Summary
여기에 제시된 프로토콜은 분할 루시퍼라제 보체 분석의 가장 최근의 변이체를 사용하여 살아있는 포유동물 세포에서 세포질적으로 노출된 N- 및/또는 C-테르미니와 골지-상주 III형 막 단백질 사이의 이종 상호작용의 발생을 입증하기 위한 것이다.
Abstract
이 프로토콜의 목표는 뉴클레오티드 당 수송체 (NSTs)에 의해 형성된 이종 복합체를 입증하기 위한 분할 루시퍼라제 상보의 가장 최근의 변이체의 적용 가능성을 탐구하는 것이다. 이러한 ER- 및 골지-상주 다막횡단 단백질은 세포질적으로 합성된 뉴클레오티드 당을 소기관막을 가로질러 운반하여 그들의 기질과 함께 글리코실화를 매개하는 효소를 공급한다. NST는 이량체 및/또는 그 이상의 올리고머로서 존재한다. 서로 다른 NST 간의 이종 상호 작용도보고되었습니다. 이 기술이 NST 이량체화 현상을 연구하는 데 적합한지 여부를 확인하기 위해, 우리는 이전에 여러 가지 다른 방법으로 연관되는 것으로 밝혀진 두 골지 거주 NST의 조합에 대해 테스트했습니다. 루시퍼라아제 보체 분석은 높은 발현 수준을 요구하지 않기 때문에 골지-상주막 단백질 간의 상호작용을 연구하는 데 특히 적합한 것으로 보이며, 이는 종종 단백질 오국소화를 유발하고 위양성의 위험을 증가시킨다.
Introduction
이 원고는 분할 루시퍼라제 보체 분석의 가장 최근의 변이체를 사용하여 일시적으로 형질감염된 인간 세포에서 골지-레지던트 타입 III 막 단백질 사이의 이종 상호작용의 존재를 확인하기 위한 단계별 프로토콜을 기술한다. 이 절차는 뉴클레오티드 당 수송체 (NSTs)에 대해 가장 광범위하게 테스트되었지만 N- 및 / 또는 C- 테르미니가 세포질에 직면하고있는 다른 골지 상주 유형 III 막 단백질에 대해서도 긍정적 인 결과를 얻을 수있었습니다.
우리의 연구 그룹은 거대 분자의 글리코실화에서 NST의 역할을 탐구합니다. NSTs는 골지- 및/또는 ER-상주형 III 막 단백질이며, N- 및 C-테르미니는 오르가넬라 막의 세포질 측에 직면한다1. NST는 뉴클레오티드 활성화 당을 소기관막을 가로질러 운반하여 글리코실트랜스퍼라제를 기질과 함께 공급하는 것으로 생각된다. NST는 이량체 및/또는 그 이상의 올리고머2,3,4,5,6,7,8,9,10을 형성한다. 더욱이, 상이한 NST들 사이의 이종성 상호작용도 또한 보고되었다6,11. NSTs는 또한 기능적으로 관련된 글리코실화 효소12,13,14와 복합체를 형성하는 것으로 입증되었다. 우리는 NST와 기능적으로 관련된 골지 상주 단백질의 상호 작용을 연구하기 위해 현재 사용되는 기술인 형광 수명 이미징 (FLIM) 기반 FRET 접근법에 대한 대안을 모색하여 분할 루시퍼라제 보완 분석을 테스트하기로 결정했습니다. 이를 통해 NST와 기능적으로 관련된 글리코실화 효소9 사이의 새로운 상호작용을 확인할 수 있었습니다.
분할 루시퍼라제 보체 분석의 가장 최근의 변형, NanoBiT가 여기에 제시된 프로토콜15에 사용된다. 그것은 두 단편으로부터 루시퍼라제 효소 (예를 들어, NanoLuc)의 재구성에 의존합니다 - 큰 BiT 또는 LgBiT로 불리는 큰 단백질, 17.6 kDa 단백질, 그리고 작은 BiT 또는 SmBiT로 불리는 11 개의 아미노산으로 구성된 작은 단백질. 관심있는 두 단백질은 상보적 단편과 융합되고 인간 세포주에서 일시적으로 발현된다. 두 융합 단백질이 상호작용하는 경우, 세포 투과성 기질의 첨가시 계내에서 발광이 생성된다. 이 두 단편은 그들이 융합된 관심있는 단백질 사이의 상호작용에 의해 함께 모이지 않는 한 최소 친화력과 연관되도록 최적화되었다.
일반적으로, 생체발광-기반 방법은 형광에 기초한 것들보다 몇 가지 장점이 있다. 생체 발광 신호는 루시페라아제 유래 신호16에 비해 배경 발광이 무시할 수 있기 때문에 더 높은 신호 대 잡음비를 갖는다. 대조적으로, 형광-기반 접근법은 일반적으로 자가형광의 현상에 의해 야기되는 비교적 높은 배경으로부터 고통받는다. 게다가, 생체 발광은 형광보다 분석 된 세포에 덜 해롭고, 전자의 경우와 마찬가지로 샘플을 여기시킬 필요가 없습니다. 이러한 이유로 생체 내에서 PPI를 연구하는 생체 발광 접근법은 Förster 공명 에너지 전달 (FRET) 또는 Bi분자 형광 보체 (BiFC)와 같이 일반적으로 사용되는 형광 방법보다 우수합니다.
우리의 프로토콜은 관심있는 단백질 조합에 대해 얻어진 발광을 대조군 조합에 대해 수득된 발광에 대해 언급하는 것에 의존한다. 후자는 더 큰 단편 및 대조군 단백질 (예를 들어, HaloTag)과 융합되고, 더 작은 단편과 융합되는 시험된 단백질 중 하나를 포함한다. 후자는 포유류 단백질과 상호 작용할 것으로 기대되지 않는 박테리아 기원의 단백질입니다. 이 단백질을 대조군으로 사용하는 것은 분석하고자 하는 단백질의 골지-상주 쌍의 토폴로지에 한계를 제기한다. 포유동물 세포에서 이 단백질은 세포질에서 합성되기 때문에, 관심있는 두 단백질 모두 적어도 하나의 세포질 꼬리를 가져야 한다.
이러한 접근법은 PPI의 초기 스크리닝에 특히 유용할 수 있다. 관심있는 융합 단백질이 단순히 다른 접근법이 적용되기에 불충분 한 수준으로 발현 될 때 선택되는 방법이 될 수 있습니다. 유사하게, 분할 루시퍼라제 보체 분석은 관심있는 단백질이 높은 수준으로 발현되는 경우에 최선의 선택이 될 수 있지만, 이것은 그들의 아세포 국소화에 악영향을 미치거나 비특이적 상호작용을 강제하는 것으로 알려져 있다. 더 작은 단편은 단지 11개의 아미노산만을 갖기 때문에, 분할 루시퍼라제 상보화 분석은 더 큰 태그를 사용할 때 적용될 수 있는 것은 불가능하다. 마지막으로, 여기에 제시된 경우와 같이 다른 기술을 사용하여 획득한 데이터를 추가로 확인하기 위해 사용될 수 있다.
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Protocol
1. 발현 플라스미드의 생성
- 토폴로지 예측 도구를 사용하여 관심 있는 단백질의 막 토폴로지를 검사합니다.
- 융합 단백질이 골지 막에 삽입되면 더 크고 작은 단편이 세포질에 직면하도록 복제 전략을 설계하십시오. 여기에 제시된 경우와 같이, 관심있는 단백질의 N- 및 C-테르미니가 모두 세포질 지향적이라면, 여덟 가지 가능한 방법으로 단백질을 태그한다( 도 1B 참조). 관심있는 하나 또는 두 단백질 모두의 N- 또는 C 말단이 발광 지향적 인 경우, 태깅에서 제외하십시오.
- 관심있는 유전자를 표준 클로닝 프로토콜에 따라 적절한 발현 벡터 내로 서브클로닝한다 ( 물질의 표 참조).
참고: 일부 태그 지정 옵션은 불충분한 근접성, 차선의 방향 또는 공간 제약으로 인해 작동하지 않을 수 있으므로 가능한 모든 방향을 테스트하는 것이 좋습니다.
2. 발현 플라스미드를 세포내로의 일시적 형질감염
- 트립신화에 의해 부착성 HEK293T 세포 배양물을 수확하고, 세포를 전용 완전 성장 배지에 재현탁시킨다. 세포(2 x 104/100 μL/웰)를 투명한 바닥, 흰색 측면 96웰 플레이트에 플레이트에 플레이트합니다. 반복실험을 포함하여 테스트된 모든 조합 및 컨트롤을 수용할 수 있도록 웰의 총 수를 조정합니다.
참고: 열적 이동을 최소화하고 하룻밤 사이에 증발을 피하기 위해 플레이트의 내부 60개 웰만 사용하십시오. 폴리-D-라이신 코팅 플레이트를 사용하는 것은 물질 표에 표시된 것과 같이 매우 권장되며, 그렇지 않으면 후속 세척 단계 동안 세포가 분리될 수 있습니다. - 세포를 표준 조건(37°C, 5% CO2)에서 밤새 배양한다.
- 다음날 세포를 점 1.1에서 수득된 발현 플라스미드의 원하는 조합물로 형질감염시킨다.
- 발현 플라스미드를 무혈청 배지 ( 표 참조)에서 각 구축물에 대해 6.25 ng/μL로 희석한다.
- 지질계 형질감염 시약을 적절한 지질-DNA 비율로 첨가하고, 제조자의 지시에 따라 인큐베이션한다.
- 8 μL의 지질:DNA 혼합물을 지정된 웰에 첨가한다. 부드러운 회전으로 접시의 내용물을 혼합하십시오. 이것은 50 ng/well에서 두 발현 작제물의 형질감염을 초래한다.
- 세포를 표준 조건(37°C, 5% CO2)에서 20-24시간 동안 배양하였다.
참고: 세포를 더 오랜 시간 동안 배양하면 더 높은 수준의 융합 단백질 발현이 발생할 수 있으며, 이는 단편 간의 비특이적 연관성을 촉진시킬 수 있다.
3. 중간 교환
- 다음날, 컨디셔닝 배지를 각 웰에 무혈청 배지 100 μL로 교체한다. 배지 교환 시 세포가 분리되지 않았는지 확인하십시오.
참고 :이 단계는 furimazine 작업 용액을 첨가하기 전에 2-3 시간 전에 수행해야합니다. 혈청 철수는 furimazine의 자기 발광으로 인한 배경을 최소화합니다.
4. 후리마진 작업액의 제조
- 측정 직전에 1 부피의 furimazine을 19 부피의 희석 완충액 (20 배 희석)과 혼합하십시오.
참고: 준비될 furimazine 작업 용액의 총 부피는 분석될 개별 웰의 수에 따라 달라집니다(furimazine 작업 용액은 1:5 비율로 세포 배양 배지에 첨가되므로, 이전에 100 μL의 무혈청 배지로 채워진 각 웰에 25 μL의 furimazine 작업 용액을 첨가해야 함). - furimazine 작업 용액을 지정된 웰 (25 μL / 웰)에 추가하십시오. 플레이트를 손으로 또는 오비탈 셰이커를 사용하여 부드럽게 혼합한다(예를 들어, 300-500 rpm에서 15초).
5. 발광 측정
- 플레이트를 발광 마이크로플레이트 판독기에 삽입합니다.
- 37°C에서 수행되어야 하는 실험을 위해 플레이트를 지시된 온도에서 10-15분 동안 평형화시킨다.
- 분석할 웰을 선택합니다.
- 통합 시간이 0.3초인 발광을 읽습니다. 필요한 경우 최대 2시간 동안 발광을 계속 모니터링합니다.
6. 데이터 분석
- 모든 테스트 및 제어 조합에 대한 평균값과 표준 편차를 계산합니다.
- 여러 비교를 통해 단방향 ANOVA를 사용하여 데이터를 분석합니다.
- 관심 조합에 대해 얻어진 평균 발광을 상응하는 음성 대조군에 대해 얻어진 평균 발광으로 나눔으로써 폴드 변화 값을 계산한다. 결과를 평가합니다.
참고: 여기에 제안된 데이터 분석에 대한 접근 방식은 테스트된 조합에 대해 얻어진 발광이 해당 제어 조합에 대해 얻어진 발광보다 통계적으로 유의하게 높고, 동시에 이들 두 값의 비율이 10을 초과하는 경우 상호작용이 주장될 수 있다고 가정한다.
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Representative Results
이 방법에서 가장 신뢰할 수 있는 데이터를 얻으려면 가능한 모든 조합을 테스트해야 합니다( 그림 1 참조). 동시에 양성 및 음성 대조군이 포함되어야합니다. 양성 대조군은 상호 작용하는 것으로 알려진 두 개의 단백질로 구성되어야하며, 그 중 하나는 더 큰 단편과 융합되고 다른 하나는 더 작은 단편과 융합됩니다. 이상적으로 음성 대조군은 유사하게 태그된 두 개의 상호작용하지 않는 유형 III 막 단백질로 구성되어야 한다. 그러나, 이러한 조절을 확립하는 것은 어려울 수 있는데, 이는 두 대조군 단백질의 상호작용의 결여가 몇 가지 대안적인 접근법을 사용하여 철저하게 확인되어야 하기 때문이다. 따라서, 임의의 인간 단백질(예를 들어, HaloTag)과 상호작용할 것으로 예상되지 않는 비인간 기원의 세포질 단백질을 음성 대조군으로 사용할 수 있는데, 만약 상호작용이 결정될 단백질의 N- 및/또는 C-테르미니가 여기에 제시된 경우와 같이 세포질적으로 노출된다면. 우리는 상응하는 플라스미드의 적정과 결합된 관심있는 단백질 중 어느 하나의 태그되지 않은 변이체의 공동 발현에 의해 이러한 유형의 조절을 사용하여 수득된 결과의 추가적인 검증을 매우 권장한다. 두 단백질이 특이적으로 상호 작용하는 경우, 루시퍼라제 단편이 결여된 이들 중 하나의 추가 카피는 발광의 특정 감소를 초래한다.
양극 및 음성 조합의 전형적인 상대 발광 단위(RLU) 값이 표 1에 열거되어 있다. 결과는 두 개의 NSTs, SLC35A2 및 SLC35A3에 대해 수득되었고, 이는 공동-면역침전 및 FLIM-FRET6 뿐만 아니라 계내 근접 라이게이션 분석11에 의해 연관되는 것으로 나타났다. SLC35A2 및 SLC35A3 둘 다 골지-상주 유형 III 막 단백질이며 N- 및 C-테르미니는 세포질에 직면한다(도 1A). 따라서, 여덟 가지 가능한 태깅 옵션이 있으며, 생성된 융합 단백질은 여덟 가지 가능한 방법으로 함께 설정될 수 있다(도 1B). 모든 시험된 조합 및 대조군 조합에 대응하는 평균 RLU 값이 도 2A에 도시되어 있다. 양성 대조군도 포함된다. 상호작용을 나타내는 것으로 간주되는 선택된 결과에 대한 초기 요건은 관심 조합에 대해 수득된 RLU 값이 상응하는 조합 조합에 대해 수득된 RLU 값보다 통계적으로 유의하게 높다는 것이다. 도 2A에서는 세 가지 이러한 조합이 보인다(LgBiT-SLC35A2 + SLC35A3-SmBiT, SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 및 SLC35A2-SmBiT+LgBiT-SLC35A3). 결과 분석의 다음 단계는 해당 RLU 값을 각 컨트롤에 대해 획득된 RLU 값으로 나눔으로써 관심 조합에 대한 비율 값을 얻는 것을 포함한다. 이러한 분석의 결과를 도 2B에 나타내었다. 제조업체의 제안에 따르면 10과 1000 사이의 비율은 특정 상호 작용을 매우 나타냅니다. 이러한 기준(SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 및 SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3)을 충족하고 SLC35A2와 SLC35A3이 상호 작용한다는 아이디어를 지원하는 두 가지 조합이 있습니다. 그러나 다른 여섯 가지 조합이 부정적이라는 사실은 각각의 융합 단백질 사이에 전혀 상호 작용이 없다는 것을 의미하지는 않지만 오히려 태깅 전략이 이러한 경우에 최적이 아니라는 것을 암시합니다. 이 예제에서는 가능한 모든 조합을 테스트하는 것이 얼마나 중요한지 보여줍니다.
도 2에 제시된 데이터는 HA 태깅된 SLC35A2 또는 SLC35A3과 가장 높은 상대적 발광, 즉 SLC35A2-LgBiT+SmBiT-SLC35A3의 조합과의 동시 발현에 의해 추가로 확인되었다. HA-태깅된 NST 변이체를 코딩하는 플라스미드의 다양한 양을 공동-형질감염에 사용하였다. 이로 인해 RLU 값의 통계적으로 유의한 용량 의존적 감소가 발생했습니다(그림 3). HA 태깅된 NST 변이체의 동시 동시 발현에 의한 SLC35A2-LgBiT 및 SmBiT-SLC35A3 사이의 상호작용의 특이적 및 용량 의존적 파괴는 표 2에 제시되어 있다.
여기에 제시된 방법과 관련된 가장 일반적인 문제는 형질감염의 효율성이 떨어진다는 것입니다. 이것이 차선책의 결과의 원인인지 여부를 확인하려면 모든 실험에 양성 대조군을 포함하십시오. 여기에 제시된 데이터를 얻기 위해 우리가 사용한 양성 대조군은 두 개의 상호작용하는 융합 단백질로 구성된다: cAPM 의존성 단백질 키나제 촉매 서브유닛 알파(PRKACA) 및 더 큰 단편과 융합된 cAPM 의존성 단백질 키나아제 유형 II-알파 조절 서브유닛(PRKAR2A)과 융합된 더 작은 단편. 우리 손에는 해당 RLU 값이 ~ 6 x 105에 도달했습니다. 이 숫자의 유의한 (2-3 차수) 하락은 수행 된 transfection의 차선책의 효율성을 나타낼 수 있습니다. 이러한 경우 배양 된 세포의 웰빙을 확인하고 적절한 수의 세포가 형질감염을 위해 도금되고 있는지 확인하는 것이 좋습니다.
그림 1: 멤브레인 토폴로지 및 태깅의 회로도. (a) SLC35A2 및 SLC35A3 단백질의 막 토폴로지. (b) SLC35A2 및 SLC35A3 단백질을 분할 루시퍼라제 보체 분석 단편으로 태깅하고 생성된 융합 단백질을 상기 분석을 위해 결합시킬 가능성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 선택된 단백질 조합 및 상응하는 음성 대조군에 대해 HEK293T 세포에서 수행된 분할 루시퍼라아제 보체 분석의 결과(처리된 데이터). (a) 선택된 단백질 조합 및 상응하는 음성 대조군에 대해 수득된 RLU 값. 네거티브, HaloTag 태그 SmBiT로 태그; PRKAR2A, cAPM-의존성 단백질 키나아제 타입 II-알파 조절 서브유닛; PRKACA, cAPM-의존성 단백질 키나아제 촉매 서브유닛 알파. 데이터는 다중 비교와 함께 단방향 ANOVA를 사용하여 분석되었으며 세 번의 기술적 반복실험에서 평균 ± 표준 편차(SD)로 제시됩니다. p < 0.1 *, p < 0.05 **, p < 0.01 ***. (b) 시험된 조합(RLU SAMPLE)에 대해 수득된 평균 발광을 상응하는 음성 대조군(RLU CONTROL)에 대해 수득된 평균 발광으로 나눔으로써 계산된 폴드 변화. 상호작용을 나타내는 것으로 간주되는 임계값은 10으로 설정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: HA-태깅된 NST 변이체의 동시 동시 발현에 의한 SLC35A2-LgBiT와 SmBiT-SLC35A3 사이의 상호작용의 특이적 및 용량-의존적 파괴. HEK293T 세포를 SLC35A2-LgBiT 및 SmBiT-SLC35A3을 코딩하는 플라스미드로 형질감염시키고, 추가적으로 빈 pSelect 플라스미드(모의) 또는 HA-태깅된 SLC35A2(왼쪽 패널) 및 SLC35A3(오른쪽 패널)을 코딩하는 pSelect 플라스미드의 증가량으로 형질감염시켰다. 데이터는 다중 비교와 함께 단방향 ANOVA를 사용하여 분석되었으며 세 번의 기술적 반복실험에서 평균 ± 표준 편차(SD)로 제시됩니다. p < 0.05 **, p < 0.001 ****. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 선택된 단백질 조합 및 상응하는 음성 대조군에 대해 HEK293T 세포에서 수행된 검정의 결과(raw data). 선택된 단백질 조합 및 상응하는 음성 대조군에 대해 수득된 처리되지 않은 RLU 값이 도시된다. 네거티브, HaloTag 태그 SmBiT로 태그; PRKAR2A, cAPM-의존성 단백질 키나아제 타입 II-알파 조절 서브유닛; PRKACA, cAPM-의존성 단백질 키나아제 촉매 서브유닛 알파, TR, 기술 복제. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: HA 태깅된 NST 변이체의 동시 동시 발현에 의한 SLC35A2-LgBiT 및 SmBiT-SLC35A3 사이의 상호작용의 특이적 및 용량-의존적 파괴(raw data). 선택된 단백질 조합물에 대해 수득된 처리되지 않은 RLU 값이 도시되어 있다. 모의, SLC35A2-LgBiT 및 SmBiT-SLC35A3을 발현하는 세포는 빈 pSelect 벡터로 공동-형질감염되고; HA-SLC35A2, SLC35A2-LgBiT 및 SmBiT-SLC35A3을 발현하는 세포는 N-말단에서 HA 에피토프로 태그된 SLC35A2를 코딩하는 pSelect 플라스미드의 지시된 양으로 공동-형질감염되고; HA-SLC35A3, SLC35A2-LgBiT 및 SmBiT-SLC35A3을 발현하는 세포는 N-말단에서 HA 에피토프로 태그된 SLC35A3을 코딩하는 pSelect 플라스미드의 지시된 양으로 공동-형질감염되고; TR, 기술 복제. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 우리는 분할 루시퍼라제 보체 검정을 사용하여 NSTs와 같은 골지-상주 유형 III 막 단백질 사이에 형성된 이종 복합체의 시연을 가능하게 하는 상세한 프로토콜을 제공한다. 데이터 분석 및 해석에 대한 제안된 접근법은 관심있는 단백질 조합에 대해 수득된 발광을 상응하는 대조 조합에 대해 수득된 발광과 관련시키는 것을 포함하며, 이는 더 작은 단편과 융합된 박테리아 기원의 더 큰 단편 및 대조 단백질과 융합된 관심있는 단백질 중 하나로 구성된다. 후자는 포유동물 세포의 세포질에서 발현되고; 따라서, 이를 참고문헌으로 사용하려면 상호작용을 분석해야 하는 단백질의 N- 및/또는 C-테르미니가 골지막의 세포질 측면에 있어야 한다.
프로토콜의 중요한 단계는 플라스미드 설계, 형질감염 될 세포 도금, 자체 형질감염, 배지 교환, furimazine 작업 용액의 준비 및 세포에 첨가하는 것입니다. 플라스미드 설계는 루시퍼라제 단편이 모두 세포질에 직면하는 방식으로 이루어져야하며, 그렇지 않으면 제어 조합이 작동하지 않고 기준 RLU 값이 누락됩니다. 형질감염될 세포는 프로토콜에 명시된 대로 플레이팅되어야 하며, 그렇지 않으면 형질감염 효율이 차선책일 수 있다. 배지를 교환하는 동안 세포 부착을 지원하기 위해 폴리-L-라이신 코팅 표면이 있는 멀티웰 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. 마지막으로, furimazine 작업 용액은 신선하게 준비되고 즉시 세포에 첨가되어야합니다. 일단 추가되면 가능한 한 빨리 판독을 수행해야합니다.
결정적이지 않은 결과를 피하려면 긍정적 인 통제와 부정적인 통제가 항상 포함되어야합니다. 양성 대조군은 형질감염 효율이 모니터링되도록 항상 사용되어야 한다. HaloTag-기반 음성 대조군뿐만 아니라 서로 지형 학적으로 호환되는 모든 가능한 융합 단백질이 생성되고 결합되는 것이 매우 중요합니다. 가능하다면, 임의의 관심있는 단백질과 상호작용하지 않는 막 단백질을 포함하는 음성 대조군이 사용되어야 한다. 여기서 우리는 개발이 아직 진행 중이기 때문에 그러한 통제를 사용하지 않았습니다. 대신, 우리는 분석 된 단백질 중 하나의 태그가없는 여분의 사본을 공동 발현함으로써 관심있는 복합체의 특정 분해를 강요했습니다. 우리가 사용한 발현 벡터는 비교적 약한 단순 포진 바이러스-티미딘 키나제 (HSV-TK) 프로모터를 운반하며, 이는 특정 결과를 얻기에 최적인 낮은 발현 수준을 보장합니다. 그러나, 차선책의 결과의 경우, CMV 기반 벡터를 사용하거나 대안적으로 형질감염에 사용되는 플라스미드의 양을 최적화하는 것이 유익할 수 있다.
제시된 방법은 강력하고 편리하지만 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 이 방법은 확인된 복합체가 이량체 또는 고차 올리고머에 상응하는지 여부를 결론짓는 것을 허용하지 않는다. 게다가, 상호 작용하는 단백질의 세포 내 국소화는 모니터링 될 수 없습니다. 그러나 이것은 생체 발광 이미징을 통한 기본 프로토콜의 확장시 가능하지만, 형광 기반 접근법과 비교할 때 이러한 이미지의 공간 해상도는 상당히 낮을 것입니다.
제시된 방법은 매우 빠르고 효율적입니다 (측정에는 최대 몇 분이 걸리고 데이터는 수천 개의 세포에서 얻어집니다). 데이터 처리 및 해석 또한 비교적 간단합니다. 기본 프로토콜의 최적화가 거의 또는 전혀 필요하지 않습니다. 필요한 유일한 장비는 루미노미터입니다. 분할 루시퍼라제 보체 분석 및 BiFC는 동일한 필수 원리, 즉 그의 비기능적 단편으로부터 기능적 단백질의 재구성에 대해 작업한다. 형광에 기초한 접근법에 비해 생체 발광 기반 접근법의 일반적인 이점은 이미 서론에 열거되어 있었다. BiFC에 대한 분할 루시퍼라제 상보화 분석의 구체적인 이점은 전자가 완전히 가역적이라는 것이다15. BiFC에서, 일단 형광 단백질이 재구성되면, 상응하는 비형광 단편17로 다시 해리되지 않을 것이다. 대조적으로, NanoLuc 서브유닛의 조립은 가역적이어서 PPI의 역학을 연구할 수 있는 특별한 기회를 창출한다. 마지막으로, 제시된 방법의 예외적 인 감도는이 접근법이 트랜스펙트하기 어려운 세포주와도 작동해야한다고 가정 할 수있게합니다.
여기에 제시된 프로토콜은 두 골지-상주 III형 막 단백질이 상호작용하는지 여부를 결정할 수 있게 한다. 이미 언급한 바와 같이, 상기 방법의 기본 셋업은 관심있는 PPI의 세포내 국재화를 확인하기 위해 생체발광 이미징과 결합될 수 있다. 이 분할 루시퍼라제 보체 분석의 가역성은 PPI의 역학을 실시간으로 연구할 수 있게 한다. 푸리마진으로부터 유도된 발광 신호는 약 2시간 동안 지속된다. 그러나, 생성된 신호의 실질적으로 더 긴 (시간 내지 수일) 지속기간을 보장하는 분할 루시퍼라제 보체 분석을 위한 기질이 또한 이용가능하다. 이 방법은 관심있는 PPI를 트리거하거나 방지하는 요인의 식별을 허용합니다. 그것의 적용의 가장 최근의 예들 중 일부는 G 단백질과 G-단백질-결합 수용체들 사이의 상호작용에 대한 연구18, 단백질 형태적 변화19, 단백질 유비퀴틴화20, 세포 표면 수용체의 내재화21, 및 PPIs22,23을 조절하는 인자의 동정을 포함한다. 따라서이 방법은 매우 어려운 실험 목표를 달성 할 수있는 잠재력이 높은 다목적 도구 인 것으로 보입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 폴란드 크라쿠프의 국립 과학 센터 (NCN)의 보조금 번호 2016 / 23 / D / NZ3 / 01314에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
References
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