Summary
We presenteren een eenvoudige methode om zeer levensvatbare adipose voorlopercellen te isoleren van epididymale vetkussens van muizen met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering.
Abstract
Obesitas en metabole stoornissen zoals diabetes, hartaandoeningen en kanker worden allemaal geassocieerd met dramatische aanpassing van vetweefsel. Weefsel-ingezeten adipose voorlopercellen (APC's) spelen een sleutelrol in vetweefsel homeostase en kunnen bijdragen aan de weefselpathologie. Het toenemende gebruik van eencellige analysetechnologieën – waaronder eencellige RNA-sequencing en enkelcellige proteomics – transformeert het stam/voorlopercelveld door een ongekende oplossing van individuele celexpressieveranderingen mogelijk te maken in de context van populatie- of weefselbrede veranderingen. In dit artikel bieden we gedetailleerde protocollen om epididymaal vetweefsel van muizen te ontleden, enkele van vetweefsel afgeleide cellen te isoleren en fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) uit te voeren om te verrijken voor levensvatbare Sca1+/ CD31-/ CD45-/ Ter119- APC's. Deze protocollen stellen onderzoekers in staat om hoogwaardige APC's voor te bereiden die geschikt zijn voor downstream-analyses zoals eencellige RNA-sequencing.
Introduction
Vetweefsel speelt een belangrijke rol in het energiemetabolisme. Overtollige energie wordt opgeslagen in de vorm van lipiden en vetweefsel kan aanzienlijk worden uitgebreid of ingetrokken, afhankelijk van de voedingstoestand en de energetische vraag. Uitbreiding van vetweefsel kan het gevolg zijn van een toename van de adipocytengrootte (hypertrofie) en/of van een toename van het aantal adipocyten (hyperplasie); het laatste proces strak gereguleerd door proliferatie en differentiatie van adipose voorlopercellen1,2. Tijdens obesitas breidt vetweefsel zich overmatig uit en ontwikkelt weefseldisfunctie – waaronder hypoxie, ontsteking en insulineresistentie – vaak3,4. Deze complicaties zijn risicofactoren voor veel chronische ziekten, waaronder hypertensie, diabetes, hart- en vaatziekten, beroerte en kanker5. Daarom zijn het beperken van ongecontroleerde uitzetting van vetweefsel en het beperken van vetweefselpathologieën topprioriteiten voor biomedisch onderzoek. Tijdens de uitzetting van vetweefsel verspreiden en differentiëren ingezeten vetweefsel-afgeleide stamcellen (ASC's) zich en differentiëren ze opeenvolgend in preadipocyten (geëngageerde voorlopercellen) en vervolgens in volwassen adipocyten6. Recente eencellige RNA-sequencing (scRNA-seq) studies tonen aan dat deze adipose progenitor cell (APC) populaties (ASC 's en preadipocyten) aanzienlijke moleculaire en functionele heterogeniteitvertonen 7,8,9,10,11,12. Asc's vertonen bijvoorbeeld een verminderde adipogene differentiatiecapaciteit, terwijl ze ook hogere proliferatie- en uitbreidingsmogelijkheden vertonen in vergelijking met preadipocyten7. Verdere moleculaire verschillen worden gerapporteerd binnen ASC- en preadipocytenpopulaties, hoewel de functionele relevantie van deze verschillen onduidelijk blijft7. Samen benadrukken deze gegevens de complexiteit van de adipose-voorlopercelpool en onderstrepen ze de noodzaak om tools te ontwikkelen en te standaardiseren om deze kritieke celpopulaties beter te begrijpen en te manipuleren.
Dit protocol beschrijft de isolatie van Sca1 met een hoge levensvatbaarheid+ adiposevoorlopercelpopulaties van muisepdidymale vetkussens die geschikt zijn voor gevoelige downstreamanalyses, waaronder eencellige studies (scRNA-sequencing) en celkweek. Isolatie en dissociatie van epididymale vetkussens werd uitgevoerd zoals eerder beschreven7,13 met kleine wijzigingen die de levensvatbaarheid van geïsoleerde APC's verbeteren. Kortom, gescheiden cellen van epididymale vetkussens zijn gekleurd met antilichamen tegen Sca1, een marker voor zowel ASC's als preadipocyten6,7en andere afstammingsmarkers (Lin): Ter119 (erythroidcellen), CD31 (endotheelcellen) en CD45 (leukocyten). Levensvatbare Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- cellen worden vervolgens gesorteerd op fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS). Belangrijk is dat dit protocol werd gevalideerd door succesvolle isolatie en analyse van levensvatbare Sca1+/Lin- vetvoorlopercellen gerapporteerd in een recente eencellige RNA-sequencingstudie die functioneel heterogene subpopulaties binnen ASC's en preadipocyten7identificeerde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle proefprocedures voor dieren werden uitgevoerd onder goedkeuring van de Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Oplossingsvoorbereiding
- Bereid collagenase 2% (w/v) oplossing door collagenase II 2 g in 100 ml Hanks' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) op te lossen. Aliquot 200 μL per stuk voor elk gebruik.
- Bereid neutralisatiemedium voor door 84 ml F-12 medium, 15 ml paardenserum en 1 ml penicilline/streptomycine te mengen.
- Bereid flowcytometriebuffer voor door 500 mg runderserumalbumine (BSA) en 400 μL 0,5 M EDTA op te lossen in 100 ml van Dulbecco's fosfaatbuffered zoutoplossing (DPBS).
2. Dissectie van epididymale vetkussen en weefseldissociatie
- Euthanaseer op humane wijze (isofluraan/cervicale dislocatie) één mannelijke muis. In dit protocol werd een vier maanden oude FVB-muis gebruikt.
- Breng 70% ethanol aan op de buik en stel de onderbuikholte bloot met een schone schaar en tang.
- Zoek epididymaal vetkussen (proximaal/bevestigd aan teelballen). Houd de verbinding tussen teelballen en epididymale vetkussen met stompe tang en trek voorzichtig om de epididymale vet pad te bevrijden.
- Verwijder teelballen door te snijden met een schaar en incubeer epididymaal vetkussen in 5 ml HBSS aangevuld met 3% BSA in een conische buis van 50 ml bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Centrifugeren bij 150 x g gedurende 7 min bij 4 °C.
- Neem drijvende epididymale vet pad uit de 50 ml conische buis en fijngehakt het weefsel met behulp van schone schaar.
- Voeg 200 μL collagenase 2% oplossing toe aan 3,8 ml HBSS in een 13 ml kweekbuis. Voeg het gehaktweefsel toe en incub in een roterende incubator bij 5 tpm gedurende 1 uur bij 37 °C. In plaats van een roterende incubator kan celkweekincubator bij 37 °C als alternatief worden gebruikt bij incidentele agitaties.
- Breng de volledige inhoud over in een conische buis van 50 ml en voeg 10 ml neutralisatiemedium toe. Meng voorzichtig door de buis 2-3 keer om te keren.
- Bereid nog een conische buis van 50 ml met een celzeef van 70 μm. Filtreer het verteerd weefsel in de nieuwe buis met behulp van de celzeef.
- Breng de doorstroming over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C op 350 x g.
- Verwijder voorzichtig de supernatant en resuspend celkorrels met 5 ml DPBS. Centrifugeren bij 350 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
- Verwijder voorzichtig het supernatant en voeg 50 μL flowcytometriebuffer toe. Meng goed door zachtjes te pipetten en houd cellen op ijs. Vanwege het volume van de celpellets en de kleine hoeveelheid restsupernatant zal het totale volume cellen in de stromingscytometriebuffer groter zijn dan 50 μL (ongeveer 100 μL).
3. Antilichaametikettering en fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS)
- Breng na het goed mengen van de cellen met zachte pipetting 54 μL van de celsuspensie over in een microcentrifugebuis van 1,7 ml. Voeg 6 μL FcR-blokkerend reagens toe en meng goed door zachtjes te pipetten. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C. Bewaar eventuele overgebleven cellen na het innemen van 54 μL en bewaar ze in het ijs om te gebruiken als een onbevlekte controle in stap 3.5 en stap 3.6.
- Bereid tijdens de incubatie in stap 3.1 een antilichaamcocktail door 11 μL elk anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC en anti-CD45-FITC-antilichamen in een microcentrifugebuis te combineren. Meng goed door zacht pipetten en houd op ijs beschermd tegen licht.
- Voeg na incubatie met FcR-blokkerend reagens gedurende 10 minuten 40 μL van de antilichaamcocktail toe en meng goed door zacht pipetten. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Voeg 500 μL flowcytometriebuffer aangevuld met 1 μg/ml DAPI toe aan de bevlekte cellen. Meng goed door cellen zachtjes te pipetten en te filteren met behulp van een 5 ml reageerbuis met cell zeef snap cap. Houd cellen in het ijs.
- Voeg in stap 3.1 500 μL flowcytometriebuffer toe aan de resterende cellen en meng goed door zacht te pipetten. Filter cellen met behulp van een 5 ml reageerbuis met cell zeef snap cap. Houd deze cellen in het ijs en gebruik als een niet-vastgehouden controle in de volgende stap.
- Breng de bevlekte cellen en de niet-opgeslagen controle naar het FACS-analyse- of sorteerinstrument.
- Identificeer en isoleer de APC+/FITC-/DAPI- populatie met gating strategieën weergegeven in figuur 1. Deze cellen vertegenwoordigen levensvatbare Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45- cellen. Puin en celaggregaten raken uitgeput met behulp van voorwaartse (FSC) en side scatter (SSC) plots. Vervolgens wordt DAPI- populatie omheind, gevolgd door gating van APC+/ FITC- populatie. Niet-duurzame controles moeten worden gebruikt om te helpen bij het vaststellen van gatingparameters.
- Verzamel de cellen in 500 μL flowcytometriebuffer in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. In de toekomst moeten alle procedures onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd om een besmetting tot een minimum te beperken. Ongeveer 50.000 – 100.000 cellen worden verzameld uit één muis.
- Tel cellen met behulp van een hemocytometer om de levensvatbaarheid van cellen te evalueren. Aangezien celaggregaten verdere downstreamanalyses kunnen verstoren, wordt de aanwezigheid van celaggregaten ook geëvalueerd om een minimale aanwezigheid (<5% van het levensvatbare celnummer) van deze aggregaten te garanderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vier maanden oude mannelijke FVB-muizen werden gebruikt in dit experiment. Na uitsluiting van puin en doubletten met behulp van FSC/SSC-percelen werden levensvatbare cellen (DAPI- populatie) afgesloten, gevolgd door de selectie van APC+/FITC- populatie (figuur 1). DAPI-, APC- en FITC-poorten werden getekend op basis van de niet-vastgehouden controle. Gatingstrategieën zijn weergegeven in figuur 1.
Na 1 uur sorteren werd de kwaliteit van de isolatie kwantitatief geëvalueerd door middel van flowcytometrieanalyse (figuur 2,3). De cellen werden bevlekt met propidiumjodideoplossing (1:100) voor levensvatbaarheidskleuring. Met dezelfde gating voor sortering behielden de cellen een hoge levensvatbaarheid en zuiverheid: 92,6 ± 2,2% enkele cellen (derde deelvenster in figuur 2),86,4 ± 3,0% levensvatbaarheid (PI- cellen) en 86,0 ± 2,8% APC+/FITC- cellen (n= 4, gemiddelde ± standaarddeviatie). Deze percentages werden gedefinieerd als percentages van elke gated populatie (enkelvoudige cellen, PI- cellen en PI-/APC+/FITC- populatie, respectievelijk in figuur 2) ten opzichte van het totale celaantal.
Figuur 1: Isolatie van levensvatbare Sca1+ adipose voorloper enkelvoudige cellen door FACS. Gating strategieën worden getoond in zowel bevlekte cellen als in een onbeheerde controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve flowcytometrie-analyse om de levensvatbaarheid van post-isolatiecellen te beoordelen. Levensvatbaarheidskleuring werd uitgevoerd met propidiumjodide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kwantificering van het percentage cellen 1 uur na-isolatie in flowcytometrie analyse. Percentages van enkele cellen, levensvatbare cellen en APC+/FITC- cellen werden gekwantificeerd om zuiverheid en levensvatbaarheid na isolatie van cellen te evalueren. De getoonde gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± standaarddeviatie. n=4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Single cell RNA sequencing (scRNA-seq) wint snel aan tractie als een krachtig hulpmiddel om tegelijkertijd diverse celpopulaties op het niveau van één cel te bestuderen. Vanwege de hoge kosten in verband met monstervoorbereiding en sequencing met hoge doorvoer, is het noodzakelijk om cellulaire ingangen (hoge levensvatbaarheid en zuiverheid) te optimaliseren om de kans op experimenteel succes te vergroten. Sommige celvoorbereidingsprotocollen zijn gebaseerd op verwijdering van dode cellen en puin met behulp van wasbeurten met lage spin en kolomgebaseerde scheiding zonder FACS-sortering14. Veel van deze methoden verminderen echter het aantal levensvatbare herstelde cellen aanzienlijk en in veel gevallen worden dode cellen niet volledig verwijderd14. Dit protocol schetst een eenvoudige methode om zeer levensvatbare Sca1+ vetverdesiteercellen te isoleren die minimaal cellulair puin, celdubbels en dode cellen bevatten. Hoewel cellen die zijn geïsoleerd met behulp van dit protocol een hoge levensvatbaarheid vertoonden, raden we nog steeds aan om de tijd tussen celisolatie en verdere downstreamanalyse te minimaliseren om een hoge levensvatbaarheid te behouden. Bovendien is succesvolle antilichaametikettering van cruciaal belang om Sca1+ vet voorlopercellen met een hoge zuiverheid te isoleren. Daarom wordt de bepaling van de optimale concentratie antilichamen sterk aanbevolen voor elk antilichaam en kan de verdunning van de antilichamen in stap 3.2 dienovereenkomstig worden aangepast.
Dit op flowcytometrie gebaseerde protocol is vatbaar voor aanpassing, afhankelijk van individuele interesse in specifieke adipose-voorlopercelsubpopulaties. Hier kunnen alternatieve antilichaamcombinaties worden gebruikt om de interessepopulatie(s) te identificeren en te isoleren. Inderdaad, als gevolg van uitgebreide APC marker diversiteit, meerdere laboratoria bestuderen APC's met behulp van scRNA-seq rapport isoleren cellen met behulp van andere oppervlakte markers. Bijvoorbeeld, PDGFRA+/CD44+ cellen, CD31-/CD45-/Ter119-/CD29+/CD34+/Sca1+ cellen, en Pdgfrb+ cellen zijn geïsoleerd door FACS voor downstream APC scRNA-seq analyses8,9,11. Cd142+ subpopulaties zijn ook gekarakteriseerd en vertonen een beperkte adipogene differentiatiecapaciteit en een vermogen om adipogenese 10,11te onderdrukken . Naast Sca1 werden onlangs combinaties van antilichamen tegen CD55, CD81 en CD9 gebruikt om ASC en preadipocytensubpopulaties prospectief te isoleren (met behulp van dit protocol) en subpopulatiemoleculaire en functionele heterogeniteit te bestuderen7. Bovendien kan het huidige protocol van toepassing zijn op isolatie van adipose voorlopercellen van andere vetkussens, waaronder liesvetkussens en bruine vetweefsels, met behulp van collagenasedissociatie zoals het huidige protocol15,16,17,het huidige protocol kan van toepassing zijn op isolatie van adipose voorlopercellen van andere vetweefsels.
Een kanttekening bij de huidige aanpak is dat deze is afgestemd op het isolement van onvolwassen APC's. Hoewel het huidige protocol apcs met een hoge levensvatbaarheid oplevert, is de werkzaamheid en efficiëntie van isolatie van andere in vetweefsel ingezeten celtypen (d.w.z. immuuncellen, fibroblasten, endotheelcellen, enz.) onduidelijk. Belangrijk is dat dit protocol niet geschikt is voor de isolatie van volwassen adipocyten. Adipocyten zijn extreem moeilijk te isoleren met behulp van FACS vanwege hun grote celgrootte en kwetsbaarheid. Onlangs werd isolatie van volwassen adipocyten door FACS gemeld met behulp van een grote nozzlegrootte (150 μm) en lage schededruk (6 psi) met een specifieke FSC/SSC gating strategie18. Toekomstige studies zouden dit adipocytenisolatieprotocol misschien kunnen samenvoegen met het protocol dat hier wordt beschreven om een uitgebreidere pijplijn tot stand te brengen om verschillende celtypen in vetweefsel te isoleren en te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We erkennen de Mayo Clinic Microscopy Cell Analysis Core Flow Cytometry Facility voor hulp bij FACS-sortering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
References
- Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
- Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).
- Halberg, N., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue. Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).
- Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. Obesity as a Disease. Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).
- Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).
- Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling. Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. eLife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364, 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559, 103-108 (2018).
- Raajendiran, A., et al. Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues. Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).
- De Matteis, R., et al. In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells. Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).
- Hanamsagar, R., et al. An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples. Scientific Reports. 10, 2219 (2020).
- Marinovic, M. P., et al. Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice. Scientific Reports. 8, 5057 (2018).
- Takahashi, H., et al. Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair. Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).
