Summary
Floresan aktif hücre sıralamasını kullanarak fare epidididimal yağ pedlerinden yüksek oranda uygulanabilir yağ progenitör hücrelerini izole etmek için basit bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Obezite ve diyabet, kalp hastalığı ve kanser gibi metabolik bozuklukların tümü dramatik yağ dokusu tadilatı ile ilişkilidir. Doku bazlı yağ progenitör hücreler (APC' ler) yağ dokusu homeostazında önemli bir rol oynar ve doku patolojisine katkıda bulunabilir. Tek hücreli RNA dizilimi ve tek hücreli proteomik dahil olmak üzere tek hücreli analiz teknolojilerinin artan kullanımı, popülasyon veya doku çapındaki değişiklikler bağlamında bireysel hücre ifade değişikliklerinin benzeri görülmemiş bir şekilde çözülmesine izin vererek kök/progenitör hücre alanını dönüştürmektedir. Bu yazıda, fare epidimal yağ dokusunu parçalamak, tek yağ dokusundan türetilmiş hücreleri izole etmek ve uygulanabilir Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APC'ler için zenginleştirmek için floresan aktif hücre sıralamasını (FACS) gerçekleştirmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Bu protokoller, araştırmacıların tek hücreli RNA dizilimi gibi aşağı akış analizleri için uygun yüksek kaliteli APC'ler hazırlamalarını sağlayacaktır.
Introduction
Yağ dokusu enerji metabolizmasında önemli bir rol oynar. Fazla enerji lipitler şeklinde depolanır ve yağ dokusu beslenme durumuna ve enerjik talebe bağlı olarak önemli genişleme veya geri çekilme yeteneğine sahiptir. Yağ dokusunun genişlemesi adiposit boyutundaki (hipertrofi) ve/veya adiposit sayısındaki (hiperplazi) artıştan; ikinci süreç, yağ progenitör hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması ile sıkı bir şekilde düzenlenir1,2. Obezite sırasında, yağ dokusu aşırı genişler ve hipoksi, iltihaplanma ve insülin direnci de dahil olmak üzere doku disfonksiyonu genellikle3,4gelişir. Bu komplikasyonlar hipertansiyon, diyabet, kardiyovasküler hastalıklar, inme ve kanser dahil olmak üzere birçok kronik hastalık için risk faktörleridir5. Bu nedenle, kontrolsüz yağ dokusu genişlemesini sınırlamak ve yağ dokusu patolojilerini azaltmak en önemli biyomedikal araştırma öncelikleridir. Yağ dokusu genişlemesi sırasında, yerleşik yağ dokusundan türetilmiş kök hücreler (ASC'ler) çoğalır ve sırayla preadipositlere (taahhüt edilen progenitör hücreler) ve daha sonra olgun adipositlere farklılaşır6. Son tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) çalışmaları, bu yağ progenitör hücre (APC) popülasyonlarının (ASC'ler ve preadipositler) önemli moleküler ve fonksiyonel heterojenlik 7,8 ,9,10,11,12. Örneğin, ASC'ler daha az adipojenik farklılaşma kapasitesi gösterirken, preadipositler7'yekıyasla daha yüksek çoğalma ve genişletme yetenekleri de sergiler. ASC ve preadiposit popülasyonlarında daha fazla moleküler farklılıklar bildirilmektedir, ancak bu farklılıkların işlevsel ilgisi belirsizliğini korumaktadır7. Birlikte, bu veriler yağ progenitor hücre havuzunun karmaşıklığını vurgular ve bu kritik hücre popülasyonlarını daha iyi anlamak ve manipüle etmek için araçlar geliştirme ve standartlaştırma ihtiyacının altını çizer.
Bu protokol, tek hücreli çalışmalar (scRNA-dizileme) ve hücre kültürü de dahil olmak üzere hassas aşağı akış analizleri için uygun olan fare epidididimal yağ pedlerinden yüksek canlılık Sca1+ yağ progenitör hücre popülasyonlarının izolasyonunun ayrıntılarını içerir. Epididimal yağ pedlerinin izolasyonu ve ayrışması, izole APC'lerin uygulanabilirliğini artıran hafif değişikliklerle daha önce açıklandığı gibi7,13 olarak gerçekleştirildi. Kısacası, epididimal yağ pedlerinden ayrışmış hücreler, hem ASC'ler hem de preadipositler6,7ve diğer soy (Lin) belirteçleri için bir belirteçolanSca1'e karşı antikorlarla lekelenir: Ter119 (eritroid hücreler), CD31 (endotel hücreleri) ve CD45 (lökositler). Uygulanabilir Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- hücreler daha sonra floresan aktif hücre sıralama (FACS) ile sıralanır. Daha da önemlisi, bu protokol, ASC'ler ve preadipositler içinde fonksiyonel olarak heterojen subpopulasyonları tanımlayan yeni bir tek hücreli RNA dizileme çalışmasında bildirilen uygulanabilir Sca1+/ Lin- yağ progenitör hücrelerinin başarılı izolasyonu ve analizi ile doğrulanmıştır7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneysel işlemleri Mayo Clinic Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanarak gerçekleştirildi.
1. Çözelti hazırlama
- Kollajenaz II 2 g'ı 100 mL Hanks'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) çözerek kollajenaz% 2 (w/v) çözeltisi hazırlayın. Her kullanım için aliquot 200 μL her biri.
- 84 mL F-12 orta, 15 mL at serumu ve 1 mL penisilin/streptomisisini karıştırarak nötralizasyon ortamını hazırlayın.
- Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininin (DPBS) 100 mL'sinde 500 mg sığır serum albümini (BSA) ve 400 μL 0,5 M EDTA'yı eriterek akış sitometri tamponu hazırlayın.
2. Epididimal yağ yastığının diseksiyonu ve doku ayrışması
- İnsanca ötenazi (izofluran/servikal çıkık) bir erkek fare. Bu protokolde dört aylık bir FVB fare kullanıldı.
- Karın bölgesine %70 etanol uygulayın/püskürtün ve temiz makas ve önps kullanarak alt karın boşluğunu ortaya çıkarın.
- Epididimal yağ yastığını bulun (proksimal/testislere bağlı). Testisler ve epididimal yağ pedi arasındaki kavşağı künt toparlamalarla tutun ve epididimal yağ yastığını serbest bırakmak için hafifçe çekin.
- Makas kullanarak keserek testisleri çıkarın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında 50 mL konik bir tüpte% 3 BSA ile desteklenmiş 5 mL HBSS'de epididimal yağ yastığını kuluçkaya yatırın.
- 4 °C'de 7 dakika boyunca 150 x g'da santrifüj.
- 50 mL konik tüpten yüzen epididimal yağ yastığı alın ve temiz makas kullanarak dokuyu ince bir şekilde kıyın.
- 13 mL kültür tüpünde 3,8 mL HBSS'ye 200 μL kollajenaz% 2 çözelti ekleyin. Kıyılmış dokuyu ekleyin ve 37 °C'de 1 saat boyunca 5 rpm'de dönen bir inkübatörde kuluçkaya yatırın. Dönen bir inkübatör yerine, 37 °C'deki hücre kültürü inkübatörü alternatif olarak zaman zaman ajitasyonlarla kullanılabilir.
- Tüm içeriği 50 mL konik bir tüpe aktarın ve 10 mL nötralizasyon ortamı ekleyin. Tüpü 2-3 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.
- 70 μm hücre süzgeç ile donatılmış başka bir 50 mL konik tüp hazırlayın. Hücre süzgecini kullanarak sindirilen dokuyu yeni tüpe filtreleyin.
- Akışı 4 °C'de 10 dakika boyunca 350 x g'da 15 mL konik tüpe ve santrifüje aktarın.
- 5 mL DPBS ile süpernatant ve resuspend hücre peletlerini dikkatlice çıkarın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj.
- Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve 50 μL akış sitometri tamponu ekleyin. Hafifçe pipetleyarak iyice karıştırın ve hücreleri buzda tutun. Hücre peletlerinin hacmi ve az miktarda artık süpernatant nedeniyle, akış sitometri tamponundaki hücrelerin toplam hacmi 50 μL'den (yaklaşık 100 μL) büyük olacaktır.
3. Antikor etiketleme ve floresan aktif hücre sıralama (FACS)
- Hücreleri nazik pipetleme ile iyice karıştırdıktan sonra, hücre süspansiyonunun 54 μL'lik kısmını 1,7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 6 μL FcR blokaj reaktifi ekleyin ve hafifçe pipetleyarak iyice karıştırın. 4 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatır. 54 μL aldıktan sonra kalan hücreleri kaydedin ve 3.5 ve adım 3.6'da yersiz bir kontrol olarak kullanmak için buzda tutun.
- 3.1. adımdaki inkübasyon sırasında, anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC ve anti-CD45-FITC antikorlarının her birini bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirerek bir antikor kokteyli hazırlayın. Hafif pipetleme ile iyice karıştırın ve ışıktan korunan buz üzerinde tutun.
- FcR bloke reaktifi ile 10 dakika inkübasyondan sonra, antikor kokteylinin 40 μL'lik kısmını ekleyin ve hafif pipetleme ile iyice karıştırın. 4 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatır.
- Lekeli hücrelere 1 μg/mL DAPI ile desteklenmiş 500 μL akış sitometri tamponu ekleyin. Hücre süzgeç yapışma kapağına sahip 5 mL'lik bir test tüpü kullanarak nazik pipetleme ve filtre hücreleri ile iyice karıştırın. Hücreleri buzda tutun.
- 3.1. adımda kalan hücrelere 500 μL akış sitometri tamponu ekleyin ve hafif pipetleme ile iyice karıştırın. Hücre süzgeç yapıştırıcı kapaklı 5 mL test tüpü kullanarak hücreleri filtreleyin. Bu hücreleri buzda tutun ve aşağıdaki adımda bozulmamış bir kontrol olarak kullanın.
- Lekeli hücreleri ve bozulmamış kontrolü FACS analiz veya sıralama cihazına götürün.
- Şekil 1'de gösterilen gating stratejileriyle APC+/FITC-/DAPI- popülasyonu tanımlayın ve yalıtın. Bu hücreler uygulanabilir Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45- hücrelerini temsil eder. Enkaz ve hücre agregaları ileri (FSC) ve yan dağılım (SSC) çizimleri kullanılarak tükenür. Daha sonra, DAPI- nüfus kapılı, ardından APC+/ FITC- nüfus gating. Gating parametrelerinin ayarlanmasına yardımcı olmak için ellenmemiş denetimler kullanılmalıdır.
- Hücreleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde 500 μL akış sitometri tamponunda toplayın. İleriye doğru, kontaminasyonu en aza indirmek için tüm prosedürler steril koşullar altında yapılmalıdır. Bir fareden yaklaşık 50.000 – 100.000 hücre toplanır.
- Hücre canlılığını değerlendirmek için hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Hücre agregaları daha fazla aşağı akış analizini engelleyebileceğinden, hücre agregalarının varlığı da bu agregaların minimum varlığını (<5% uygulanabilir hücre sayısının) sağlamak için değerlendirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu deneyde dört aylık erkek FVB fareleri kullanıldı. FSC/SSC arazileri kullanılarak enkaz ve çiftlerin dışlanmasından sonra, uygulanabilir hücreler (DAPI- popülasyon) kapılıydı, ardından APC+/ FITC- popülasyon seçimi (Şekil 1). DAPI, APC ve FITC kapıları, tespit edilmemiş kontrole göre çizildi. Gating stratejileri Şekil 1'de gösterilmiştir.
1 saat sıralamadan sonra, izolasyon kalitesi akış sitometri analizi ile nicel olarak değerlendirildi (Şekil 2,3). Hücreler canlılık lekesi için propidium iyot çözeltisi (1:100) ile boyandı. Sıralama için aynı gating kullanarak, hücreler yüksek canlılık ve saflık korudu: 92.6 ± 2.2% tek hücre (Şekil 2'deüçüncü panel), 86.4 ±% 3.0 canlılık (PI- hücreler) ve 86.0 ±% 2.8 APC+/ FITC- hücreler (n= 4, ortalama ± standart deviasyon). Bu yüzdeler, toplam hücre sayısına göre her geçişli popülasyonun (tek hücreler, PI- hücreler ve PI-/APC+/FITC- popülasyonu sırasıyla Şekil 2'de)yüzdesi olarak tanımlanmıştır.
Şekil 1: Uygulanabilir Sca1+ yağ progenitör tek hücrelerinin FACS tarafından izolasyonu. Gating stratejileri hem lekeli hücrelerde hem de tespit edilmemiş bir kontrolde gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İzolasyon sonrası hücre canlılığını değerlendirmek için temsili akış sitometri analizi. Canlılık lekesi propidium iyodür kullanılarak gerçekleştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Akış sitometrisi analizinde hücrelerin yüzdesinin ölçülmesi 1 saat izolasyon sonrası. Tek hücrelerin, canlı hücrelerin ve APC+/ FITC- hücrelerin yüzdeleri, hücrelerin izolasyonundan sonra saflığı ve canlılığı değerlendirmek için ölçülmektedir. Gösterilen veriler ortalama ± standart sapması temsil eder. n=4. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq), tek hücre düzeyindeki çeşitli hücre popülasyonlarını aynı anda incelemek için güçlü bir araç olarak hızla çekiş kazanıyor. Numune hazırlama ve yüksek verim sıralaması ile ilişkili yüksek maliyetler nedeniyle, deneysel başarı olasılığını artırmak için hücresel girdileri (yüksek canlılık ve saflık) optimize etmek zorunludur. Bazı hücre hazırlama protokolleri, FACS sıralama14olmadan düşük dönüşlü yıkamalar ve sütun tabanlı ayırma kullanarak ölü hücrelerin ve kalıntıların çıkarılmasına dayanır. Bununla birlikte, bu yöntemlerin çoğu, kurtarılabilir hücrelerin sayısını önemli ölçüde azaltır ve çoğu durumda, ölü hücreler tamamen çıkarılmaz14. Bu protokol, minimal hücresel döküntüler, hücre çiftleri ve ölü hücreler içeren yüksek oranda uygulanabilir Sca1+ yağ progenitör hücrelerini izole etmek için basit bir yöntemi özetlemektedir. Bu protokol kullanılarak izole edilen hücreler yüksek canlılık sergilese de, yüksek canlılığı korumak için hücre izolasyonu ve daha fazla aşağı akış analizi arasındaki süreyi en aza indirmenizi öneririz. Ek olarak, başarılı antikor etiketlemesi, yüksek saflığa sahip Sca1+ yağ progenitör hücrelerini izole etmek için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, her antikor için en uygun antikor konsantrasyonunun belirlenmesi şiddetle tavsiye edilir ve 3.2.
Bu akış sitometri tabanlı protokol, belirli yağ progenitör hücre alt popülasyonlarına bireysel ilgiye bağlı olarak özelleştirmeye açıktır. Burada, ilgi çekici popülasyonları tanımlamak ve izole etmek için alternatif antikor kombinasyonları kullanılabilir. Gerçekten de, kapsamlı APC belirteç çeşitliliği nedeniyle, scRNA-seq kullanarak APC'leri inceleyen birden fazla laboratuvar, diğer yüzey belirteçlerini kullanarak hücreleri izole ettiğini bildirmektedir. Örneğin, PDGFRA+/CD44+ hücreler, CD31-/CD45-/Ter119-/CD29+/CD34+/Sca1+ hücreleri ve Pdgfrb+ hücreleri aşağı akış APC scRNA-seq analizleri 8 ,9,11için FACS tarafından izole edilmiştir. CD142+ subpopulations da karakterize edilmiştir ve sınırlı adipojenik farklılaşma kapasitesi ve adipogenez bastırma yeteneği sergilediği gösterilmiştir10,11. Sca1'e ek olarak, CD55, CD81 ve CD9'a karşı antikor kombinasyonları yakın zamanda ASC ve preadiposit alt nüfuslarını (bu protokolü kullanarak) prospektif olarak izole etmek ve subpopülasyon moleküler ve fonksiyonel heterojeniteyi incelemek için kullanılmıştır7. Ayrıca, kasık yağ pedleri ve kahverengi yağ dokuları da dahil olmak üzere diğer yağ pedlerinden yağ progenitör hücreleri mevcut protokol15 , 16,17gibi kollajenaz ayrışması kullanılarak izole edildiğinden, mevcut protokol yağ progenitör hücrelerinin diğer yağ dokularından izolasyonu için uygulanabilir.
Mevcut yaklaşımın bir uyarısı, olgunlaşmamış APC'lerin izolasyonu için uyarlanmış olmasıdır. Mevcut protokol yüksek canlılık APC'leri verse de, diğer yağ dokusu yerleşik hücre tiplerinin (yani bağışıklık hücreleri, fibroblastlar, endotel hücreleri vb.) izolasyonunun etkinliği ve etkinliği belirsizdir. Daha da önemlisi, bu protokol olgun adipositlerin izolasyonu için uygun değildir. Adipositlerin büyük hücre boyutları ve kırılganlıkları nedeniyle FACS kullanarak izole etmeleri son derece zor olmuştur. Son zamanlarda, olgun adipositlerin FACS tarafından izolasyonu, belirli bir FSC / SSC gating stratejisi 18 ile büyük bir nozül boyutu (150 μm) ve düşük kılım basıncı(6psi) kullanılarak bildirilmiştir. Gelecekteki çalışmalar belki de bu adiposit izolasyon protokolünü, yağ dokusu içindeki çeşitli hücre türlerini izole etmek ve incelemek için daha kapsamlı bir boru hattı oluşturmak için burada açıklanan protokolle birleştirebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
FACS sıralama konusunda yardım için Mayo Clinic Mikroskopi Hücre Analizi Çekirdek Akış Sitometri Tesisi'ni kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
References
- Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
- Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).
- Halberg, N., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue. Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).
- Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. Obesity as a Disease. Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).
- Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).
- Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling. Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. eLife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364, 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559, 103-108 (2018).
- Raajendiran, A., et al. Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues. Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).
- De Matteis, R., et al. In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells. Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).
- Hanamsagar, R., et al. An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples. Scientific Reports. 10, 2219 (2020).
- Marinovic, M. P., et al. Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice. Scientific Reports. 8, 5057 (2018).
- Takahashi, H., et al. Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair. Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).
