Summary
Här beskriver vi en snabb och direkt in vivo CRISPR/Cas9 screening metodik med ultraljud-guidad in utero embryonala lentiviral injektioner för att samtidigt bedöma funktioner hos flera gener i huden och munhålan hos immunkompetenta möss.
Abstract
Genetiskt modifierade musmodeller (GEMM) har varit avgörande för att bedöma genfunktionen, modellera mänskliga sjukdomar och fungera som preklinisk modell för att bedöma terapeutiska vägar. Men deras tids-, arbets- och kostnadsintensiva natur begränsar deras nytta för systematisk analys av genfunktionen. De senaste framstegen inom genomredigeringsteknik övervinner dessa begränsningar och möjliggör snabb generering av specifika genförstenheter direkt inom specifika musorgan på ett multiplexerat och snabbt sätt. Här beskriver vi en CRISPR/ Cas9-baserad metod (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) för att generera tusentals gen knock-out kloner inom epitel av huden och munhålan hos möss, och tillhandahålla ett protokoll som beskriver de steg som krävs för att utföra en direkt in vivo CRISPR-skärm för tumör suppressor gener. Detta tillvägagångssätt kan tillämpas på andra organ eller annan CRISPR/Cas9-teknik som CRISPR-aktivering eller CRISPR-inaktivering för att studera genens biologiska funktion under vävnadshomeostas eller i olika sjukdomsmiljöer.
Introduction
En av utmaningarna för cancerforskningen under den postgenomiska eran är att bryta den stora mängden genomdata för kausala genmutationer och att identifiera noder i gennätverket som kan riktas terapeutiskt. Medan bioinformatiska analyser har bidragit enormt mot dessa mål, är etablering av effektiva in vitro- och in vivo-modeller en förutsättning för att dechiffrera komplexiteten i biologiska system och sjukdomsstater och för att möjliggöra läkemedelsutveckling. Medan konventionella transgena musmodeller har använts i stor utsträckning för in vivo-cancergenetikstudier, har deras kostnads-, tids- och arbetsintensiva natur till stor del förbjudit den systematiska analysen av de hundratals förmodade cancergener som upplösts av modern genomik. För att övervinna denna flaskhals kombinerade vi en tidigare etablerad ultraljud-guidad in utero injektionsmetodik1,2 med en CRISPR / Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) genredigeringsteknik3 för att samtidigt inducera och studera förlust av funktionsmutationer av hundratals gener i huden och munhålan hos en enda mus.
Metoden som beskrivs här använder ultraljud-guidade injektioner av konstruerade lentivirus i fosterhinnan håligheten i levande mus embryon på embryonal dag E9.5. Den lentivirala lasten som innehåller CRISPR/Cas9-komponenter omvandlar den enskiktade ytan ectoderm, vilket senare ger upphov till hudens epitel och munhålan. Huden består av en yttre epidermis, följt av källarmembran och dermis. Epidermis är ett stratifierat epitel bestående av ett inre, basalt skikt, som upprätthåller kontakten med källarmembranet och har proliferativ och stamcellskapacitet. Basalskiktet ger upphov till de differentierade lagren ovan som spinous, granular och stratum corneum lager2,4. Härstamningsspårningsstudier visar att denna direkta in vivo CRISPR/Cas9-metod genetiskt manipulerar vävnadsboende stamceller i det basala skiktet som kvarstår under hela vuxenlivet. Eftersom lentivirus kan titreras för att omvandla E9.5 ytan ectoderm vid klonisk densitet, kan denna metod användas för att generera mosaikmöss som hyser tusentals diskreta gen knock-out kloner. Nästa generations sekvensering kan sedan användas för att analysera effekten av CRISPR/Cas9-medierad genablation inom dessa kloner på ett multiplexerat sätt5.
Vi använde nyligen denna metod för att bedöma funktionen av 484 gener som visar återkommande mutationer i mänskliga huvudet och halsen skivepitelcancer (HNSCC)5. HNSCC är en förödande cancer med en hög dödlighet på 40-50% och det är den6: e vanligaste cancern i världen6. HNSCC uppstår i slemhinnor i övre luftvägarna eller munhålan och är associerade med tobaks- och alkoholkonsumtion eller humant papillomvirus (HPV) infektion. Testning Squamous Cell Carcinom (SCC) är hudtumörer och representerar den näst vanligaste cancern hos människor7. Testning SCC och HNSCC är histologiskt och molekylärt mycket lika, med en hög andel fall som uppvisar förändring i TP53, PIK3CA, NOTCH1 och HRAS8. Medan det bara finns en handfull gener muterade med hög frekvens, finns det hundratals gener som finns muterade vid låg frekvens (< 5%), ett fenomen som vanligtvis kallas långsvansfördelningen. Eftersom majoriteten av de långsvansgenerna saknar biologisk eller klinisk validering, använde vi denna in vivo CRISPR screening teknik för att modellera förlust av funktion av dessa gener i tumör-benägna möss med sensibiliserande mutationer i p53, Pik3ca eller Hras och identifierade flera nya tumör suppressor gener som samarbetar med p53, Pik3ca eller Hras för att utlösa tumör utveckling5.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att generera multiplexerade sgRNA lentivirala CRISPR sgRNA-bibliotek och utföra CRISPR / Cas9 gen knock-out skärmar i musytan ectoderm. Observera att denna metod kan anpassas för att införliva andra genmanipulationstekniker som CRISPR-aktivering (CRISPRa) och CRISPR-inaktivering (CRISPRi) eller modifieras för att rikta in sig på andra organsystem i musen för att studera genfunktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll godkändes och utfördes i enlighet med IACUC vid University of Toronto.
1. Design och kloning av poolade CRISPR-bibliotek
- Välj 4-5 sgRNAs som riktar sig till musgener av intresse från resurser som Broad Institute sgRNA designer (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) eller CHOPCHOP-server (https://chopchop.cbu.uib.no). Välj ett lika stort antal icke-målinriktade sgRNAs från t.ex. Sanjana et al.9 för att generera ett lika stort gRNA-bibliotek för icke-inriktningskontroller.
- Medan du konstruerar sgRNA-biblioteken, se till att det finns tillräckligt med täckning för varje sgRNA i det riktade organsystemet. För musskalet är epidermis på E9.5 ett enda lager som innehåller ~ 150 000 celler, varav de flesta har stamcellskapacitet4. Om lenti-viral transduktion resulterar i 15-20% smittsamhet, kommer endast 18 000-24 000 celler att transducerade vid E9,5. Skala experimentet därefter.
- För kloning och förstärkning av dessa sgRNA-bibliotek, lägg till BsmBI enzymbegränsningsplatser samt primerbindande DNA-sekvenser till 5' och 3' slutet av sgRNA och beställ den resulterande fullängds oligos som poolat oligonukleotidchip (Figur 1A).
- Om du vill multiplexera olika bibliotek på ett chip lägger du till biblioteksspecifika primersekvenser.
- Använd lämpliga primerpar, förstärk varje bibliotek separat från det poolade oligochipet. Blanda 25 μL 2x polymeras master mix, 20 μL DNase/RNase fritt vatten, 5 ng oligochip-DNA, 2,5 μL lämplig framåtriktad primer och 2,5 μL lämplig omvänd primer i ett PCR-rör. Använd 12-15 cykler och förstärk med 98 °C denaturering, 63-67 °C glödgning, 72 °C förlängningsparametrar för varje cykel i PCR-maskinen.
- Kör PCR-produkt på en 2,5% agarose gel och rena ~ 100 bp PCR produkt med hjälp av en gel DNA rengöring kit.
- Förbered ryggradsplasmiden.
- Smält 5 μg av cre-rekombinasen som innehåller pLKO-Cre stuffer v3-plasmid med 2 μL BsmBI i 50 μL reaktionsblandning i 1 timme vid 55 °C, följt av 1 μL alkalisk fosfatasinkubation i 45 min vid 37 °C enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Cre-rekombinas som innehåller pLKO-Cre stuffer v3 plasmid är en lenti-viral baserad plasmid som innehåller Cre-rekombinasenzym för att ta bort Lox-Stop-Lox kassett i musceller och har också en U6-promotor för att driva uttrycket av sgRNA och tracrRNA. En version med Cas9 och utan Cas9 kan användas och finnas tillgänglig på Addgene #158030 och #158031. - Kör det smälta DNA:t på en 1% agarosgel och rena det 7 kb linjära vektorbandet med hjälp av ett GEL DNA-rengöringskit. Observera att ett 2 kb stufferband också bör vara synligt vilket indikerar en framgångsrik sammanfattning.
- Smält 5 μg av cre-rekombinasen som innehåller pLKO-Cre stuffer v3-plasmid med 2 μL BsmBI i 50 μL reaktionsblandning i 1 timme vid 55 °C, följt av 1 μL alkalisk fosfatasinkubation i 45 min vid 37 °C enligt tillverkarens instruktioner.
- Ställ in ligaturreaktionen för att generera ett sgRNA-plasmidbibliotek.
- Blanda 1 μg renad vektor och 30 ng renad PCR-insats med 2 μL BsmBI, 5 μL T4 DNA-ligas, 10 μM ATP och 1x buffert som är specifik för BsmBI. Inkubera ligationsblandningen över natten vid 37 °C. Använd ett extra rör som innehåller alla ovanstående material utom PCR-insatsen som negativ kontroll.
- Nästa dag morgon, rena ligationsblandningen med oligo-rengöringssatsen och eluera i 7 μL RNase / DNase fritt vatten.
- Elektroporera biblioteket till kompetenta celler.
- Tillsätt 2 μL eluterat sgRNA-bibliotek eller negativ kontrollligeringsblandning till 25 μL tinade elektrokompetenta celler i förkylda cuvettes (1,0 mm) på is. Elektroporat enligt tillverkarens protokoll (10 μF, 600 Ohm, 1800 Volt). Tillsätt 975 μL återvinningsmedium (eller SOC-medium) i 10 s av pulsen.
- Överför elektroporerade celler till ett odlingsrör och inkubera i en timme vid 37 °C i en bakteriell skakningsinkubator vid 300 varv/min.
- Uppskatta omvandlingseffektiviteten och bibliotekstäckningen per sgRNA.
- Förbered en 100-faldig utspädning genom att överföra 10 μL av omvandlingsreaktionen som innehåller celler som elektroporerats med sgRNA-bibliotek eller negativ kontrollligion till 990 μL recovery medium och blanda väl.
- Platta 10 μL av den utspädda omvandlingsblandningen på en förvärmd 10 cm LB + ampicillin (100 μg/L) agarplatta. Detta resulterar i en 10 000-faldig utspädning av transformatorerna och använder denna platta för att beräkna omvandlingseffektiviteten. Utför inkubation av plattorna vid 30 °C i 14–16 timmar.
- Plätera resten av omvandlingsreaktionen genom att sprida 100 μL återvunna celler på varje platta på totalt 10 förvärmda 15 cm LB + ampicillin agarplattor. Inkubera plattorna i 14–16 timmar vid 30 °C. Observera att tillväxt vid 30 °C minimerar rekombinationen mellan de två långa terminalrepetitionerna i virusplasmiden.
- För att bedöma kloningsframgången beräknar du omvandlingseffektiviteten. Räkna antalet kolonier på utspädningsplattan som innehåller transformanter från sgRNA-biblioteket eller negativ kontrollligion (10 cm plattor, steg 1.8.2). Negativ kontrollblandning bör inte ha några eller bara mycket få kolonier. Om du vill få det totala antalet kolonier multiplicerar du antalet kolonier med 10 000.
OBS: Det räknade totala antalet kolonier representerar en bibliotekstäckning som bör vara minst 200x kolonier per sgRNA.- Se till att ett bibliotek med 2000 sgRNAs kommer att ha minst 400 000 kolonier. Om det inte finns tillräckligt med kolonier, upprepa och ställ in mer elektroporering.
- Kvalitetskontroll: Från utspädningsplattan, välj 20 kolonier och tillsätt varje koloni till ett individuellt odlingsrör som innehåller 3 ml LB-media + ampicillin. Inkubera alla 20 rör över natten vid 30 °C skakningar vid 250 varv/min. Rena plasmid-DNA:t med hjälp av miniförberedande kit enligt tillverkarens instruktioner och Sanger-sekvensen alla 20 plasmid-DNA-prover för att verifiera att varje prov har en annan sgRNA-sekvens med U6-primern (5'-GAG GGC CTA TTT CCC ATG ATT CC-3').
- Skörda kolonierna från varje 15 cm tallrik.
- Tillsätt 7 ml LB-medium och skrapa sedan kolonierna från LB Agar-plattan med en cellspridare. Använd en 10 ml pipett för att överföra cellerna till en 2 L steril konisk kolv. Upprepa för alla plattor och poolbakterier i 2 L-kolven. Inkubera kolven i 2-3 timmar och skaka vid 30 °C. Centrifug kulturen och samla pelleten.
- Rena plasmid-DNA med hjälp av en maxi- plasmidreningssats.
- Ytterligare kvalitetskontroll: Använd 1 ng maxi-prep sgRNA-biblioteksplasmid-DNA och kör en PCR-reaktion med nästa generations sekvenseringsprimrar enligt tillverkarens instruktioner. Representationen av alla sgRNAs i biblioteket kan verifieras genom djup sekvenseringsplattform.
2. Produktion av hög titer lentivirus lämplig för in vivo transduktion
OBS: Utför alla steg i det här avsnittet av protokollet i en BSL2+-anläggning i ett biosäkerhetsskåp av klass II, typ A2. 293FT och särskilt 293NT-förpackningscellerna möjliggör högre virusproduktion. Använd låg passage ( 3. Ultraljudsstyrd kirurgi och injektion OBS: Denna teknik anpassades från4,11. Mikroinjektion inriktad på transduktion av ytepiteelet skall utföras på embryonal dag E9.5, när ytektodermen består av ett enda skikt och före bildandet av perdermen från och med E10, vilket skulle förhindra transduktion av detta basala skikt. Ställ helst upp möss på fredag, så att den första möjliga dagen med E9,5-embryon är följande måndag. Använd Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP möss (Jackson Laboratory #024857) för optimal CRISPR/ Cas9 effektivitet12. 4. Djup sekvenseringsprocedur
OBS: Använd alltid en oöppnad eller helt nyöppnad flaska DMEM för transfection, eftersom pH i detta steg är kritisk och DMEM blir mer grundläggande med tiden när den öppnats.
OBS: Den resulterande virusupphängningen bör ge en ungefärlig 2 000-faldig koncentration och den resulterande viruslösningen och bör ha viral titer på 107-109, vilket är tillräckligt bra för mer än 100 E9,5-operationer som beskrivs nedan.
OBS: Jämförelse mellan den koncentrerade virala suspensionen med dess okoncentrerade virala supernatant gör det möjligt att uppskatta framgången för (1) viral produktion samt (2) viruskoncentration. Alternativt kan viral titer uppskattas med qRT-PCR-metod10. Storskalig produktion och koncentration av lentivirus kan också utföras med hjälp av en tvåstegskoncentration med en patronkoncentration följt av ultracentrifugation som tidigarebeskrivits 2.
OBS: Överskrid inte 30 min anestesi eftersom gravida dammar är mycket mer benägna att avbryta sina embryon efter den tiden. En erfaren kirurg kan injicera upp till 12 embryon inom 30 minuters kirurgi.
OBS: När ultraljudsstyrs vid uterooperationer bör största möjliga försiktighet vidtas för att upprätthålla en ren miljö, bibehålla steriliteten så mycket som möjligt och undvika eventuella föroreningar. Om mer än en operation måste göras samma dag är det viktigt att sterilisera dissekeringsinstrumenten med hjälp av en pärlsiliseringsmedel och rengöra annan apparat som stöter på musvävnad som rengörs med etanol. Detta ökar kraftigt embryonas högre överlevnad efter operationen. Överlevnadsgraden för den kirurgimetod som beskrivs här är konsekvent mellan 80-100%.
OBS: Möss identifieras bäst med fluorescerande mikroskop fram till postnatal dag 3 innan håret börjar växa.
OBS: Det är viktigt att generera ett referensprov för att kunna beräkna sgRNA-vikningsförändringar över tid. Transduced embryon 3 dagar efter infektion eller transduced celler (se steg 2. 6) kan fungera som referensprov för att bestämma sgRNA representation i det ursprungliga biblioteket.
OBS: Ställ in streckkodnings PCR-reaktionen i ett separat dedikerat område i labbet eller i en vävnadskulturhuv som rengörs noggrant genom DNA-radering för att undvika kontaminering. Kör negativ kontroll för varje PCR-platta med vatten som mall för att se till att det inte finns någon förorening.
OBS: Förförstärkningssteget krävs endast för förstärkning av en komplex transinducerad vävnad. Om förstärka en enda tumör som förmodligen utvecklats bildar en klonurumär cell och därmed innehåller bara en enda sgRNA, kan man hoppa över pre-amplification PCR1 och fortsätta direkt med PCR2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A visar oligonukleotidernas design för multiplexering av flera anpassade CRISPR-bibliotek på ett kostnadseffektivt sätt på ett enda 12k- eller 92k oligochip. När sgRNAs (blå färgkodad) har valts är oligonukleotiderna utformade med restriktionsplatser (orangefärgade BsmBI) och biblioteksspecifika PCR-primerpar (grön färgkodad). Flera bibliotek kan utformas med hjälp av en unik kombination av primerpar för multiplexering i ett enda oligochip. När PCR förstärker biblioteken med ett specifikt PCR primer-par, inkludera alltid en vatten endast negativ kontroll och kör alla reaktioner på en agarose gel. Den negativa kontrollfilen bör inte ha några band på 100 bp, medan bibliotekets förstärkta körfält ska ha ett enda 100 bp-band. Om det inte finns något band kontrollerar du att PCR-primerparet är valt på rätt sätt. Figur 1B visar kvalitetskontrollsteget i det klonade biblioteket och virusproduktionen och koncentrationsförfarandet. Försiktighet bör vidtas för att bevara lika representation av sgRNAs från kloning till transduktion. Nästa generations sekvenseringsläsningar av PCR-förstärkt DNA från plasmid och lenti-virala bibliotek transduced celler bör visa en hög korrelation. Varje avvikelse måste analyseras noggrant för att undersöka om representationen går förlorad före eller efter preparatet av lenti-virus. Om sgRNA-avläsningarna från plasmid-DNA inte visar lika representation av sgRNAs, måste det virala preparatet och koncentrationsförfarandet upprepas med försiktighet. Om förlusten av lika sgRNA-representation inträffade i plasmid-DNA, måste hela kloningsförfarandet upprepas inklusive PCR-förstärkning av bibliotek från oligochip med reducerade förstärkningscykler. Framgången med CRISPR-biblioteksvisningen beror kritiskt på lika representation av de sgRNAs som finns i biblioteket.
Figur 2 visar den ultraljudsstyrda mikroinjektionen för att manipulera E9.5-embryona i den gravida musen. Hela uppsättningen placeras under ett biosäkerhetsnivåklass II-skåp för att upprätthålla det sterila tillståndet för hela proceduren och för att undvika infektion hos den gravida musen på grund av kirurgiska ingrepp. Var försiktig så att du inte pressar livmoderhornen under injektionen. Nålen måste vara mycket skarp, så att såret på livmoderväggen och fosterhinnan är minimalt.
Figur 3 visar resultaten av den ultraljudsstyrda injektionen av lenti-virus som bär på cre-rekombinas i E9.5 Lox-stop-Lox (LSL) Konfettimusvalpar på postnatal dag (P)0. Viral titer kan justeras för att få en lämplig transduktionstäckning av epidermis. Medan hög titer av virus skulle resultera i större täckning av mushuden, skulle det också resultera i transduktion av flera sgRNAs i samma cell som potentiellt förvirrar resultaten. För att minska flera ledningar av en enskild cell bör infektionshastigheten behållas <20%.
Figur 4 visar nästa generations sekvenseringsläsningar av PCR-förstärkt DNA från plasmid- och lentivirala bibliotekstransducerade celler och läser också från 4 representativa tumörer. sgRNA-guider riktade mot Adam10 och Ripk4 berikas i tumörproverna (trianglar och diamanter) jämfört med sgRNA-presentation i plasmidpool eller infekterade celler. Adam10 och Ripk4 fungerar som tumör suppressorer5. Flera hundra tumörer kan multiplexeras genom att tilldela unika streckkoder till varje prov och djupsekvenseras som beskrivs i protokollet.
Figur 1: Kloning av riktat CRISPR-bibliotek. A)Schematiskt som representerar utformningen av oligonukleotider för 12 k eller 92 k anpassat oligochip. BsmBI (eller andra kompatibla) begränsningsplatser (orange färgkodade och understrukna) lades till på varje sida av sgRNA. Pilhuvuden indikerar BsmBI-skärplatsen. För varje bibliotek lades ett unikt par PCR-primers (grön, brun och lila färgkodad) till, så att det specifikt kan förstärkas med PCR från det poolade chipet. Flera anpassade bibliotek kan multiplexeras upp till 12k eller 92k oligos. B)Graf som visar sgRNA-representation från ett CRISPR-bibliotek i plasmid-DNA jämfört med DNA från celler som transducerats med samma lentivirala bibliotek. Varje prick representerar en guide. Fullständig representation bibehölls efter transduktion med viss korrelation i överflöd. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Bild av den ultraljudsstyrda mikroinjektionsuppsättningen. (A) Musen som bar E9,5-embryon bedövades och placerades på en uppvärmd plattform med livmodern exponerad i en PBS-fylld modifierad Petri-skålkammare (stabiliserad av fyra modelleringslera). Det blå halvrunda gummit stödde livmodern som innehåller embryon och injektionsnålen från mikroinjektorn är placerad på höger sida. Ultraljud scan huvudet var monterad på toppen vidarebefordra live bild till skärmen bakom med nål huvudet synligt. (B) Närbild ultraljudsbild av ett E9.5 embryo. Lentiviral biblioteket injicerades med nålen (sett på höger sida) i fosterhinnan håligheten. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Lyckad transduktion av ytepiteler i musen. Fluorescerande bilder av helkropp, munhåla, tunga och gom av nyfödda Cre-reporter LSL-Confetti möss transduced med Cre lentivirus (Inlopp: motsvarande vita ljus bilder). Skalstänger = 500 μm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Djup sekvensering av tumörprover. Graf som visar sgRNA representation från ett CRISPR bibliotek i plasmid DNA kontra DNA från celler transduced med samma lentiviral bibliotek och förutom läsningar från 4 representativa tumörer. De röda och gröna cirklarna betecknar antalet Adam10- och Ripk4-sgRNA-läsningar i biblioteks- och transducedceller medan den röda triangeln representerar läsningarna av Adam10 sgRNAs och den gröna diamanten representerar läsningar av Ripk4 sgRNAs identifierade i tumörer från separata HNSCC-möss som visar en 1000x vikberikning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| PCR1 Framåt Primer | GAGGGCCTATTTCCCATGATTC (PÅ 8500)000000000000000 |
| OMVÄND PRIMER FÖR PCR1 | CAAACCCAGGGCTGCCTTGGAAA (CAAACCCAGGGCTGCCTTGGAA) |
Tabell 1: Primers för PCR1-reaktion. De framåt och omvända primers som används för förstärkning av regionen som omger sgRNA kassett från genomiskt DNA av celler transduced med lenti virus.
| steg | temperatur | Tid | |
| 1 | 98 °C | 30 sek | |
| 2 | 98 °C | 10 sek | |
| 3 | 66 °C | 30 sek | |
| 4 | 72 °C | 15 sek | 15 cykler (steg 2-4) |
| 5 | 72 °C | 2 min | |
| 6 | 4 °C | hålla |
Tabell 2: PCR1-cykelparametrar. PCR villkor som används för förstärkning av regionen som omger sgRNA kassett från genomiskt DNA av celler transduced med lenti virus.
| 501 FW (FW) | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTCTCCCTACACG ACGCTCTTCCGATCTtgtggaaaggacgaaaCACCG |
||
| 701 husbil | CAAGCAGACGGACGAGATCGAGTAATGTGACTGGAGAGCAGACGTGTGCT CTTCCGATCTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTAAAAC |
||
| * De understrukna baserna anger Illumina (D501-510 för framåt och D701-712 för omvänd) streckkodsplats som användes för multiplexering. | |||
| * Rödfärgade baser indikerar sekvensen som binder till målplatsen på den lentivirala CRISPR-plasmiden. Denna region kan ändras enligt den lentivirala vektorn som används. | |||
Tabell 3: Streckkodning Primers för PCR2 reaktion. Primers som används för att streckkoda förstärker varje tumörprov (antingen direkt från genomiskt DNA eller med produkterna från PCR1 som mall). Det understrukna området anger det unika streckkodsregionen som kan tilldelas för varje prov för multiplexering i en djup sekvenseringsreaktion. De rödfärgade basparen anger målområdet i den lentivirala konstruktion som dessa primers binder. Denna målregion kan ändras beroende på vilken typ av lentiviral konstruktion som används.
| steg | temperatur | Tid | |
| 1 | 98 °C | 30 sek | |
| 2 | 98 °C | 10 sek | |
| 3 | 68 °C | 30 sek | |
| 4 | 72 °C | 15 sek | 10 cykler (steg 2-4) |
| 5 | 72 °C | 2 min | |
| 6 | 4 °C | hålla |
Tabell 4: PCR2-cykelparametrar. PCR-villkor som används för att streckkoda förstärker varje tumörprov (antingen direkt från genomiskt DNA eller med produkterna från PCR1 som mall).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR/Cas9 genomredigering har använts flitigt i in vitro- och in vivo-studier för att undersöka genfunktioner och cellulära processer. De flesta in vivo-studier använder CRISPR/Cas9 genredigerade celler ympade till en djurmodell (allograft eller xenograft). Även om detta är ett kraftfullt verktyg för att studera cancergenetik och cellulära funktioner, saknar det fortfarande den inhemska vävnadsmikromiljön och kan framkalla sår och / eller immunsvar.
För att övervinna dessa utmaningar har flera grupper banat väg för direkta IN vivo CRISPR-metoder som genererar flera, multiplexerade autoktona musmodeller under de senasteåren 15,16,17,18. Dessa projekt förlitar sig vanligtvis på adeno-associerade virus (AAV) för att leverera sgRNAs till målorgan. AAV möjliggör generering av mycket högre titer och underlättar därmed produktion av hög titervirus som krävs för in vivo-manipuleringar. Användning av AAV begränsar dock allvarligt antalet gener som kan analyseras till cirka 40-50 gener, eftersom AAV, till skillnad från lentivirus, inte stabilt integreras i genomiskt DNA, vilket gör avläsning av sgRNA-bibliotek opraktisk. AAV-baserad screening kräver direkt avläsning av mutationer på målplatser med hjälp av t.ex. riktad fångstsekvensering. Multiplexerad PCR-baserad fångstsekvensering begränsar dock antalet inspelningsbara mål i ett "skärmbart" bibliotek vanligtvis till storleksordningendussintals 15,16,17,18.
Jämfört med AAV in vivo CRISPR-skärmar använder den metod som beskrivs här lentivirala sgRNAs. Med tanke på att lentivirala konstruktioner integreras i målcellens DNA kan sgRNA-representation analyseras i genomiskt DNA som liknar alla konventionella CRISPR-skärmar19,20. Således tillåter denna metodik samtidig analys av hundratals gener och kan sömlöst skalas upp även till genomomfattande in vivo-skärmar. Till exempel skulle en genomomfattande skärm med 78 000 sgRNAs och en täckning på 30x kräva ~ 90 embryon som tidigare beskrivits för en liknande shRNA-skärm4. Eftersom kullstorlekarna för de vanligaste inavlade musstammarna är cirka 8-12 valpar / kull och en erfaren kirurg lätt kan injicera alla möss inom lite mindre, skulle endast cirka ~ 10-12 dammar och operationer krävas för en sådan genomomfattande skärm.
Framgången för en in vivo-skärm beror på produktion av hög titervirus. Medan lentivirala konstruktioner som uttrycker ett sgRNA av intresse, Cas9 och Cre (t.ex. pSECC) är en bekväm och genomförbar allt-i-ett-lösning, har de förpackningsgränsen för den lentivirala kapsiden (~ 10 kb i total storlek), vilket leder till totalt lägre viral titer. För att övervinna denna utmaning använder vi R26-LSL-Cas9-GFP möss och en lenti-viral konstruktion som endast innehåller Cre-rekombinas tillsammans med ett sgRNA. Den resulterande lentivirala konstruktionen är endast 7 kb lång och ger en viral titer på mer än 108 PFU/ ml.
Riktade och specifika bibliotek kan snabbt genereras på så lite som några dagar och det komplexa nätverket av genetiska interaktioner kan studeras in vivo inom några veckor. Cas9-medierad mutagenes kan utföras antingen hos vilda möss för att studera organutveckling, homeostas eller sjukdoms fenotyper (cancer, inflammatoriska hudsjukdomar etc.) eller kan lätt kombineras med möss som hyser några onkogena mutationer eller kombination av mutationer för att modellera den genetiska status som finns hos mänskliga patienter. Dessutom kan kloningsmetoden förfinas för att klona CRISPRa- eller CRISPRi-bibliotek genom att lägga till kompatibla begränsningsplatser och sgRNA-sekvenser i allt-i-ett-plasmid. Observera att alla bibliotek som manipulerar genfunktioner kan användas inte bara i musmodeller utan också i andra djurmodeller och i organoidkulturer. Tillsammans belyser denna metod verktyget och ger en pannplatta för att använda direkt in vivo CRISPR för att integrera somatisk genredigering och musmodellering för att snabbt bedöma genfunktionen in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett projektbidrag från Canadian Institute of Health Research (CIHR 365252), Krembil Foundation och Ontario Research Fund Research Excellence Round 8 (RE08-065). Sampath Kumar Loganathan är mottagare av ett kanadensiskt cancerföreningsstipendium (BC-F-16#31919).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm cell culture plates | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
| Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| Chromic gut suture | Covidien | ||
| Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
| DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
| Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
| Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
| Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
| Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
| Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
| PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
| PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
| Permoplast modeling clay | |||
| Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
| Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
| Semicircular Silicone plug | Corning | ||
| Silicone membrane | Visual Sonics | ||
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
References
- Beronja, S., Fuchs, E. RNAi-mediated gene function analysis in skin. Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).
- Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Beronja, S., et al. RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth. Nature. 501, 185-190 (2013).
- Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367, 1264-1269 (2020).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).
- Green, A. C., Olsen, C. M. Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review. British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).
- Campbell, J. D., et al. pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas. Cell Reports. 23, 194-212 (2018).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11, 783-784 (2014).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
- Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343, 309-313 (2014).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology. 15, 554 (2014).
- Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics. Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).
- Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).
- Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).
- Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Science Advances. 4, 5508 (2018).
- Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (151), e59780 (2019).
- Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163, 1515-1526 (2015).
