Presentamos un método simple para aislar células progenitoras adiposas altamente viables de las almohadillas de grasa epidídmica del ratón usando clasificación celular activada por fluorescencia.
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Artículo de método
Preparación de células progenitoras adiposas de tejidos adiposos epidídicos del ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
La obesidad y los trastornos metabólicos como la diabetes, las enfermedades cardíacas y el cáncer están asociados con la remodelación dramática del tejido adiposo. Las células progenitoras adiposas residentes en tejidos (APC) desempeñan un papel clave en la homeostasis del tejido adiposo y pueden contribuir a la patología tisular. El creciente uso de tecnologías de análisis unicelular ,incluida la secuenciación de ARN unicelular y la proteómica unicelular, está transformando el campo celular madre/progenitor al permitir una resolución sin precedentes de los cambios en la expresión celular individual en el contexto de cambios en toda la población o en todo el tejido. En este artículo, proporcionamos protocolos detallados para diseccionar el tejido adiposo epidídmico del ratón, aislar células derivadas de tejido adiposo único y realizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para enriquecer para Sca1viable +/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. Estos protocolos permitirán a los investigadores preparar APCs de alta calidad adecuados para análisis posteriores, como la secuenciación de ARN de una sola célula.
Introducción
El tejido adiposo desempeña un papel clave en el metabolismo energético. El exceso de energía se almacena en forma de lípidos, y el tejido adiposo es capaz de expansión o retracción significativa dependiendo del estado nutricional y la demanda energética. La expansión del tejido adiposo puede ser el resultado de un aumento en el tamaño de los adipocitos (hipertrofia) y/o de un aumento en el número de adipocitos (hiperplasia); este último proceso estrictamente regulado por la proliferación y diferenciación de las células progenitoras adiposas1,2. Durante la obesidad, el tejido adiposo se expande excesivamente, ....
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales con animales fueron realizados bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Mayo Clinic.
1. Preparación de soluciones
- Preparar solución de colágeno 2% (w/v) disolviendo la colágenasa II 2 g en la solución de sal equilibrada (HBSS) de Hanks de 100 ml. Aliquot 200 μL cada uno para cada uso.
- Prepare el medio de neutralización mezclando 84 mL F-12 medio, 15 ml de suero de caballo y 1 mL de penicilina/estreptomicina.
- Prepare el amortiguador de la citometría de flujo disolviendo 500 mg de albúmina sérica bovina (BSA) y 400 μL de ....
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Resultados
En este experimento se utilizaron ratones FVB machos de cuatro meses de edad. Después de la exclusión de escombros y dobletes utilizando parcelas FSC/SSC, las células viables (DAPI- población) fueron cerradas, seguidas por la selección de APC+/FITC- población (Figura 1). Las puertas DAPI, APC y FITC se dibujaron sobre la base del control sin manchar. Las estrategias de Gating se muestran en la Figura 1.
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Discusión
La secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) está ganando rápidamente tracción como una poderosa herramienta para estudiar simultáneamente diversas poblaciones celulares a nivel de una sola célula. Debido a los altos costos asociados con la preparación de muestras y la secuenciación de alto rendimiento, es imperativo optimizar las entradas celulares (alta viabilidad y pureza) para aumentar la probabilidad de éxito experimental. Algunos protocolos de preparación celular se basan en la eliminación de células muer.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Reconocemos el Centro de Citometría de Flujo de Flujo de Núcleo de Análisis celular microscopía de Mayo Clinic para obtener ayuda con la clasificación de FACS.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de microcentrífuga de 1,7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Tubo de cultivo de 13 mL | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| Tubo cónico de 15 mL | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| ensayo de 5 mL con tapón a presión para filtro de células | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| Tubo cónico de 50 mL | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 y micro; filtro de células m | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anticuerpo anti-CD31-FITC | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anticuerpo anti-CD45-FITC | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anticuerpo anti-Sca1-APC | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Colagenasa tipo II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medio | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| Reactivo bloqueante FcR | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Suero de caballo | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicilina-estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Solución de yoduro de propidio | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
Referencias
- Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
- Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A.
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Reimpresiones y permisos
