte und damit einen Auflösungsverlust in Scanrichtung45zu vermeiden. Wenn Sie z. B. einen Spotdurchmesser von 200 m und eine Gesamtdauer des ICP-MS-Scanzyklus von 0,25 s einstellen, sollte die Scangeschwindigkeit ≤800 s-1betragen.
    3. Wählen Sie das Linienwerkzeug aus, und zeichnen Sie ein einzelnes, 1 mm langes Linienmuster über einen Gelstandard. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Linienmuster im Fenster"Scanpatterns",und stellen Sie sicher, dass die LA-Parameter in 4.2.3 festgelegt sind. angenommen wurden. Verwenden Sie das Werkzeug 'Duplicate Scans', um diese Linie viermal zu duplizieren, wobei ein Interline-Abstand (Abstand zwischen der Linienmitte) größer als der Spotdurchmesser ist (Abbildung 6). Dieser Ansatz bietet insgesamt fünf parallele Linien pro Gelstandard (n = 5). Wiederholen Sie diesen Schritt für jeden Gelstandard, Kalibrierrohling und Methodenrohling.
    4. Wechseln Sie zur Gelprobe, und zeichnen Sie eine einzelne Linie entlang des oberen Rands des zu analysierenden rechteckigen Bereichs. Duplizieren Sie die Linie, um parallele Linien für den gesamten Stichprobenbereich zu erstellen, wie in 4.2.3 angegeben. Verwenden Sie einen Interline-Abstand von 300-400 m. Stellen Sie sicher, dass der Fokus (Z-Achsenabstand) für jeden Start- und Endpunkt jeder Linie korrekt eingestellt ist.
      HINWEIS: Die räumliche Auflösung der Analyse ist entlang der Scanrichtung höher als die Interline-Entfernung. Daher können Start- und Endpunkte der Linien am besten der Richtung der Analytengradienten folgen. Bei Rhizosphärengradienten ist dies in der Regel senkrecht zur Wurzelachse (Abbildung 6).
    5. In der ICP-MS-Software (Tabelle der Materialien) eine zeitaufgelöste ' DataOnly' Methode im Bildschirm 'Methode' einrichten, für jeden Analyten ein oder mehrere geeignete Isotope auswählen und 13C als interneNormalisierungsnorm 31,36,40,41,42einschließen. Stellen Sie sicher, dass die Detektion der Isotope nicht durch Interferenzen beeinträchtigt wird46.
    6. Legen Sie die Gesamtscanzyklusdauer der ICP-MS-Methode ('Est. Reading Time') auf ≤0,5 s mit entsprechenden Verweilzeiten pro Isotopen (in der Regel zwischen 10-50 ms) fest. Legen Sie den ICP-MS'Messwerte' auf 1 fest und ändern Sie den Wert 'Messwerte/Replikation', um die Gesamtmesszeit pro Probe ('Est. Sampling Time'), d. h. pro einzelner Ablationslinie, festzulegen. Dies hängt von den spezifischen LA-Parametern und Leitungsabständen ab, die in 4.2.2 - 4.2.4 eingestellt sind.
    7. Verwenden Sie für die Datenberichterstattung einen Intensitäts-/Zeiterfassungsmodus und legen Sie dieDateischreiboptionauf 'New Per Sample' fest, um eine individuelle Datendatei (hier .xl) für jede Ablationszeile zu erstellen.
    8. Richten Sie eine" Batch'Sample-Sequenz im ICP-MS 'Sample' Bildschirm ein, wobei jeder Stichprobeneintrag einer einzelnen Ablationsleitung entspricht, die in 4.2.3 - 4.2.4 eingestellt ist.
    9. Klicken Sie auf 'Batch analysieren', um die Beispielsequenz auf dem ICP-MS zu initiieren, die mit der Datenerfassung wartet, bis sie vom ersten Laserpuls ausgelöst wird (Details zur Triggerkonfiguration finden Sie unter SI S5).
    10. Wählen Sie in der LA-Software alle zu analysierenden Linien aus und überprüfen Sie, ob die ICP-MS-Methode ('Est. Sampling Time', siehe 4.2.6.) mit der Dauer der einzelnen Leitungsablationen übereinstimmt, die sich in der Regel für Gelproben, Standards und Methodenrohlinge unterscheidet. Wiederholen Sie 4.2.6. , um die ICP-MS-Methode bei Bedarf anzupassen.
    11. Klicken Sie im Fenster"Laserenergie" auf 'Emission', um den Laserkopf aufzuladen, und klicken Sie dann auf 'Ausführen', um das ' Experimentausführen' zu öffnen. Wählen Sie hier 'Nur ausgewählte Muster', stellen Sie die 'Washout Delay' auf 20-30 s ein, markieren Sie das Feld ' Laser während Scansaktivieren' und stellen Sie die 'Laser Warmup Time' auf 10 s ein.
    12. Klicken Sie im Fenster ' Experiment ausführen ' auf'Ausführen vonExperimenten', um die Line-Scan-Analyse zu starten und die Rohsignalintensität pro Sekunde (cps) für jedes Isotop auf dem ICP-MS in Echtzeit zu überwachen. Jede Linie sollte beginnen('Laser Warmup Time', 10 s) und end ('Washout Delay', 20-30 s) mit einem Gasrohling.
    13. Überwachen Sie den Lasereinfluss (J cm-2) während der Analyse, um die Laserstabilität zu bewerten. Wenn der Einfluss stark variiert, brechen Sie die Analyse ab, und stellen Sie sicher, dass die Laserquelle und/oder ihr Spiegelsystem voll funktionsfähig sind.
    14. Beenden Sie nach der Analyse das ICP-MS-Plasma und stellen Sie den Trägergasdurchfluss des LA-Systems auf 0 mL min-1ein. Entfernen Sie die Gele aus der Ablationszelle und lagern Sie sie in Reißverschlussbeuteln für die weitere Verwendung.

Figure 6
Abbildung 6: Schematic des DGT LA-ICP-MS-Experimentalentwurfs (nicht maßstabsgetreu). Die Abbildung zeigt die DGT-basierte In-situ-Solute-Probenahme in der Rhizosphäre und die LA-ICP-MS-Zuordnung der gelösten Verteilung auf der Geloberfläche, einschließlich einer Nahaufnahme, die beispielhafte Linienscan-Dimensionen und -Parameter zeigt. Beachten Sie, dass das DGT-Gel horizontal gekippt wird, wenn es vom Rhizosphärenboden auf die Glasplatte übertragen wird, wie die Position des Rechtecks in der unteren Ecke des DGT-Gels zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Datenverarbeitung und Kalibrierung
    1. Importieren Sie die Rohdatendatei (.xl) für jede abierte Zeile in der Tabellenkalkulationssoftware (Tabelle der Materialien). Die Rohdatentabelle zeigt die ICP-MS-Messwerte (Datenpunkte) für jedes Isotop in cps und die entsprechenden Zeitpunkte in s. Listet alle Zeilen nebeneinander in verschiedenen Spalten auf.
    2. Bewerten Sie die Line-Scan-Daten auf Signalstabilität des internen Standards (13C) und angemessene Auswaschzeiten.
    3. Berechnen Sie einen durchschnittlichen Gasrohling für jedes Isotop aus allen Gas-Leerwerten, die vor den Leitungsablationen (d. h. während der Laser-Aufwärmzeit) aufgezeichnet wurden, und subtrahieren Sie den durchschnittlichen Gasrohling von den entsprechenden Rohintensitäten für jedes Isotop, um das Hintergrundsignal zu korrigieren.
    4. Wenden Sie die interne Normalisierung an, indem Sie die Signalintensität jedes Isotops (cps) durch die Signalintensität des internen Standards (cps) für jeden Datenpunkt dividieren, um Variationen der Menge an ablatedem und instrumentellem Drift materialzukorrigieren.
    5. Zuschneiden von Daten vor dem Start und nach dem Ende jeder abierten Linie, um das Hintergrundsignal zu entfernen. Transponieren Sie die Datentabelle, um eine Rastermatrix zu erhalten, in der jede Zeile einer abkatapunktierten Linie und jede Spalte einem normalisierten Isotopenintensitätswert entspricht. Trennen Sie die Matrizen für jedes Isotop in einzelne Arbeitsblätter.
    6. Berechnen Sie das durchschnittliche normalisierte Signalintensitätsverhältnis pro Isotop für die Kalibrierstandards und Kalibrierrohlinge und berechnen Sie die Kalibrierfunktion (y = ax + b) mit einem linearen Regressionsmodell mit den Gel-Standard-Analytenbelastungen (g cm-2; siehe SI S4) als x-Werte. Bewerten Sie die Kalibrierfunktion jedes Isotops für linearität47.
    7. Wenden Sie die Kalibrierungsfunktion auf die Probendatenmatrix an. Konvertieren Sie die normalisierten Signalintensitätsverhältnisse, Equation 15 , in Gelanalytbelastungen, Equation 15 (g cm-2), und anschließend in zeitgemittelte gelöste Flussmittel, Equation 17 (pg cm-2 s-1), für jedes Isotop und Datenpunkt nach Eq. 4 und Eq. 5:
      Equation 4
      Equation 05
      Hier ist a die Steigung der Kalibrierlinie, b das Abfangen der Kalibrierlinie und t (s) die Gel-Bereitstellungszeit während der Probenahme.
    8. Speichern Sie die kalibrierte Probendatenmatrix für jeden Analyten als txt-Datei.
  2. Bildgenerierung
    HINWEIS: Achten Sie darauf, bei allen Schritten der Bildgenerierung keine Pixelinterpolation zu vermeiden, da dies zu künstlich geglätteten solute Flussgradienten in den resultierenden Bildern führen kann.
    1. Importieren Sie die kalibrierte Probendatenmatrix (.txt) als Textbild in der Bildanalysesoftware (Materialtabelle).
    2. Berechnen Sie den Abstand pro Pixel in x-Richtung (d. h. die seitliche Auflösung), indem Sie die Laserscangeschwindigkeit mit der Gesamtdauer des ICP-MS-Scanzyklus multiplizieren (z. B. bei einer Scangeschwindigkeit von 200 s-1 und einer Gesamtscanzyklusdauer von 0,25 s entspricht die seitliche Auflösung 50 m). Der Abstand pro Pixel in y-Richtung entspricht dem Interline-Abstand (Abbildung 6).
    3. Berechnen Sie den Seitenverhältniskorrekturfaktor des Bildes. Teilen Sie daher den Abstand pro Pixel in y-Richtung (z. B. 300 m) durch den Abstand pro Pixel in x-Richtung (z. B. 50 m). Wenden Sie den erhaltenen y/x-Korrekturfaktor (in diesem Beispiel 6) unter 'Skala' an. Wenden Sie den Abstand pro Pixel (in m oder mm) in x-Richtung als Skalierung unter'Maßstab festlegen'an.
    4. Wenden Sie eine 'Look Up Table' an, d.h. pseudofarbene Skala zur besseren Visualisierung chemischer Farbverläufe im gelösten Bild, und passen Sie das Bild 'Farbbalance' an, um die unteren/oberen Grenzen des Anzeigebereichs zu steuern. Fügen Sie eine' Kalibrierungsleiste' hinzu und speichern Sie das gelöste Bild als tiff-Datei.
    5. Kopieren Sie das unentschlossene Bild mit dem Befehl 'Copy to System' in der Bildanalysesoftware und fügen Sie es in die Desktop-Publishing-Software ( Tabelle der Materialien)ein. Skalieren, ausrichten und komponieren Sie das gelöste Bild mit dem Foto des ROI in 3.1.7.
      ANMERKUNG: Ändern Sie vor dem Kopieren die Größe des gelösten Bildes durch z. B. Faktor 10 über die Anwendung einerX-Skalavon 10 und einer 'Y-Skala' von 10 unter 'Set scale', um ausreichende Pixel für die Veröffentlichung mit hoher Auflösung sicherzustellen.
DGT Gelherstellung Pflanzenanbau In situ-Solute-Probenahme LA-ICP-MS Solute Flussmapping
HR-MBG
1 Woche 		Bodenaufbereitung
1 Woche 		Gel-Anwendung
1 Stunde pro Gel 		Probenvorbereitung
1 Stunde pro Gel
HR-ABG
3 Tage 		Rhizotron-Montage
2 Stunden pro Replikation 		Solute Probenahmezeit
variabel, in der Regel 24 Stunden 		LA-ICP-MS-Analyse
1 Tag pro Gel
HR-CBG
3 Tage 		Pflanzenwachstum
abhängig von der Studie 		Gel-Retrieval
1 Stunde pro Gel 		Datenverarbeitung
4 Stunden pro Gel
Geltrocknung
2-3 Tage 		Bildgenerierung
10 min pro Bild

Tabelle 1: Ungefähre Zeiten für allgemeine Schritte der DGT LA-ICP-MS-Technik.

Representative Results

Um die Fähigkeit und die Datendetails des DGT-Bildgebungsverfahrens zu veranschaulichen, haben wir die Sub-mm-, 2D-Flussverteilung mehrerer lamitischer Nährstoff- und Schadstoffsolute-Arten im Boden neben den Wurzeln von Fagopyrum esculentum und Salix smithiana zusammengestellt (Abbildung 7). Ungefähre Zeiten für allgemeine Verfahrensschritte des Protokolls sind in Tabelle 1dargestellt.

Solute Bilder in Abbildung 7 wurden in drei verschiedenen Studien mit HR-MBG- oder HR-CBG-Bindungsgelen erzeugt. Die chemischen Bilder zeigen die 2D-Gelöststromverteilung mit einer räumlichen Auflösung von 82-120 m entlang der x-Achse und 300-400 m entlang der y-Achse, abhängig von den verwendeten LA-ICP-MS-Parametern. Da während der Bildkalibrierung und Größenänderung keine Interpolation angewendet wurde, stellen einzelne Pixel gemessene Datenpunkte dar. Die Ausrichtung der gelösten Bilder mit einem fotografischen Bild des ROI zeigt, dass die sub-mm, 2D-gelöste Flussverteilung verschiedener Elemente je nach Bodenstruktur und Wurzelmorphologie sehr variabel ist. Dies ist auf das differenzielle biogeochemische Verhalten der Elemente im Boden-Rhizosphären-Pflanzensystem und deren Wechselwirkung mit der Bodenmatrix und den Pflanzenwurzeln zurückzuführen.

In Abbildung 7A labile anorganische Mg, Al, P, Mn und Fe solute Flussmittel wurden um eine junge F. Esculentumwurzel in karbonatfreien Boden mit NH4NO3gedüngt wachsen visualisiert. Die submm solute Verteilung zeigte Zonen von verringerten Al-, P- und Fe-Flussen neben älteren Wurzelabschnitten aufgrund der Wurzelaufnahme und stark erhöhten Mg-, Al-, P-, Mn- und Fe-Flussanten an der Wurzelspitze aufgrund lokalisierter P-Mobilisierungsprozesse der F. esculentum-Wurzel. Beachten Sie, dass sich die Wurzelspitze etwas hinter der Bodenoberfläche befindet und daher im fotografischen Bild kaum sichtbar ist. Abbildung 7B zeigt die Verteilung von labilen Spurenmetallen, einschließlich Mn, Fe, Zn, Cd und Pb um eine Wurzel der metalltoleranten S. smithiana, die in einem Boden angebaut wird, der mäßig mit Zn, Cd und Pb kontaminiert ist. Die solute Bilder visualisierten eine deutliche Erschöpfung insbesondere von Zn, Cd und Pb an der unmittelbaren Wurzelposition und zeigten, dass S. smithiana Wurzeln als lokalisierte Senke für labile Spurenmetalle in kontaminierten Böden wirken. Außerdem können lokalisierte Zn-, Cd- und Pb-Flusszunahmen beobachtet werden, was auf eine Ansammlung dieser Spurenmetalle an der unmittelbaren Boden-Wurzel-Schnittstelle hindeutet.

Neben der multielementaren Solute-Bildgebung kann das vorgestellte Verfahren auch mit komplementären diffusionsbasierten Bildgebungstechniken wie planaren Optoden34kombiniert werden. Dies zeigt Abbildung 7C, wo die Verteilung von labilen Spurenmetallen in der Rhizosphäre von S. smithiana mit der Verteilung von pH mit einem kombinierten, einschichtigen planaren Optode-DGT Kationenbindungsgel33kolokalisiert wurde. Das Bodensubstrat wurde mit (NH4)2SO4gedüngt, was zu einer pH-Abnahme entlang der Wurzelachsen um 1 Einheit im Vergleich zu Schüttgut. Die pH-Abnahmen wurden mit erhöhten gelösten Flussflüssen von Mn, Fe, Co, Ni, Cu und Pb kolokalisiert, was auf eine pH-induzierte Metalllöslichkeit hindeutet.

Darüber hinaus zeigen diese Beispielergebnisse einige der potenziellen bildgebenden Artefakte, die erhalten werden können. Beispielsweise können strukturelle Bodeninhomogenitäten, z. B. als horizontale Linie im unteren Drittel des ROI-Bildes von Abbildung 7Abeobachtet, zu Boden-Gel-Kontaktdiskontinuitäten führen, was zu einer begrenzten Diffusion an dieser Stelle in das Bindungsgel führt. Umgekehrt kann eine übermäßige Bodenverdichtung im Rhizotron zu einer schlechten Porosität führen, was zu einer künstlichen Verschiebung des Redoxstatus des Bodens in Richtung Anoxie führt. Dies wird in Abbildung 7Bveranschaulicht, wo ausgedehnte Bereiche mit hoch erhöhten Mn- und Fe-Flussen in den gelösten Bildern visuell mit einer dichten Bodenschicht im ROI-Bild abgeglichen werden. Dies deutet auf ein verringertes Bodenredoxpotenzial aufgrund hoher Bodenverdichtung hin, was zu einer reduktiven Auflösung und Löslichkeit der hochredoxsensitiven Elemente führt. Eine sorgfältige Rhizotronfüllung und Sichtprüfung der Bodenoberfläche direkt nach der Befüllung wird daher empfohlen.

Figure 7
Abbildung 7: Sub-mm 2D-Verteilung von labilen Nährstoffen und Schadstoffgelösten über verschiedene Bodenwurzelschnittstellen. (A) Verteilung von anionischen P und kationischen Mg, Al, Mn und Fe solutes um eine junge F. esculentum Wurzel. Die kolokalisierte Probenahme von anionischen und kationischen Solutes wurde mit HR-MBG für 24 h bei einer Bodenwassersättigung von 75 % WHC erreicht. Die Al-, P- und Mn-Bilder werden als kalibrierte fDGT-Werte (pg cm-2 s-1) angezeigt, während Mg- und Fe-Bilder 13C-normalisierte Intensitäten aufweisen. Maßstabsbalken steht für 1 cm. Diese Zahl ist ab Ref.48angepasst. (B) Verteilung von Mn, Fe, Zn, Cd und Pb um eine S. smithiana Wurzel, die in Böden angebaut wird, die mäßig mit Zn, Cd und Pb kontaminiert sind. Kationische Spurenmetallsolutes wurden mit HR-CBG für 20 h bei einer Bodenwassersättigung von 80 % WHC beprobt. Alle Bilder werden als kalibrierte fDGT-Werte (pg cm-2 s-1) angezeigt. Die Maßstabsleiste stellt 0,5 cm dar. Diese Zahl ist ab Ref.3angepasst. (C) Die Verteilung von pH- und multiplen kationischen Auflösungen um S. smithiana-Wurzeln, die im Boden mit Cd. Co-Lokalisierung von pH- und Solute-Dynamik angebaut wurden, wurde mit einer Modifikation des HR-MBG-Protokolls erreicht, was eine gleichzeitige solute Probenahme und planare Optode-Bildgebung33ermöglicht. Die Mn-, Cu-, Zn- und Cd-Bilder werden als kalibrierte fDGT-Werte (pg cm-2 s-1)angezeigt, während Fe-, Co-, Ni- und Pb-Bilder 13C-normalisierte Intensitäten aufweisen. Maßstabsbalken steht für 1 cm. Diese Zahl ist ab Ref.33angepasst. Die dargestellten Zahlen stammen aus den zitierten Artikeln3,33,48, die unter CC BY lizenziert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Das hier vorgestellte Solute Imaging-Protokoll ist eine vielseitige Methode zur Visualisierung und Quantifizierung von 2D-Nährstoff- und Schadstoffflüssen in Boden-Pflanzen-Umgebungen. Es ist einzigartig in seiner Fähigkeit, Sub-mm-Skala Multi-Elemente-Bilder von labile solute Arten an der Boden-Wurzel-Schnittstelle zu erzeugen, überschreitet die erreichbare räumliche Auflösung von alternativen Methoden zur Messung von gelösten Gradienten in der Rhizosphäre im Wesentlichen4. Der gezielte In-situ-Probenahmeansatz der DGT in Kombination mit einer hochsensiblen chemischen Analysemethode wie LA-ICP-MS erleichtert die detaillierte Untersuchung der Solute-Flussdynamik um einzelne Pflanzenwurzeln, die in Böden oder ähnlichen Substraten angebaut werden. Aufgrund des senenbasierten Probenahmeverfahrens spiegeln die erhaltenen Bilder die Lität der visualisierten Gelöstheit wider und sind daher eine Schätzung ihrer Anlagenverfügbarkeit10. Obwohl die methodeninhärente Messung von gelösten Flussmitteln erhebliche Vorteile wie die Deutungsbarkeit als pflanzenverfügbare Nährstofffraktionen mit sich bringt, sind Flussmessungen viel weniger geradlinig zu verstehen als Porenwasserkonzentrationsmessungen. Die Standard-DGT-Probenahmegeometrie in Massenbodenanwendungen (insbesondere die in diesem Aufbau verwendeten 0,8 mm dicken Diffusionsgele) ermöglicht den Vergleich der tatsächlichen Porenwasserkonzentration csolnund einer zeitgemittelten Porenwasserkonzentrationsschätzung durch eine Massen-DGT-Messung, cDGT, und für die Interpretation dieser Parameter hinsichtlich der Nachschubdynamik einer gelösten Art. Ein solcher Vergleich kann jedoch nicht auf der Grundlage einer bildgebenden DGT-Anwendung mit sehr dünnen Diffusionsschichten durchgeführt werden, da die abgeleiteten c-DGT-Werte unrealistisch klein sind34. Die Bildergebnisse von DGT sind daher nicht immer einfach und schnell zu interpretieren und sind oft nicht direkt mit herkömmlichen Porenwasserkonzentrationsmessungen vergleichbar.

Bei der Anwendung der Methode müssen einige kritische Schritte sorgfältig geprüft werden, hauptsächlich im Zusammenhang mit dem Befüllen und Gießen der Rhizotron-Wachstumsbehälter. Beim Einfüllen des Bodens in das Rhizotron ist es sehr wichtig, eine zu starke Verdichtung des Bodens zu vermeiden, da die Pflanzenwurzeln nicht stark verdichteten Boden eindringen können und das Wurzelwachstum gehemmt wird. Wir haben beobachtet, wie Wurzeln stark verdichteten Boden vermeiden und an den inneren Rändern des Rhizotron-Wachstumsbehälters wachsen, wo der Boden in der Regel weniger verdichtet ist. In diesem Fall können sich einzelne Wurzeln in der Mitte der Rhizotrone, wo DGT-Gel bequem angewendet werden können, überhaupt nicht entwickeln, was eine erfolgreiche Gelanwendung effektiv hemmt. In unserem Labor haben die Erfahrungen gezeigt, dass trockene Bodenmassendichten von 1,0-1,4 g cm-3 eine ungehinderte Wurzelentwicklung ermöglichen. Darüber hinaus ist eine übermäßige Bodenverdichtung auch eine potenzielle Quelle von Artefakten in Bezug auf die Löslichkeit von redoxsensitiven Elementen und biogeochemisch assoziierten Arten. Da das gesamte Porenvolumen reduziert wird und die Porendurchmesserverteilung in stark verdichteten Böden zu niedrigeren Durchmessern verschoben wird, ist weniger luftgefülltes Porenvolumen mit größerem Durchmesser verfügbar, was lokal zu reduktiven Bedingungen führen kann. Folglich können MnIII/IV-undFe-III-Oxidereduziert werden, was zu erhöhten Mn2+ und Fe2+ Flussmitteln führt. Die Auflösung von Feoxiden, die wichtige Sorptionsstandorte z.B. für Phosphat- und Mikronährstoffe sind, kann sorbed eiterte und/oder mitgestürzte Arten befreien und dadurch künstlich erhöhte Flussflüsse der biogeochemisch assoziierten Arten verursachen. Ein ähnliches Problem kann auftreten, wenn die Wachstumsbehälter zu stark bewässert werden. Die Verdunstung über die kleine Bodenoberfläche an der Spitze des Wachstumsbehälters ist gering und der Boden kann nach der Pflanzung bis zu mehreren Wochen wassergesättigt bleiben, was auch zu Redox-Artefakten führen kann.

Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die chemische Funktionalität des hergestellten HR-DGT-Bindungsgels. Durch das Folgen des Protokolls erhalten dünne Gele mit einer homogenen Verteilung von Bindungsphasen. Wenn die Gele Bereiche mit inhomogener Materialverteilung aufweisen (z.B. Löcher im Gel oder Aggregate von Bindungsphasen), müssen diese Bereiche entfernt oder, wenn zu umfangreich, das Gelherstellungsprotokoll wiederholt werden. Bei richtiger Vorbereitung muss das Gel in der Lage sein, die Ziellösungsarten, die sofort und quantitativ27in das Gel diffundieren, zu binden, was durch die analytspezifische Gelbindungskapazität bestimmt wird. Während die Überschreitung der Gelkapazität in nicht kontaminierten Böden weniger problematisch ist, sollte sie in metallverseuchten Böden und salineBodenumgebungen berücksichtigt werden. Die Sättigung der Gelbindungsphasen beeinträchtigt nicht nur die quantitative Gelöste Probenahme, sondern führt auch zu einer seitlichen Diffusion von Gelösten zwischen Bindungsphasen im Gel, was zu einer unbestimmten Lokalisierung von kleinräumigen Solute-Fluss-Features führt. Wenn also sehr hohe Mengen labiler Nährstoff-/Schadstoffarten in der Zielbodenumgebung zu erwarten sind, sollten Vortests durchgeführt werden. Zur Schätzung der erwarteten DGT-Belastungen können Die DGT-Kolbenproben mit anschließender Gelelution und nasschemische Analyseauf 15,49angewendet werden. Bei Bedarf können die DGT-Bereitstellungszeiten angepasst werden, um die Gelkontaktzeit zu reduzieren und so eine Gelsättigung über Kapazitätsschwellen zu vermeiden. Umgekehrt können Vortests auch hilfreich sein, um erforderliche Gelkontaktzeiten und/oder LA-ICP-MS-Empfindlichkeiten zu identifizieren, wenn sehr geringe gelöste Belastungen zu erwarten sind, was für die Kartierung von Spurenelementsolutes auf natürlichen Bodenhintergrundniveaus15wichtig sein kann. Außerdem sollte die korrekte Funktion des DGT-Gels vor seiner experimentellen Anwendung durch kontrolliertes Laden von Gelen bei der Herstellung von DGT LA-ICP-MS Kalibrierstandards überprüft werden. Der Gelstandard bietet eine Matrix-abgestimmte Referenzgel-Analytenbelastung, mit der beurteilt werden kann, ob die von LA-ICP-MS ermittelte Probengelbelastung innerhalb des erwarteten Bereichs liegt. Wenn es nicht möglich ist, ein Signal zu erhalten, das sich von dem Gas- und Methodenleerhintergrund unterscheidet, muss der Bediener sicherstellen, dass Laborverfahren für die Spurenelementanalyse implementiert und alle Protokollschritte korrekt ausgeführt wurden. Manchmal wird das DGT-Gel versehentlich nach einer gelösten Probenahme mit der bodenbelichteten, belasteten Seite zur Glasplatte und nicht zum Laserstrahl hin gekippt, was zu niedrigen Signalintensitäten und irrtümlich gekippten Features in den endgültigen gelösten Flussbildern führt.

Während der LA-ICP-MS-Analyse wird eine große Datenmenge generiert, die viel Zeit für die Auswertung in Anspruch nimmt. In unserem Labor verwenden wir interne Datenauswertungsskripts, die auf unser Zieldatenausgabeformat zugeschnitten sind, mit Standard-Tabellenkalkulationssoftware. Nach der halbautomatischen Sortierung und Kalibrierung wird das Bildzeichnen mit Open-Source-Open-Access-Bildanalyse-Tools (ImageJ, Fidschi50) durchgeführt. Dieser Ansatz ermöglicht die vollständige Kontrolle über die Datensortierung, -auswertung und -darstellung, was unerlässlich ist, da die gesammelten Daten rechteckigen und nicht quadratischen Pixeln entsprechen, die in den generierten gelösten Karten ordnungsgemäß angezeigt werden müssen. Darüber hinaus sollte bei der Datenverarbeitung jede Pixelinterpolation sorgfältig vermieden werden. Die Pixelinterpolation führt zu geglätteten Farbverläufen in den chemischen Bildern, was zu aufgeweichten, oft kreisförmigen Elementverteilungsmerkmalen führt und somit eine unerwünschte Änderung der ursprünglichen Daten darstellt. Die Pixelinterpolation ist eine Standardprozedur bei Neuskalierung und Neuformatierung von Vorgängen in vielen Bildverarbeitungssoftwareprodukten, kann aber in der Regel deaktiviert werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beschriebene Methode ein signifikanter Fortschritt für das Verständnis der Nährstoff- und Schadstoffdynamik in natürlichen Boden-Rhizosphären-Pflanzensystemen ist. Zusätzlich zu DGT-Anwendungen kann das Verfahren mit anderen, diffusionsbasierten bildgebenden Verfahren wie planaren Optoden3,33,42,43,48,51 und Zymographie20,21,22,23,24, kombiniert werden und kann weiterentwickelt werden, um zusätzliche Elemente und Bodenparameter einzubeziehen.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Studie wurde vom Wissenschaftsfonds (FWF): P30085-N28 (Thomas Prohaska) und dem Wissenschaftsfonds (FWF) und dem Land Niederösterreich kofinanziert: P27571-BBL (Jakob Santner).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(NH4)2S2O8 (ammonium persulfate; APS) VWR 21300.260 ≥98.0%, analytical reagent
2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich M8250-100G ≥99.5%
Acrylamide solution Sigma-Aldrich A4058-100ML 40%, for electrophoresis
Analyte salts n/a n/a Use water soluble analyte salts of analytical grade or higher
Buechner funnel VWR 511-0065 13 cm plate diameter
Chemical equilibrium modelling software KTH Sweden n/a Visual MINTEQ
Clamp Local warehouse n/a
Desktop publishing software Adobe Inc. n/a InDesign CS6
DGT cross-linker DGT Research Ltd n/a 2%, agarose derivative
DGT piston sampler DGT Research Ltd n/a 2 cm diameter exposure window
Digital single-lens reflex (DSLR) camera Canon Inc. n/a Canon EOS 1000D
Dispersion device IKA 3737000 Ultra-Turrax T10 Basic
Double-sided adhesive tape Tesa 56171
Ethanol Sigma-Aldrich 34923 Puriss. p.a., absolute, ≥99.8%
Gel blotting paper Whatman 10426981 Blotting Papers, Grade GB005, 20 × 20 cm, 1.5 mm thickness
Gel drier UniEquip n/a UNIGELDRYER 3545
High-pressure microwave system Anton Paar n/a Multiwave 3000
HNO3 VWR 1.00456.2500P 65%, ISO for analysis
Horizontal shaker GFL 305
HydroMed D4 AdvanSource Biomaterials Corp. n/a Ether-based hydrophilic urethane
ICP-MS software Perkin Elmer n/a Syngistix
Image analysis software National Institutes of Health (NIH) n/a ImageJ Fiji, freely available at https://fiji.sc/
Knife-coating device BYK 5561 Single Bar 6″, 0.5 mils
LA software Elemental Scientific Lasers n/a ActiveView
LA system Elemental Scientific Lasers n/a NWR193
Laminar flow bench Telstar Laboratory Equipment B.V. n/a Class II biological safety cabinet
Magnetic stirrer IKA 0003582400 C-MAG MS 7
Moisture-retaining film Bemis Company, Inc. PM999 Parafilm M, 4" x 250'
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281-50ML BioReagent, suitable for electrophoresis, ~99%
NaNO3 Sigma-Aldrich 229938-10G 99.995% trace metals basis
NaOH Sigma-Aldrich 1064980500 Pellets for analysis
Overhead shaker GFL 3040
Perfluoroalkoxy alkane (PFA) vials Savillex 200-015-20 15 mL Standard Vial, Rounded Interior
pH meter Thermo Scientific 13-644-928 Orion 3-Star Benchtop pH Meter
pH probe Thermo Scientific 8157BNUMD Orion ROSS Ultra pH/ATC Triode
Plastic cutter DGT Research Ltd n/a Use empty cross-linker vials from DGT research Ltd
Plastic tweezers Semadeni 602
Plasticine Local stationary shop n/a non-drying plastic modelling mass based on paraffin wax and bulking agents
Polycarbonate membrane discs Whatman 110606 Nuclepore Hydrophilic Membrane, 25 mm diameter, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness
Polycarbonate membrane sheet Whatman 113506 Nuclepore Hydrophilic Membrane, 8 × 10 in, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness
Polyethersulfone membrane discs Pall Corporation 60172 Supor 450 Membrane Disc Filters, 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness
Polyethersulfone membrane sheet Pall Corporation 60179 Supor 450 Membrane Disc Filters, 293 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness
PTFE foil Haberkorn n/a 50 µm thickness
PTFE spacer Haberkorn n/a Variable thicknesses available
PTFE-coated razor blades Personna GEM 62-0178 Stainless steel single edge blades (coated)
PTFE-coated Tygon tubing S-prep GmbH SP8180 0.32 cm inner diameter
Quadrupole ICP-MS Perkin Elmer N8150044 NexION 2000B
Quantitative filter paper, 454 VWR 516-0854 Particle retention 12-15 µm
Spreadsheet software Microsoft Corporation n/a Microsoft Excel 2016 (v16.0)
Stainless-steel cutter Local locksmithery n/a 2.5 cm diameter
Suspended particulate reagent-iminodiacetate (SPR-IDA) Teledyne CETAC Technologies n/a 10 µm diameter polystyrene beads, 10 % (w/v) bead suspension
Transistor-transistor logic (TTL) cable n/a n/a Consult ICP-MS technician to identify a suitable TTL cable for a specific instrument
Two-volume cell Elemental Scientific Lasers n/a Two-volume cell 1
Vinyl electrical tape 3M n/a Scotch Super 33+
Water purification system Termo Electron LED GmbH n/a TKA-GenPure
ZrOCl2 × 8H2O Alfa Aesar 86108.30 99.9 %, metals basis

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References

  1. Hinsinger, P., Gobran, G. R., Gregory, P. J., Wenzel, W. W. Rhizosphere geometry and heterogeneity arising from root-mediated physical and chemical processes. New Phytologist. 168 (2), 293-303 (2005).
  2. Jungk, A. Plant Roots: The Hidden Half. , Marcel Dekker. New York. ch35 587-616 (2002).
  3. Hoefer, C., Santner, J., Puschenreiter, M., Wenzel, W. W. Localized metal solubilization in the rhizosphere of Salix smithiana upon sulfur application. Environmental Science & Technology. 49 (7), 4522-4529 (2015).
  4. Luster, J., Göttlein, A., Nowack, B., Sarret, G. Sampling, defining, characterising and modeling the rhizosphere-the soil science tool box. Plant and Soil. 321 (1), 457-482 (2009).
  5. Oburger, E., Schmidt, H. New Methods To Unravel Rhizosphere Processes. Trends in Plant Science. 21 (3), 243-255 (2016).
  6. Göttlein, A., Hell, U., Blasek, R. A system for microscale tensiometry and lysimetry. Geoderma. 69 (1), 147-156 (1996).
  7. Göttlein, A., Heim, A., Matzner, E. Mobilization of aluminium in the rhizosphere soil solution of growing tree roots in an acidic soil. Plant and Soil. 211 (1), 41-49 (1999).
  8. Hinsinger, P., Gilkes, R. J. Dissolution of phosphate rock in the rhizosphere of five plant species grown in an acid, P-fixing mineral substrate. Geoderma. 75 (3), 231-249 (1997).
  9. Wenzel, W. W., Wieshammer, G., Fitz, W. J., Puschenreiter, M. Novel rhizobox design to assess rhizosphere characteristics at high spatial resolution. Plant and Soil. 237 (1), 37-45 (2001).
  10. Degryse, F., Smolders, E., Zhang, H., Davison, W. Predicting availability of mineral elements to plants with the DGT technique: a review of experimental data and interpretation by modelling. Environmental Chemistry. 6 (3), 198-218 (2009).
  11. Mason, S., McNeill, A., McLaughlin, M. J., Zhang, H. Prediction of wheat response to an application of phosphorus under field conditions using diffusive gradients in thin-films (DGT) and extraction methods. Plant and Soil. 337 (1), 243-258 (2010).
  12. Six, L., Smolders, E., Merckx, R. The performance of DGT versus conventional soil phosphorus tests in tropical soils-maize and rice responses to P application. Plant and Soil. 366 (1), 49-66 (2013).
  13. Mason, S. D., McLaughlin, M. J., Johnston, C., McNeill, A. Soil test measures of available P (Colwell, resin and DGT) compared with plant P uptake using isotope dilution. Plant and Soil. 373 (1), 711-722 (2013).
  14. Freese, D., Lookman, R., Merckx, R., van Riemsdijk, W. H. New Method for Assessment of Long-Term Phosphate Desorption from Soils. Soil Science Society of America Journal. 59 (5), 1295-1300 (1995).
  15. Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of The Total Environment. , 738 (2020).
  16. Bhat, K. K. S., Nye, P. H. Diffusion of phosphate to plant roots in soil. Plant and Soil. 38 (1), 161-175 (1973).
  17. Glud, R. N., Ramsing, N. B., Gundersen, J. K., Klimant, I. Planar optrodes: a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).
  18. Blossfeld, S., Gansert, D. A novel non-invasive optical method for quantitative visualization of pH dynamics in the rhizosphere of plants. Plant, Cell & Environment. 30 (2), 176-186 (2007).
  19. Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
  20. Spohn, M., Carminati, A., Kuzyakov, Y. Soil zymography - A novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 58, 275-280 (2013).
  21. Spohn, M., Kuzyakov, Y. Spatial and temporal dynamics of hotspots of enzyme activity in soil as affected by living and dead roots-a soil zymography analysis. Plant and Soil. 379 (1), 67-77 (2014).
  22. Heitkötter, J., Marschner, B. Soil zymography as a powerful tool for exploring hotspots and substrate limitation in undisturbed subsoil. Soil Biology and Biochemistry. 124, 210-217 (2018).
  23. Guber, A. K., Kravchenko, A. N., Razavi, B. S., Blagodatskaya, E., Kuzyakov, Y. Calibration of 2-D soil zymography for correct analysis of enzyme distribution. European Journal of Soil Science. 70 (4), 715-726 (2019).
  24. Lin, V. S., et al. Non-destructive spatial analysis of phosphatase activity and total protein distribution in the rhizosphere using a root blotting method. Soil Biology and Biochemistry. 146, 107820 (2020).
  25. Ilhardt, P. D., et al. High-resolution elemental mapping of the root-rhizosphere-soil continuum using laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS). Soil Biology and Biochemistry. 131, 119-132 (2019).
  26. Davison, W., Zhang, H. In situ speciation measurements of trace components in natural waters using thin-film gels. Nature. 367 (6463), 546-548 (1994).
  27. Davison, W. Diffusive Gradients in Thin-Films for Environmental Measurements. , Cambridge University Press. (2016).
  28. Zhang, H., Davison, W., Knight, B., McGrath, S. In Situ Measurements of Solution Concentrations and Fluxes of Trace Metals in Soils Using DGT. Environmental Science & Technology. 32 (5), 704-710 (1998).
  29. Davison, W., Fones, G. R., Grime, G. W. Dissolved metals in surface sediment and a microbial mat at 100-μm resolution. Nature. 387 (6636), 885-888 (1997).
  30. Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
  31. Kreuzeder, A., Santner, J., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Gel for simultaneous chemical imaging of anionic and cationic solutes using diffusive gradients in thin films. Analytical Chemistry. 85 (24), 12028-12036 (2013).
  32. Kreuzeder, A., Santner, J., Zhang, H., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Uncertainty evaluation of the diffusive gradients in thin films technique. Environmental Science and Technology. 49 (3), 1594-1602 (2015).
  33. Hoefer, C., Santner, J., Borisov, S. M., Wenzel, W. W., Puschenreiter, M. Integrating chemical imaging of cationic trace metal solutes and pH into a single hydrogel layer. Analytica Chimica Acta. 950, 88-97 (2017).
  34. Santner, J., Larsen, M., Kreuzeder, A., Glud, R. N. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils--a review. Analytica Chimica Acta. 878, 9-42 (2015).
  35. Santner, J., Williams, P. N. Diffusive Gradients In Thin-Films For Environmental Measurements. Davison, W. , Cambridge University Press. Ch. 8 174-215 (2016).
  36. Guan, D. X., et al. Novel Precipitated Zirconia-Based DGT Technique for High-Resolution Imaging of Oxyanions in Waters and Sediments. Environmental Science & Technology. 49 (6), 3653-3661 (2015).
  37. Zhang, H., Davison, W. Performance Characteristics of Diffusion Gradients in Thin Films for the in Situ Measurement of Trace Metals in Aqueous Solution. Analytical Chemistry. 67 (19), 3391-3400 (1995).
  38. Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Performance characteristics of suspended particulate reagent-iminodiacetate as a binding agent for diffusive gradients in thin films. Analytica Chimica Acta. 508 (1), 41-51 (2004).
  39. Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Analysis of Polyacrylamide Gels for Trace Metals Using Diffusive Gradients in Thin Films and Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 76 (20), 6077-6084 (2004).
  40. Gao, Y., Lehto, N. A simple laser ablation ICPMS method for the determination of trace metals in a resin gel. Talanta. 92, Supplement C 78-83 (2012).
  41. Lehto, N. J., Davison, W., Zhang, H. The use of ultra-thin diffusive gradients in thin-films (DGT) devices for the analysis of trace metal dynamics in soils and sediments: a measurement and modelling approach. Environmental Chemistry. 9 (4), 415-423 (2012).
  42. Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science & Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
  43. Lehto, N. J., Larsen, M., Zhang, H., Glud, R. N., Davison, W. A mesocosm study of oxygen and trace metal dynamics in sediment microniches of reactive organic material. Scientific Reports. 7 (1), 11369 (2017).
  44. Zitek, A., Aléon, J., Prohaska, T. Sector Field Mass Spectrometry for Elemental and Isotopic Analysis. , The Royal Society of Chemistry. 152-182 (2015).
  45. Lear, J., Hare, D., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27 (1), 159-164 (2012).
  46. May, T. W., Wiedmeyer, R. H. A table of polyatomic interferences in ICP-MS. Atomic Spectroscopy. 19 (5), 150-155 (1998).
  47. Raposo, F. Evaluation of analytical calibration based on least-squares linear regression for instrumental techniques: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 77, 167-185 (2016).
  48. Kreuzeder, A., et al. In situ observation of localized, sub-mm scale changes of phosphorus biogeochemistry in the rhizosphere. Plant and Soil. 424 (1), 573-589 (2018).
  49. Hooda, P. S., Zhang, H., Davison, W., Edwards, A. C. Measuring bioavailable trace metals by diffusive gradients in thin films (DGT): soil moisture effects on its performance in soils. European Journal of Soil Science. 50 (2), 285-294 (1999).
  50. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  51. Wagner, S., et al. Arsenic redox transformations and cycling in the rhizosphere of Pteris vittata and Pteris quadriaurita. Environmental and Experimental Botany. 177, 104122 (2020).

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Umweltwissenschaften Ausgabe 163 chemische Bildgebung Rhizosphäre diffusive Gradienten in Dünnschichten Laserablation induktiv gekoppelte Plasmamassenspektrometrie Spurenelement Pflanzenernährung
Zweidimensionale Visualisierung und Quantifizierung von labilen, anorganischen Pflanzennährstoffen und Verunreinigungen im Boden
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Wagner, S., Hoefer, C., Prohaska, T., Santner, J. Two-Dimensional Visualization and Quantification of Labile, Inorganic Plant Nutrients and Contaminants in Soil. J. Vis. Exp. (163), e61661, doi:10.3791/61661 (2020).

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