使用分裂荧光素酶互补测定法展示高尔基体驻留III型膜蛋白形成的异源复合物

Summary

这里提出的方案旨在使用分裂荧光素酶互补测定的最新变体，证明高尔基体驻留的III型膜蛋白与活哺乳动物细胞中细胞质暴露的N-和/或C-末端之间异源相互作用的发生。

Abstract

该协议的目标是探索分裂荧光素酶互补的最新变体的适用性，以证明由核苷酸糖转运蛋白（NST）形成的异源复合物。这些ER和高尔基体驻留的多跨膜蛋白携带细胞质合成的核苷酸糖穿过细胞器膜，以提供介导糖基化及其底物的酶。NST以二聚体和/或更高的低聚物形式存在。不同 NST 之间的异源相互作用也有报道。为了验证该技术是否适合研究NST异色化现象，我们针对两种高尔基体驻留的NSTs的组合对其进行了测试，这两种NSTs先前已被证明可以通过其他几种方式关联。荧光素酶补体测定似乎特别适合研究高尔基体驻留膜蛋白之间的相互作用，因为它不需要高表达水平，这通常会引发蛋白质错位并增加假阳性的风险。

Introduction

本手稿描述了一种分步方案，以使用分裂荧光素酶互补测定的最新变体检查瞬时转染的人细胞中高尔基体驻留的III型膜蛋白之间是否存在异源相互作用。该程序已经针对核苷酸糖转运蛋白（NST）进行了最广泛的测试，但我们也能够获得其他高尔基体驻留的III型膜蛋白的阳性结果，其N和/或C-末端面向细胞质。

我们的研究小组探索了NST在大分子糖基化中的作用。NST是高尔基体和/或ER驻留的III型膜蛋白，其N端和C端朝向器官膜的细胞质侧¹。NST被认为携带核苷酸激活的糖穿过细胞器膜，为其底物提供糖基转移酶。NST形成二聚体和/或更高的低聚物^{2，3，4，5，6，7，8，9，10}。此外，还报道了不同NST之间的异源相互作用

Protocol

1. 表达质粒的产生

1. 使用拓扑预测工具检查目标蛋白质的膜拓扑结构。
2. 设计克隆策略，以便一旦融合蛋白插入高尔基体膜，较大和较小的片段将面对细胞质。如果，如这里所呈现的情况，目标蛋白质的N-和C-末端都是细胞质定向的，则以八种可能的方式标记蛋白质（见 图1B）。如果一种或两种感兴趣蛋白质的N-或C-末端是发光定向的，则将其从标记中排除。
3. 通过遵循标准克隆方案将感兴趣的基因亚克隆到适当的表达载体中（见 材料表）。
   注意:建议测试所有可能的方向，因为某些标记选项可能由于距离不足、方向欠佳或空间限制而不起作用。

2. 将表达质粒瞬时转染到细胞中

1. 通过胰蛋白酶消化收获贴壁HEK293T细胞培养物，并将细胞重悬于专用的完整生长培养基中。将细胞（2 x ¹⁰⁴ / 100μL /孔）接种到透明底部，白色侧96孔板上。调整孔的总数，以适应所有测试的组合和对照，包括重复。
   注意:尝试仅使用板的内部60孔，以尽量减少热偏移并避免过夜蒸发。强烈建议使用聚-D-赖氨酸包被的板，例如 材料表中指示的板，否则细胞可能会在随后的洗涤步骤中分离。
2. 在标准条件（37°C，5%CO ₂）下培养细胞过夜。

Results

为了在这种方法中获得最可靠的数据，应测试所有可能的组合（参见 图1）。同时，应包括阳性和阴性对照。阳性对照应由已知相互作用的两种蛋白质组成，其中一种与较大的片段融合，另一种与较小的片段融合。理想情况下，阴性对照应由同样标记的两种非相互作用的III型膜蛋白组成。然而，建立这种对照可能具有挑战性，因为应使用几种替代方法彻底确认两种对照蛋白缺乏相互作用。因此，如果蛋白质的N-和/或C-末端（其相互作用有待确定）像这里介绍的情况一样细胞质暴露，则可以使用预计不会与任何人类蛋白质（例如HaloTag）相互作用的非人源胞质蛋白作为阴性对照。我们强烈建议通过共表达任何一种目标蛋白质的未标记变体并结合相应质粒的滴定，对使用这种类型的对照获得的结果进行额外的验证。如果两种蛋白质特异性相互作用，则其中任何一种缺乏荧光素酶片段的额外拷贝应导致发光的特定降低。

相对发光单元（RLU）值通常为正负组合，如表1所示。两种NST，SLC35A2和SLC35A3的结果被证明通过共免疫沉淀和FLIM-FRET6以及原位接近.......

Discussion

在这里，我们提供了一个详细的方案，能够使用分裂荧光素酶互补测定法演示高尔基体驻留的III型膜蛋白（如NSTs）之间形成的异源复合物。所提出的数据分析和解释方法涉及将感兴趣的蛋白质组合获得的发光与为相应对照组合获得的发光相关联，其由与较大片段融合的目标蛋白质之一和与较小片段融合的细菌来源的控制蛋白组成。后者在哺乳动物细胞的细胞质中表达;因此，将其用作参考需要分析其相互作用的蛋白质的N和/或C末端位于高尔基体膜的细胞质侧。

该方案的关键步骤是质粒设计，接种要转染的细胞，转染本身，培养基交换，制备呋马嗪工作溶液并将其添加到细胞中。质粒设计应使两个荧光素酶片段都面向细胞质，否则对照组合将不起作用，并且将缺少参考RLU值。要转染的细胞应按照方案中的规定进行接种，否则转染效率可能次优。我们建议使用具有聚-L-赖氨酸涂层表面的多孔板，以便在交换培养基时支持细胞附着。最后，应新鲜制备呋喃嗪工作溶液并立即加入细胞中。添加后，应尽快执行读出。

为避免无结果，应始终包括阳性和阴性对照。应始终采用阳性对照，以便监测转染效率。生成和组合所有可能的融合蛋.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液
贴壁哺乳动物细胞系
BioCoat Poly-D-赖氨酸 96 孔白色/透明平底 TC 处理的微孔板，带盖	康宁	356651
细胞培养离心机
细胞培养补充剂（热灭活胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素）
CO2 培养箱
编码目标蛋白的表达质粒，未用 NanoBiT 片段
FuGENE HD 转染试剂	Promega	E2311
GloMax Discover 微孔板读板机（或其他发光微孔板读板机）	Promega	GM3000
			细胞系的生长培养基
用于标准分子克隆的材料和试剂（细菌、热稳定聚合酶、限制性内切酶、DNA 连接酶、核酸纯化材料和试剂）
NanoBiT MCS Starter System	Promega	N2014	该试剂盒包含能够用不同方向的 NanoBiT 片段标记目标蛋白质的载体，以及编码与 SmBiT 融合的 HaloTag 蛋白的对照质粒和阳性对照质粒对。
Nano-Glo 活细胞检测系统	Promega	N2011	该试剂盒包含呋喃嗪（一种能够检测活细胞中 NanoLuc 活性的底物）和专用稀释缓冲液。
Opti-MEM I 减量血清培养基，无酚红	Gibco	11058021
Oribital 摇床
用于数据分析的软件（例如 GraphPad Prism）
热循环仪