Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מדידה של הפצות לחות תלת-ממדיות בתאים חיים באמצעות הדמיה וניתוח FRET היפרספקטרליים

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61720
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 3, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

Summary

בשל יחס אות לרעש נמוך (SNR) של חיישנים מבוססי העברת אנרגיית תהודה של Fӧrster (FRET), מדידת אותות המחנה הייתה מאתגרת, במיוחד בשלושה ממדים מרחביים. כאן, אנו מתארים מתודולוגיית דימות וניתוח FRET היפרספקטרלית המאפשרת מדידה של התפלגות המחנה בשלושה ממדים מרחביים.

Abstract

AMP מחזורי הוא שליח שני המעורב במגוון רחב של פעילויות תאיות ופיזיולוגיות. מספר מחקרים מצביעים על כך שאותות המחנה ממודרים, וכי המידור תורם לאותת על הספציפיות בתוך מסלול האיתות של המחנה. הפיתוח של biosensors מבוססי העברת אנרגיה תהודה Fӧrster (FRET) קידם את היכולת למדוד ולדמיין אותות cAMP בתאים. עם זאת, מדידות אלה מוגבלות לעתים קרובות לשני ממדים מרחביים, מה שעלול לגרום לפרשנות שגויה של נתונים. עד כה, היו רק מדידות מוגבלות מאוד של אותות המחנה בשלושה ממדים מרחביים (x, Y ו- z), בשל המגבלות הטכניות בשימוש בחיישני FRET המציגים מטבעם יחס אות לרעש נמוך (SNR). בנוסף, גישות הדמיה מסורתיות המבוססות על מסנן אינן יעילות לעתים קרובות למדידה מדויקת של אותות המחנה באזורים תת-תאיים מקומיים בשל מגוון גורמים, כולל הצלבה ספקטרלית, עוצמת אות מוגבלת ופלואורסצנטיות אוטומטית. כדי להתגבר על מגבלות אלה ולאפשר שימוש בביוסנסורים מבוססי FRET עם פלואורופורים מרובים, פיתחנו גישות דימות וניתוח FRET היפרספקטרליות המספקות ספציפיות ספקטרלית לחישוב יעילות FRET והיכולת להפריד באופן ספקטי אותות FRET מפלואורסצנטיות אוטומטית מבלבלת ו / או אותות מתוויות פלואורסצנטיות נוספות. כאן, אנו מציגים את המתודולוגיה ליישום הדמיית FRET היפרספקטרלית, כמו גם את הצורך לבנות ספרייה ספקטרלית מתאימה כי הוא לא undersampled ולא דגימת יתר לבצע unmixing ספקטרלי. בעוד אנו מציגים מתודולוגיה זו למדידה של התפלגות טמפ תלת מימדית בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים (PMVECs), מתודולוגיה זו יכולה לשמש לחקר הפצות מרחביות של המחנה במגוון סוגי תאים.

Introduction

אדנוסין מונופוספט מחזורי (באנגלית: Adenosine monophosphate) הוא שליח שני המעורב בתהליכים תאיים ופיזיולוגיים מרכזיים, לרבות חלוקת תאים, זרם סידן, שעתוק גנים והתמרת אותות. גוףגדל והולך של ראיות מצביע על קיומם של תאי המחנה בתא שדרכו מושגת הספציפיות של האיתות 1,2,3,4,5,6,7. עד לאחרונה, מידור המחנה הסיק בהתבסס על השפעות פיזיולוגיות או תאיות ברורות הנגרמות על ידי אגוניסטים קולטנים שונים מצמידי G8,9,10,11. לאחרונה, בדיקות הדמיית פלואורסצנטיות מבוססות FRET סיפקו גישות חדשות למדידה ותצפית ישירה של אותות המחנה בתא12,13,14.

העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET) היא תופעה פיזית שבה העברת אנרגיה מתרחשת בין מולקולות תורם ומקבל בצורה לא רדיאטורית כאשר המולקולות נמצאות בסמיכות15,16. עם התפתחותם של אינדיקטורים פלואורסצנטיים מבוססי FRET, תופעה פיזית זו שימשה ביישומים ביולוגיים לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון17, חלבון שיתוף לוקליזציה18, Ca+2 איתות19, ביטויגנים 20, חלוקת תאים21 ואיתות נוקלאוטיד מחזורי. מחווני המחנה מבוסס FRET מורכבים בדרך כלל מתחום כריכת המחנה, פלואורופור תורם ופלואורופור מקובל22. לדוגמה, חיישן H188 cAMP12,22 המשמש במתודולוגיה זו מורכב מתחום כריכת המחנה המתקבל מ- Epac, בין פלואורופורים בצבע טורקיז (תורם) ונוס (מקבל). בתנאים בסיסיים (לא מאוגדים), טורקיז ונוגה נמצאים באוריינטציה כך FRET מתרחשת בין הפלורופורים. בעת קשירת המחנה לתחום הכריכה, מתרחש שינוי קונפורמציה כך שטורקיז ונוגה מתרחקים זה מזה וכתוצאה מכך ירידה ב- FRET.

גישות הדמיה מבוססות FRET מציעות כלי מבטיח לחקירה והדמיה של אותות המחנה בתוך התא. עם זאת, טכניקות הדמיה מיקרוסקופיות מבוססות FRET הנוכחיות מצליחות לעתים קרובות רק באופן חלקי בהשגת עוצמת אות מספקת כדי למדוד FRET בבהירות מרחבית תת-תאית. זאת בשל מספר גורמים, כולל עוצמת האות המוגבלת של כתבי FRET רבים, רמת הדיוק הגבוהה הנדרשת לכימות מדויק של שינויים ביעילות FRET, ונוכחות של גורמים מבלבלים, כגון autofluorescence הסלולר23,24. התוצאה היא לעתים קרובות תמונה FRET כי הוא מוטרד על ידי SNR חלש, מה שהופך את הדמיה של שינויים תת תאיים FRET קשה מאוד. בנוסף, חקירה של אותות המחנה המותאמים לשפות הפליא בוצעה כמעט אך ורק בשני ממדים מרחביים בלבד והתפלגות המחנה צירי נחשבה לעתים רחוקות25. סביר להניח שהסיבה לכך היא ש-SNR נמוך עכב את היכולת למדוד ולדמיין מעברי צבע של המחנה בשלושה ממדים מרחביים. כדי להתגבר על מגבלות של שימוש בחיישני FRET עם SNR נמוך, יישמנו גישות הדמיה וניתוח היפרספקטרליות כדי למדוד FRET בתאים בודדים25,26,27.

גישות הדמיה היפרספקטרליות פותחו על ידי נאס"א כדי להבדיל בין אובייקטים יבשתיים הנמצאים בתמונותלווין 28,29. טכניקות אלה תורגמו מאז לשדה מיקרוסקופיה פלואורסצנטית30, עם מספר מערכות מיקרוסקופ קונפוקליות מסחריות המציעות גלאים ספקטרליים. בהדמיית פלואורסצנטיות מסורתית (לא ספקטרלית), המדגם מתרגש באמצעות מסנן פסים או קו לייזר, והפליטה נאספה באמצעות מסנן פסים שני, שנבחר לעתים קרובות כדי להתאים את אורך הגל של פליטת השיא של הפלואורופור(ים). לעומת זאת, גישות הדמיה היפרספקטרליות מבקשות לדגום פרופיל ספקטרלי מלא של פליטת פלואורסצנטיות26,31,32 או עירור33,34 במרווחי זמן ספציפיים אורך גל. במחקרים הקודמים שלנו, הראינו כי גישות הדמיה וניתוח היפרספקטרליות יכולות להציע כימות משופר של אותות FRET בתאים בהשוואה לטכניקות הדמיה FRET מבוססות מסנן מסורתיות26. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה לביצוע חלוקות וניתוח FRET תלת-ממדיות (x, Y, z ו- λ) כדי למדוד ולדמיין התפלגותamp בשלושה ממדים מרחביים. גישות אלה אפשרו הדמיה של מעברי צבע מרחביים של cAMP הנגרמים על-ידי אגוניסט בתאים בודדים25. מעניין, בהתאם אגוניסט, מעברי צבע המחנה עשוי להיות גלוי בתאים. המתודולוגיה המוצגת כאן משתמשת בהסרת ההסרה הספקטרלית של רקע לא אחיד ואוטלואורסצנטיות תאית כדי לשפר את הדיוק של מדידות FRET. בעוד מתודולוגיה זו מודגמת בתאי אנדותל מיקרו וסקולריים ריאתיים (PMVECs) באמצעות biosensor FRET cAMP, המתודולוגיה יכולה בקלות להיות שונה לשימוש עם כתבי FRET חלופיים או קווי תאים חלופיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר נהלים שאושרו על ידי אוניברסיטת דרום אלבמה מוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בוועדה.

1. הכנת תאים, דגימה וריאגנט להדמיה

  1. לבודד תאי אנדותל מיקרו וסקולריים ריאתי חולדה (PMVECs) כמתואר בעבר35.
    הערה: תאים היו מבודדים ותרבית על ידי הליבה תרבית התא באוניברסיטת דרום אלבמה, נייד, AL על 100 מ"מ תרבית תאים צלחות.
  2. זרע PMVECs מבודד על כיסויי זכוכית עגולה 25 מ"מ ולתת להם לגדול באינקובטור ב 37 °C (37 °F) עד התאים להשיג לפחות 80% השפעה (לפחות 24 שעות).
    הערה: תאים וסוג התא עשויים להשתנות ממחקר למחקר ולכן יש לעקוב אחר הליכי תרבית תאים ספציפיים לתאים כדי לזרוע ולגדל תאים. פרוטוקול זריעת תאים ופולחן המשמש במחקרים אלה זמין כמידע משלים בקובץ בשם "תרבות File_Cell משלימה ו Transfection".
  3. נצלו PMVECs עם ביו-סנסור FRET ודגרה למשך 48 שעות ב-37 °C (75 °F).
    הערה: הפרוטוקול כדי transfect PMVECs מתואר גם בקובץ מידע משלים בשם "תרבות File_Cell משלימה transfection".
  4. ביום ההדמיה, חימם את המאגר של טיירוד ל 37 °C (50 °F) באמבט מים.
    הערה: המאגר של טיירוד מורכב מ- 145 מ"מ NaCl, 4 מ"מ KCl, 10 מ"מ HEPES, 10 מ"מ גלוקוז, 1 מ"מ MgCl2 ו- 1 mM CaCl2
  5. הר כיסוי המכיל תאים שהודבקו לתא תא ואבטח את החלק העליון עם אטם הרכבה כדי למנוע דליפה.
  6. נגב את החלק התחתון של כיסוי באמצעות מחיקת משימה עדינה לניקוי כל מדיה עודפת או תאים דבקים.
  7. הוסף 800 μL של חיץ עובד ו 4 μL של תווית גרעינית 5 mM לתא התא וסלע בעדינות במשך 5 - 10 שניות.
    הערה: בעת הוספת פתרונות חוצץ או ריאגנט לכיסויים המותקנים בתא התא, הקפד להוסיף את הפתרון בעדינות ובצד תא התא כדי לא לפרק תאים דבקים. הוספת 4 μL של תווית גרעינית 5 mM ל 800 μL של חוצץ עושה 25 μM ריכוז סופי של תווית גרעינית. עבור תאים דבקים באופן רופף כגון תאי HEK293, מערבבים תחילה תווית גרעינית ומאגר בתקנה ולאחר מכן מוסיפים לכיסויים המותקנים בתא התא. פעולה זו תמנע הרמת התאים מהכיסוי.
  8. לכסות את תא התא עם רדיד אלומיניום כדי להגן מפני אור ודגורה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. הכנה ריאגנט: להוסיף 1 μL של 50 mM forskolin כדי 199 μL של חוצץ. זה יפיק ריכוז סופי של forskolin של 50 מיקרומטר כאשר נוסף לתאים שהוכנו עם 800 μL של חוצץ. 1 μL של DMSO ב 199 μL של חוצץ צריך גם להיות מוכן לשמש כשליטת רכב.
    הערה: במחקרים אלה, forskolin משמש מפעיל אדניל ציקלאז כדי לעורר ייצור המחנה. אם תרצה, מתודולוגיה זו יכולה להשתנות בקלות כדי לאפשר טיפול עם ריאגנטים חלופיים לגירוי או עיכוב אדניל ציקלאז, פוספודיזטראזים וכו '.

2. רכישת תמונות

  1. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בגלאי ספקטרלי.
    הערה: כל שלבי רכישת התמונות המתוארים כאן פותחו באמצעות מערכת מיקרוסקופ ניקון A1R זמינה מסחרית. ייתכן שיהיה צורך להתאים שלבים אלה אם משתמשים במיקרוסקופ ספקטרלי חלופי. ודא כי כל הציוד מופעל לפחות 30 דקות לפני תחילת הניסוי כדי להגיע לתנאי הפעלה יציבים.
  2. בחר את המטרה טבילת מים 60x ולהוסיף טיפת מים למטרה.
    הערה: להדמיה של תאים חיים ברזולוציה גבוהה, מומלץ להשתמש במטרה צמצם מספרי גבוה. עיין ברשימת החומרים לקבלת מידע אודות המטרה המשמשת במחקרים אלה.
  3. הנח את תא התא הטעון (משלב 1.7) על שלב המיקרוסקופ.
  4. בחר את המסנן DFT (DAPI/FITC/TRITC) שהוגדר על-ידי כוונון ידית המסנן בצד ימין של המיקרוסקופ.
  5. הפעל את המיקרוסקופ במצב פלואורסצנטיות רחבת שדה באמצעות העינים כדי לבחור שדה תצוגה המכיל תאים המבטאים את חיישן FRET המחנה.
    הערה: ודא שהעוצמה הממוצעת של אות FRET באורך הגל של שיא פליטת התורם או המקבל בתא הנבחר היא לפחות 100 יחידות עוצמה (A.U.) או לפחות פי 4 מהאות הבסיסי של אזור ללא תאים מתבטאים. ניתן לאשר זאת באמצעות מציג פרופיל הספקטרום הזמין בתוכנת רכיבי NIS. כאשר מחפשים תא עם אות טוב, מומלץ להשליך תאים בהירים מדי (הם עלולים להיות בסכנה).
  6. פתחו תוכנת NIS, עברו למצב קונפוקל, פתחו את כפתור ההשתלבות בלייזר ולחצו על Live.
  7. השתמש בידית המוקד כדי להתמקד בתאים על-ידי התבוננות בתצוגה המקדימה על המסך.
  8. קבע תצורה של הגדרות התקן, רכישה וערימת z בתוכנה, כמתואר להלן.
  9. הגדרות רכישה:
    הערה: ניתן להחיל הגדרות רכישת מצלמה והתקן באמצעות תמונה שנרכשה בעבר. פתח את התמונה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר 'שימוש חוזר בהגדרות המצלמה'.
    1. פתח את תפריט הגדרות A1, סמן את התיבות המתאימות לקווי לייזר של 405 ננומטר ו- 561 ננומטר, בחר SD לגלאי ספקטרלי, בחר 10 לרזולוציה ו- 31 לערוצים.
      הערה: תפריט הגדרות A1 מוצג כסמל גלגל שיניים קטן בפינה הימנית העליונה של חלון הגדרות A1 Plus. לייזר 405 ננומטר משמש להתרגשות תורמים ולייזר 561 ננומטר משמש לתסיסת גרעינית.
    2. הגדר את טווח אורך הגל (410 - 730 ננומטר) על-ידי בחירת ערכי אורך גל התחלה וסיום.
    3. לחץ על סמל binning/skip בתפריט הגדרות A1 ובחר בתיבה ממוספרת 15 ולאחר מכן לחץ על אישור בתפריט הגדרות A1.
      הערה: זה כדי להסיר את ערוץ אורך הגל המתאים לייזר עירור 561 ננומטר (זה בדרך כלל ערוץ אורךהגל 15). חשוב לא להשתמש בפס אורך הגל הזה כדי למנוע אות נמוך באופן מלאכותי, אשר יכול ליצור חפץ ספקטרלי. האות נמוך יותר ברצועה זו בגלל האצבע המכנית המכסה את אלמנט הגלאי כדי להגן עליו מפני נזק לייזר.
    4. הגדר את עוצמות הלייזר ל- 8% ו- 2% עבור לייזרי 405 ננומטר ו- 561 ננומטר, בהתאמה, Si Hv (רווח גלאי) ב- 149, ורדיוס חור סיכה של 2.4 יחידות דיסק אוורירית (AU).
      הערה: ייתכן שיהיה להתאים את עוצמות הלייזר בהתאם לגיל המכשיר ומצב הלייזרים. אם התאמת עוצמות לייזר בין דגימות שונות או קבוצות ניסוי, חשוב לשמור על אותו יחס של עוצמות לייזר (למשל, 8:2). בנוסף, חשוב לבחור בעוצמת לייזר שאינה כה בהירה עד כדי יצירת ליבנה מהירה. יש להתאים את רווח הגלאי כדי למקסם את עוצמת האות תוך מזעור רעש הגלאי. עבור מחקרים אלה, רווח של 149 שימש. גודל חור סיכה של 2.4 AU נבחר כאיזון בין רכישת תמונות עם יחס אות לרעש מספיק (SNR) לבין שמירה על חתך אופטי (confocality). עלייה בגודל חור הסיכה מגדילה את SNR אך מקטינה את הקונפוצליות.
    5. הגדר את מהירות הסריקה ל- 0.25 מסגרות ספקטרליות לשניה, בחר את הסמל המתאים ל- חד-כיווני לכיוון הסריקה, הזן 4 לספירה והגדר 1024 x 1024 עבור גודל הסריקה.
      הערה: אותות FRET חלשים, ומהירות סריקה איטית נדרשת לעתים קרובות. באמצעות מהירות סריקה של 0.25, רכישת מחסנית z ספקטרלית הושלמה בתוך ~ 3 דקות. מהירות הסריקה יכולה להיות מוגברת או מופחתת בהתאם פלואורופורים בשימוש. לדוגמה, עבור פלואורופורים בהירים יותר כמו eGFP, ניתן להשתמש במהירות סריקה מהירה יותר (2 פריימים לשנייה). המספר שהוזן תחת ספירה תואם למסגרת המהווה ערך ממוצע של 4, המסייע בהפחתת רעש במהלך רכישת תמונה. עבור דוגמאות יציבות מאוד והיכן שהזמן אינו אילוץ, ניתן להשתמש בערכי ממוצע גבוהים יותר (עד 16) כדי להשיג תמונות עם SNR משופר.
  10. הגדר פרמטרי רכישת z-stack:
    הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את הערכים שהוזנו בשלבים 2.10 כדי להתאים לשינויים בכריכה או בריכוז של תוויות פלואורסצנטיות, סוג התווית, מספר התוויות בהן נעשה שימוש, קו התא ושינויים אחרים בהכנת הדגימה שעשויים להשפיע על צפיפות תיוג התאים ו/או על הפלואורסצנטיות הסלולרית. בעת התאמת פרמטרי הרכישה, יש לנקוט זהירות כדי להשיג SNR מספיק תוך מזעור ההלבנה. בנוסף, בעת קביעת התצורה של בדיקה FRET ספקטרלי, יש לנקוט זהירות כדי להבטיח כי הפרמטרים לעבוד היטב על פני כל קבוצות הטיפול. מומלץ להפעיל ניסוי של כל קבוצת טיפול עם הגדרות הפרמטר המוצעות כדי להבטיח כי SNR מספיק והלבנת תמונות ממוזערת.
    1. פתח את חלון הרכישה של ND על-ידי לחיצה על תצוגה → בקרת רכישה → רכישת ND.
    2. הזן את הנתיב/היעד ואת שם הקובץ כדי לשמור את קובץ ND בחלון המוקפץ.
    3. סמן את התיבה המתאימה לסדרת z.
    4. לחץ על חי בחלון הגדרות A1 פלוס. פעולה זו תפתח חלון צפייה חי.
    5. התאם את ידית המוקד במיקרוסקופ כדי לבחור את החלק העליון של התא ולחץ על עליון בחלון הרכישה של ND כדי להגדיר את המיקום הנוכחי כחלק העליון.
      הערה: מומלץ להתמקד מעט מעל החלק העליון של התא כדי להבטיח שכל התא נדגם בסידרת z.
    6. התאם את ידית המוקד במיקרוסקופ כדי לבחור את החלק התחתון של התא ולחץ על Bottom בחלון הרכישה של ND כדי להגדיר את המיקום הנוכחי כתחתית.
      הערה: התמקד מעט מתחת לתחתית התא כדי להבטיח שכל התא יידגם.
    7. הזן 1 מיקרומטר עבור גודל שלב, בחר בחלק העליון התחתון עבור כיוון סריקת z ולחץ על הפעל בחלון רכישת ND כדי להשיג מחסנית z.
      הערה: גודל השלב קובע את מספר פרוסות z שנרכשו בהתאם למיקומים העליונים והתחתונים (כלומר, המרחק שעבר). גודל שלב של 1 מיקרומטר נבחר כפשרה בין מהירות הדמיה, דגימת ציר z והלבנת תמונות. באמצעות קוטר חור הסיכה הקונפוקל של 2.4 AU ואת המטרה טבילת מים 60x הביא עובי סעיף אופטי של 1.73 מיקרומטר. לפיכך, גודל שלב 1 מיקרומטר הוא מעט מתחת קריטריוני הדגימה Nyquist, אבל זה פשרה שנעשתה כדי להפחית את הזמן הדרוש כדי לרכוש z-מחסנית. עבור דגימות יציבות מאוד, אשר מהירות אינה קריטית, צעד קטן יותר z-ציר ואולי קוטר חור קונפוקלי קטן יותר עשוי לשמש כדי להגדיל את רזולוציית ציר z. החלק התחתון אמור להניב תוצאות דומות וניתן להשתמש בו כדי להעריך את כל ההשפעות של ליחתום תמונות שעלולות להתרחש במהלך סריקת z.
  11. הגדר את מערכת המיקוד המושלמת (PFS) אם היא זמינה:
    הערה: PFS מאפשר למערכת לפצות על תנודות בעומק המוקד במהלך רכישת תמונה. ניתן להשתמש בשלבים הבאים כדי להגדיר PFS, וצעדים אלה עשויים להשתנות מעט בהתאם לגירסת ניקון A1R ולגרסת רכיבי NIS בהם נעשה שימוש.
    1. סמן מצב סימטרי המוגדר על-ידי סמל הטווח בחלון הרכישה של ND.
    2. הפעל את לחצן PFS על הפנים הקדמיות של המיקרוסקופ (ודא שידית המראה הדיכרואית הממוקמת במקטע שמתחת לשלב המדגם היא 'ב').
    3. הגדיר מחדש את החלק העליון (סובב נגד כיוון השעון) והתחתון (סובב בכיוון השעון) באמצעות הידית בחזית של בקר היסט PFS.
    4. הגדר מיקום z/z יחסי על-ידי לחיצה על 'יחסי' בחלון הרכישה של ND.
    5. לחץ על זיכרון על הפנים הקדמיות של המיקרוסקופ, כך שהתוכנה תשנן את עומק z היחסי.
  12. לאחר השלמת רכישת z-stack, הוסיפו בעדינות את ריאגנט הרצוי (forskolin או בקרת רכב) באמצעות פיפטה והמתינו 10 דקות.
    הערה: הוסף את ריאגנט בעדינות רבה כדי לא להפריע לתאים או להזיז את המיקום של תא התא בתוך שלב המיקרוסקופ XY; מומלץ לוודא בתצוגה חיה או בתמונה שלאחר מכן ששדה הראייה לא השתנה במהלך הוספת ריאגנט. זמן ההמתנה של 10 דקות הוא שהטיפול בסלקולין ייכנס לתוקף. אם נעשה שימוש בטיפול אלטרנטיבי, ייתכן שיהיה צורך להתאים את זמן ההמתנה.
  13. לאחר 10 דקות, שנה את שם הקובץ ולחץ על הפעל בחלון הרכישה של ND.
  14. חזור על שלבים 2.11 – 2.13 כמפורט לעיל עבור לפחות 5 כיסויים כדי להשיג תוצאות מספיקות לניתוח סטטיסטי (n = 5 עבור כל קבוצת טיפול – forskolin ובקרת רכב).
  15. הכן דוגמאות וריק מדגם כדי לבנות את הספריה הספקטרלית ולרכוש תמונות ספקטרליות באמצעות הגדרות רכישה דומות כפי שמתואר בשלבים 2.9 ו- 2.10.

3. ניתוח תמונה

הערה: תמונות אלה ישמשו לבניית ספרייה ספקטרלית המכילה את הספקטרום הטהור של כל הבאים הבודדים הקיימים במחקר. המברים הסופיים בספרייה הספקטרלית עשויים להשתנות ממחקר למחקר אם משתמשים בפלואורופורים שונים. הליך מפורט לבניית הספרייה הספקטרלית מסופק בקובץ מידע משלים בשם "ספריית File_Spectral משלימה". כאן, אנו מתארים ייצוא נתונים לקבצים .tiff, ביטול ספקטרלי ליניארי, מדידות יעילות FRET, שחזור תלת מימדי ואומדן רמות המחנה. ניתוח תמונה יכול להתבצע באמצעות ניתוח תמונות ופלטפורמות תכנות שונות כגון ImageJ, פייתון, MATLAB או CellProfiler. במחקרים אלה, סקריפטים MATLAB שימשו.

  1. יצא נתוני תמונה:
    1. צור תיקיות חדשות עם אותו שם קובץ המתאים לתמונות הערימה z הספקטרליות שנרכשו בשלבים 2.13 ו- 2.14.
      הערה: השלבים הבאים המתוארים לייצוא נתונים ספציפיים עבור רכיבי NIS AR גירסה 4.30.01. שלבים אלה עשויים להשתנות מעט בהתאם לגירסת התוכנה.
    2. לחץ על קובץ, שיפתח חלון קובץ. עיין ובחר את קובץ התמונה הספקטרלי שנרכש בשלב 2.12 ולחץ על פתח.
    3. לאחר טעינת הקובץ, לחץ על קובץ→ ייבוא/ייצוא→ ייצוא מסמך ND.
    4. בחלון המוקפץ: עיין ובחר את התיקיה שנוצרה בשלב 3.1.1, בחר תבנית תמונה מתויגת (TIF) עבור סוג קובץ ולאחר מכן בחר תמונת מונו עבור כל ערוץ ושמור על עומק סיביות.
      הערה: קידומת הקובץ תיווצר מראש; שנה ערך זה לנוחות. סדר האינדקס ישתנה בהתאם לערוצים שנבחרו, ועליו להציג "z, c" עבור יצירת אינדקס לפי מיקום z-slice תחילה ומספר רצועת אורך גל שני. ודא שהתיבות המתאימות להחלת LUTs או להוספת שכבות-על או לשמות נקודות שימוש לא נבחרו.
    5. לחץ על יצא כדי לייצא את קבצי ה- tiff לתיקיית יעד כקבצי tiff בודדים.
    6. חזור על שלבים 3.1.2 – 3.1.5 כדי לייצא קבצי תמונה ספקטרליים שנרכשו בשלב 2.13.
  2. ביטול ספקטרלי ליניארי:
    1. פתח את תוכנת התכנות.
      הערה: סקריפט תכנות שפותח בהתאמה אישית כדי לבטל את ה- unmix תמונות ספקטרליות גולמיות מסופק באתר האינטרנט של אוניברסיטת דרום אלבמה BioImaging ו- BioSystems, תחת הכרטיסיה משאבים (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html).
    2. פתח את הקובץ שכותרתו "ביטול מיקסינג ליניארי.m" ולחץ על לחצן ההפעלה בסרגל הכלים של העורך.
    3. עיינו ובחרו את התיקיה המכילה את רצף הקבצים המיוצא *.tif שנוצר על ידי תוכנת NIS Elements.
    4. לחץ על אישור כדי להמשיך, אשר יפתח חלון חדש בשם אורך גל ו Z-Slice.
    5. העתק את שם הקובץ של הקובץ הראשון (ללא z-slice ומספר ערוץ) בתיקיה שנבחרה בשלב 3.2.4 והדבק אותו בשלב הראשון של תיבת הדו-שיח שכותרתה "הזן את שם התמונה".
    6. הזינו את מספר הערוצים בשלב השני שכותרתו "הזן את מספר רצועות אורך הגל", מספר פרוסות z בשלב השלישי שכותרתו "הזן את מספר פרוסות Z" ולחץ על אישור.
      הערה: מספר רצועות אורכי הגל עשוי להשתנות אם מתבצעים שינויים בהגדרות הרכישה, כגון התאמת טווח אורך הגל או גודל צעד אורך הגל. מספר פרוסות Z עשוי להשתנות גם בהתאם לגובה התא.
    7. עיין ובחר את קובץ אורך הגל בשם "Wavelength.mat" בחלון המוקפץ שכותרתו "בחר את קובץ המידע אורך הגל" ולחץ על פתח.
    8. עיין ובחר בקובץ "Library.mat" בחלון המוקפץ החדש שכותרתו "בחר את קובץ הספריה הספקטרלית", לחץ על פתח והמתן עד לסיום ביטול ה- Slicexing של הפרוסות.
      הערה: קובץ Library.mat הוא קובץ המכיל ספקטרום טהור עבור כל פלואורופור endmember יחד עם autofluorescence התא וחתימות ספקטרליות רקע. במקרה זה, פלואורופור סוף השנה כוללים טורקיז, ונוס ו- DRAQ5. חתימות ספקטרליות ברקע כוללות פלואורסצנטיות תאית או מטריצה, פלואורסצנטיות מכסה, וכיסוי עקיפה. קובץ Wavelength.mat הוא קובץ המכיל מידע ערוץ אורך גל המשמש לרכישת התמונה הספקטרלית. קובץ ספריה לדוגמה וקובץ אורך גל זמינים באתר Bioimaging ו- Biosystems (ראה את הפתק מתחת ל- 3.2.1). לקבלת מידע נוסף על אופן יצירת ספריה ספקטרלית וקבצי אורך גל, עיין בקובץ מידע משלים בשם "ספריית File_Spectral משלימה". תמונות לא מעורבות המתאימות לכל פרוסת z יישמרו בתיקיה הנקראת "לא מעורב" שנוצרה במהלך תהליך ביטול המיקסם בתוך התיקיה שנבחרה בשלב 3.2.3.
  3. חישוב יעילות FRET:
    1. פתח את קובץ ה- Script של התוכנית הנקרא "multiFRRCF.m" ולחץ על הפעל.
      הערה: קובץ תכנות זה זמין מאתר הביואימציה והביו-מערכות של אוניברסיטת דרום אלבמה (ראה הערה בשלב 3.2.1).
    2. הזן את מספר הניסויים הניסיוניים שיש לנתח בתיבת הדו-שיח המוקפצת הנקראת "כמה תיקיות לריס" ולחץ על אישור.
      הערה: יש לשמור נתוני תמונה מכל ניסוי בתיקיית תמונה נפרדת שאינה מעורבת. שלב זה פשוט מאפשר לקוד הניתוח לעבור בלולאה על תיקיות רבות כשלב לחיסכון בזמן.
    3. עיין ובחר את התיקיות הלא מעורבות ולחץ על אישור.
      הערה: מספר הפעמים שהחלון המוקפץ "חפש תיקיה" נפתח תלוי במספר שהוזן בתיבת הדו-שיח "כמה תיקיות לריסים" בשלב הקודם. עיין ובחר את התיקיות אחת אחרי השנייה.
    4. בחלון המוקפץ החדש, הזן את המידע הבא בתיבות המתאימות: גורם קנה המידה הוא 12.4, הסף הוא 5.6, X, Y ותדירות Z הם 5, 5 ו- 1 בהתאמה, ואלגוריתם ההחלקה הוא גאוס.
      הערה: גורם קנה המידה הוא ערך בפיקסלים/מיקרומטר וישמש לשינוי קנה המידה של דגימת כיוון Z לזו של כיוון XY. גורם קנה המידה מתקבל מגודל פיקסל התמונה, המסופק בדרך כלל כמטא-נתונים בתמונה עבור רוב מערכות המיקרוסקופ הקונפוקליות. לדוגמה, אם התמונה נרכשת עם מרווח של 0.08 מיקרומטר/פיקסלים, גורם קנה המידה צריך להיות 12.5 פיקסלים/מיקרומטר. ערך הסף ישמש לסף התמונות וליצור מסיכה בינארית של התא. יצרנו רשימה של ערכים אופטימליים המבוססים על עוצמת התורם+מקבל התמונות. השתמש ב- 4.5 כערך סף אם לתמונה יש עוצמת תורם+קבלה בהירה ורקע נמוך, ערך בין 5.6 ל- 6.5 עבור תמונות בעלות עוצמת תורם+קבלה מתונה בלבד ו/או רקע גבוה יותר, וערך של 7.5 ומעלה עבור תמונות בעלות עוצמת תורם+מקבל נמוכה מהרקע. ערך התדירות מתאים למרווח, במספר הפיקסלים, שבו הניקוד מתבצע בשלבים הבאים. לדוגמה, אם עומק Z של התא הוא 17 מיקרומטר עם גודל של 1 מיקרומטר שלב ומקדם קנה מידה של 12.5 פיקסלים/מיקרומטר משמש בכיוון XY, עומק ערכת הנתונים של התמונה התלת-ממדית יידגם מחדש ב- 212 פיקסלים (כיוון Z). בהתבסס על ערך תדר Z שהוזן (לדוגמה, פיקסל אחד), ערכת נתוני התמונה התלת-ממדית תיחתך מחדש החל מראש ערכת נתוני התמונה ולאחר מכן תעבור במרווחים של פיקסל אחד כלפי מטה. התוצאה היא 212 תמונות שנמסרו. אם הוזנו מרווח זמן גדול יותר של ערך תדר עבור תדר Z, ייווצרו פחות תמונות עם שרידים. תמונות שנחסכות נשמרות בשלבים הבאים.
    5. לחץ על הפעל והמתן עד לביצוע כל מדידות FRET והשרידים.
      הערה: תיקיה נפרדת נוצרת בספריית האב שאליה נשמרות תמונות יעילות FRET בגווני אפור ותמונות יעילות FRET צבעוניות (מפת צבעים מוחלת). לדוגמה, כל תמונות FRET בגווני אפור ובמפות צבע השזורות בכיוון X (מישור YZ) נשמרות בתיקיה הנקראת "Resliced_XFRET".
    6. חזור על הניתוח עם הגדרות דומות לכל הניסויים – לפני ואחרי טיפולי forskolin ובקרות רכב.
      הערה: שלבים המוזכרים בסעיף 3.3 מתארים את הערכים שיש להזין עבור קובץ ה- Script של תיכנות ניתוח FRET מותאם אישית כדי ליצור נתוני תמונה תלת-ממדיים של FRET. עם זאת, סקריפט זה מבצע מספר פעולות במהלך הפעלה, כולל: טעינת נתוני תמונה, יצירת ערימות תמונה, החלקה, חישובי יעילות FRET, יצירה והחלה של מסיכת גבול תא, שחזור תמונה תלת-ממדי, הוספת תמונות תלת-ממדיות במרווחי זמן שצוינו (תדרים), החלת מפת צבעים להמחשה חזותית של שינויי FRET ושמירת נתוני התמונה שהוחזרו לאותה ספריה. פרטים נוספים נכללו כהערות בקובץ ה- Script של התוכנית.

4. מיפוי יעילות FRET לרמות המחנה

  1. פתח את קובץ התיכנות בשם 'Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m' ולחץ על הפעל בחלון הראשי.
    הערה: הקובץ זמין באתר BioImaging ו- BioSystems (ראה הערה מתחת ל- 3.2.1). קובץ זה קורא תמונות יעילות FRET בגווני אפור וממיר אותן לרמות המחנה בהתבסס על עקומה אופיינית. עקומה אופיינית זו משתמשת בקשר גומלין של המחנה לפראט המתועד בספרות15,36 המתואר על-ידי משוואת היל (המשוואה השלישית המוצגת להלן). עם זאת, Kd של הבדיקה בתאים שלמים קשה להעריך והנחנו שזה יהיה 1 μM בחישובים שלנו. לפיכך, התוצאות מוצגות כפונקציה של Kd. (כלומר, [amp] = x* Kd). משוואות המשמשות למדידת יעילות FRET ומיפוי FRET לרמות המחנה מוצגות להלן:
    Equation 1
    כאשר E הוא יעילות FRET, ו- d נראה לעין הם עוצמות פיקסלים לא מעורבות של תמונות קבלה ותורם, בהתאמה.
    Qa ו- Qd הם תשואות קוונטיות של מקבל ותורם. שים לב ש- Qa ו- Qd מתבטלים כאשר המשוואה עבור kλ משולבת במשוואת היעילות FRET, kλ הוא גורםתיקון:
    Equation 2
    Equation 3Equation 4והם מקדמי הכחדה של תורם ומקבל באורך גל עירור התורם, i (405nm).
    Equation 5
    E הוא יעילות FRET ו- KD = קבוע דיסוציאציה = 1 מיקרומטר.
  2. נווטו ובחרו בתמונת FRET הראשונה בקנה מידה אפור (שנשמרה בשלב 3.3.5) ולחצו על הלחצן 'אשר'.
  3. פתח את תמונות FRET/cAMP כדי לבדוק את התפלגות אותות המחנה בשלושה ממדים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בגישות הדמיה וניתוח FRET היפרספקטרליות למדידת שיפועי המחנה בשלושה ממדים מרחביים בתאים חיים. ישנם מספר שלבים מרכזיים המעורבים ביצירת תוצאות אלה, שעבורם נדרשת תשומת לב זהירה בעת ניתוח וכימות הנתונים. צעדים מרכזיים אלה כוללים בניית ספריה ספקטרלית מתאימה, ביטול ספקטרלי ברקע, סף לזיהוי גבולות תא וחישובי יעילות FRET. איור 1 ממחיש את הזרימה הסכמטית של כל השלבים המעורבים במדידת יעילות FRET ורמות המחנה בתאים חיים. כאשר מבוצעים כראוי, שלבי הדמיה וניתוח אלה יאפשרו מדידה של יעילות FRET והערכת מעברי צבע מרחביים של המחנה ב-3 ממדים בתא, תוך התחשבות באותות רקע לא אחידים.

איור 2 מתאר תצוגות תלת-ממדיות של נתוני תמונה היפרספקטרליים גולמיים בצבע כוזב שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של ניקון A1R בתנאי בסיס (איור 2A) ו-10 דקות לאחר טיפול פורסקולין( איור 2B). שים לב כי גלאי דומה ופרמטרים מערכת שימשו לרכישה לפני ואחרי ערימות תמונה טיפול כדי לשמור על עקביות עבור ניתוח כמותי. כמו כן, שים לב כי שינויים FRET אינם ברורים בתמונה זו, שכן זהו אך ורק הדמיה של נתונים גולמיים, לפני חישוב יעילות FRET.

ספריה ספקטרלית עם ספקטרום טהור של כל חברי הקצה נדרשת כדי לנתח עוד יותר נתוני תמונה ספקטרליים גולמיים. בניית ספריה ספקטרלית מתאימה היא אחד השלבים המרכזיים כדי להבטיח מדידות מתאימות של יעילות FRET. איור 3 מדגים את בנייתה של ספרייה ספקטרלית המכילה את הספקטרום הטהור של אנשי הקצה (במחקרים הנוכחיים, המברים הסופיים הם טורקיז, ונוס ו-DRAQ5). כדי למדוד את יעילות FRET, חשוב להשיג את הספקטרום של טורקיז ונוגה באמצעות מדגם עם 1:1 סטויצ'ומטריה. כאן, סיפקנו גישה שבה פלואורופור הקבלה מושמדת לחלוטין, ומאפשרת לחתימות ספקטרליות של התורם והמקבל עם סטויצ'יומטריה 1:1(איור 3A-F). בנוסף, הוחלו יחסי כוח ליניאריים בין הלייזרים (איור 1 משלים) כדי לחשב את ספקטרום הקבלה בעוצמה שהייתה צפויה אם הוא היה מתרגש באמצעות לייזר עירור התורם, במקרה זה 405 ננומטר עבור טורקיז (איור 3G). זה מבטיח כי אותות תורם ומקבל לא מעורבים דומים בעוצמה מוחלטת כאשר FRET מתרגש עם קו לייזר יחיד 405 ננומטר. תאים שאינם מזוהים המסומנים בצבע הגרעיני, DRAQ5 (איור 3H) נוצלו כדי להשיג את הספקטרום הטהור של DRAQ5 (איור 3I). שילוב הספקטרום של התורם, טורקיז (איור 3F), מקבל, ונוס (איור 3G) ו DRAQ5 (איור 3I), ספרייה 3 רכיבים נוצרה (איור 3J).

אותות ממקורות שאינם תוויות פלורסנט עשויים להיות נוכחים גם במדגם. כדי להסביר את אלה, שלוש חתימות ספקטרליות שונות עם פסגות המתרחשות ב 424 ננומטר, 504 ננומטר, ו 574 ננומטר זוהו בתוך דגימות סלולריות ללא תווית. אנו מאמינים כי חתימות ספקטרליות אלה תואמות לכיסוי רפלציה ולטריצה סלולרית או אוטופלואורסצנטיות תאית. איור 4 מתאר את המקורות של שלוש חתימות ספקטרליות ברקע אלה. חשוב לציין כי אותות אלה מופצים באופן לא אחיד בתוך המדגם ולכן לא ניתן פשוט להחסיר. עם זאת, הוספת החתימות הספקטרליות של אותות אלה לספרייה הספקטרלית ושימוש בפירוק ליניארי כדי להפריד את האותות מציגה גישה להסרת אותות מבלבלים אלה מאותות התורם והמקבל לפני חישוב יעילות FRET. כדי להשיג זאת, שלוש החתימות הספקטרליות ברקע נוספו לספרייה הספקטרלית בת שלושת הרכיבים, ויצרו ספרייה חדשה בת 6 רכיבים המורכבת מתורם (טורקיז), מקבל (ונוס), DRAQ5 ושלוש חתימות ספקטרליות ברקע.

תסריט תכנות מותאם אישית נכתב כדי לבטל את העברת נתוני התמונה הספקטרליים ל- endmembers בודדים, ונכתב סקריפט נפרד כדי לבצע חישובי יעילות FRET הבאים. ביטול ספקטרלי ליניארי (מאויר באיור 5) בוצע באמצעות הספריה הספקטרלית בת 6 הרכיבים. ביטול ה- UNMIXing בוצע עבור כל פרוסה בערימת התמונה צירית, המכונה גם z-stack (עיין בהדמיה התלת-ממדית של נתוני תמונה ספקטרלית גולמית באיור 5A). התוצאה הייתה תמונות נפרדות לא מעורבות עבור כל סוף- office, עבור כל פרוסת z בערימת z (איור 5C-E, תמונות רקע לא מעורבות אינן מוצגות). אם תרצה, האותות הלא מעורבים עשויים להיות בצבע כוזב להדמיה עם צבע שונה שהוקצה לכל אות לא מעורב (איור 5F-H).

איור 6 ממחיש את השלבים המעורבים בחישובי היעילות של FRET, כמו גם את השלבים למיפוי יעילות FRET לרמות המחנה. תמונת יעילות FRET נוצרה באמצעות תמונות חלקות של תורמים ומקבלים לא מעורבים. תמונת מסכה בינארית התקבלה באמצעות תמונות לא מעורבות של תורמים, מקבלים ותמונות גרעיניות. המסכה הוחלה על תמונת היעילות FRET כדי להסיר תרומות מפיקסלים מחוץ לתא. למרות שתמונות לא מעורבות מפרוסות z בודדות שימשו להדגמה ציורית של מדידות יעילות FRET, חישובים אלה בוצעו על כל פרוסה בתוך מחסנית התמונה התלת-ממדית. ערכת נתוני התמונה התלת-ממדית FRET הוצמדה אז לשלושה מישורים אורתוגונליים כדי לדמיין שיפועים מרחביים של אותות המחנה בכיוונים שונים.

הדמיה של שינויים הנגרמים על-ידי אגוניסט ביעילות FRET וברמות המחנה
השלבים המתוארים לעיל מספקים שיטה לחישוב יעילות FRET ורמות המחנה מנתוני תמונה היפרספקטרליים בשלושה ממדים מרחביים. שלבים אלה יכולים להיות מיושמים על תכשירים הסלולר לפני ואחרי טיפול עם תרכובות המעוררות תגובת המחנה, כגון forskolin. כאן, אנו מספקים דוגמה לשימוש בגישה זו כדי לבחון שינויים ב- FRET והפצה המחנה ב- PMVECs בעקבות טיפול עם 50 μM forskolin. איור 7 ממחיש את השינויים ביעילות FRET וברמות המחנה בפרוסות מישור XY שונות (פרוסות z), החל מאפית ועד בסיס, ומאפשר השוואה בין תנאי הבסיס (לפני טיפול פורסקולין) ו-10 דקות לאחר הטיפול. בדוגמה המחשה זו, יעילות FRET ירדה (עמודות 1 ו-3 באיור 7) עם טיפול פורסקולין, בקורלציה לעלייה ברמות המחנה (עמודות 2 ו-4 באיור 7). נצפתה שונות מרחבית מינימלית של מפמפ בתוך מישור XY יחיד. עם זאת, נצפו שיפועים מרחביים של cAMP (apical-to-basal), כפי שניתן לשער על ידי ציון כי הפרוסה apical יש צבע אדום עמוק יותר (המציין רמות המחנה גבוהות יותר דרך טבלת בדיקת הצבע שהוחלה) מאשר פרוסת בזאלי לאחר טיפול forskolin (עמודה 4 באיור 7). לעתים קרובות ניתן לדמיין טוב יותר הפצות FRET אוamp ציריות באמצעות תמונות המתקבלות משני המישורים המרחביים האורתוגונליים: איור 8 מתאר את יעילות FRET ואת רמות המחנה במישור YZ בקו הבסיס (עמודות 1 ו -2) ו -10 דקות לאחר טיפול פורסקולין (עמודות 3 ו -4), ואילו איור משלים 2 מתאר את יעילות FRET ושינויים ברמת המחנה במישור XZ. תוצאות אלה ממחישות את ההיתכנות של מדידת FRET והערכת רמות המחנה מנתוני תמונה היפרספקטרליים תלת-ממדיים וגם מדגימות את החשיבות של הדמיית הפצות ציריות של FRET או cAMP. בעוד שמעבר להיקף הנייר המתודולוגי הזה, ייתכן כי הפצות מרחביות ציריות של נוקלאוטידים מחזוריים תורמות לספציפיות בתוך מסלולי איתות נוקלאוטידים מחזוריים.

בעת ביצוע השיטות שתוארו לעיל, חשוב לבדוק בקפדנות את דיוק השלבים ולהפעיל בקרות ניסוי ורכב מתאימות כדי להבטיח ששינויים ב- FRET (ובמערך המתאים) נובעים משינויים ממשיים באותות התורם והמקבל ואינם חפצים הדמיה. לדוגמה, שלבים חשובים שיש לקחת בחשבון כוללים:

שימוש בספרייה ספקטרלית מתאימה המכילה את כל הרכיבים הספקטרליים הדרושים
כאמור, יכולה להיות תרומה משמעותית של אותות רקע מפלואורסצנטיות תאית, מטריצה שהופקדה או אור משתקף מהכיסוי (דימום פליטת עירור). איור 9 מייצג ערכת נתונים לדוגמה הממחישה שאות הרקע נשמר בתוך התמונות כאשר נעשה שימוש בספרייה בת שלושה רכיבים (טורקיז, ונוס ו- DRAQ5) כדי לבטל את הנתונים הספקטרליים. לעומת זאת, אות הרקע הוסר ביעילות כאשר נעשה שימוש בספרייה ספקטרלית מלאה (ומתאימה יותר) של 6 רכיבים.

שימוש בערך סף אופטימלי ליצירת מסיכת תא
ברבים מהניסויים שביצענו, עוצמת אות הרקע היא כ-50-60% מעוצמת האות FRET הקיימת בנתוני התמונה הספקטרליים הגולמיים (כלומר, כאשר מדמים נתוני תמונה ספקטרליים לא מעובדים, שיאו של אות FRET גבוה פי 2 בלבד מזה של אות הרקע שמסביב). לפיכך, הפרדת אות רקע מאות חזית באמצעות ערך סף להשגת מסיכה בינארית היא צעד רגיש ויש לבצעה בקפידה על מנת להימנע מניתוח ממצאים. איור 10 ממחיש את ההשפעה של ערכי סף שונים שהוחלו על פילוח תאים כדי ליצור מסיכה בינארית של התא. ערך סף נמוך עשוי לכלול אות רקע כחלק מהתא המביע. מצד שני, ערך סף גבוה מדי עשוי למנוע מדידה של FRET בתאים או באזורים בעלי ביטוי נמוך של תא עם אות תורם + מקבל נמוך (חלקים דקים מאוד של התא או חלקים שעשויים להיות בעלי ריכוז אזורי נמוך יותר של הבדיקה FRET).

בחירת תא שהועבר באמצעות תורם+מעציב אות ≥ אות רקע
איור 11 מדגים ערכת נתונים לדוגמה שבה יעילות FRET ורמות תואמות נמדדו מתמונות לא מעורבות שהושגו באמצעות ספריה ספקטרלית בת 6 רכיבים עבור ביטול ספקטרליות ליניארי. למרות השימוש בספרייה בת 6 הרכיבים כדי לבטל את נתוני התמונה הספקטרליים ולבחור סף גבוה ליצירת גבול התא ומסכה גרעינית, תמונות יעילות FRET עדיין היו מועדות לאות רעשי רקע גבוה ליד הצד הבזלי של התא. במקרה זה, הנוכחות של רעשי רקע נבעה מבחירת תא שהביע רק חלש את הבדיקה FRET, וכוח האות התורם + מקבל היה שווה בערך לעוצמת האות ברקע, גם לאחר ביטול ה- FRE. לכן, בנוסף ליישום שלבי הניתוח המתוחכמים שתוארו לעיל, חשוב גם לבחור תא עם ביטוי מספיק של הבדיקה FRET ואות FRET מספיק בהתאמה (תורם וקום קבלה לפחות שווה או מעל אות הרעש) במהלך הרכישה על מנת להבטיח תוצאות באיכות גבוהה.

Figure 1
איור 1: תרשים זרימה המתאר את השלבים המעורבים ביעילות FRET ומדידות רמה בשלושה ממדים מרחביים באמצעות הדמיה וניתוח FRET היפרספקטרלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הדמיה תלת-ממדית של תא המבטא את כתב ה-FRET (ירוק) והגרעין מהתא ותאים שאינם מבטאים (אדום). נתוני תמונה ספקטרליים גולמיים שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ספקטרלי של ניקון A1R נצבעו באופן כוזב על פי אורך הגל ודמיינו ב-3 ממדים באמצעות תוכנת NIS Elements. A) נתוני תמונה תלת-ממדיים בקו הבסיס ו-B) 10 דקות לאחר טיפול פורסקולין 50 מיקרומטרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: בניית ספרייה ספקטרלית המכילה את הספקטרום הטהור של תוויות פלואורסצנטיות במחקר (המכונה endmembers על ידי שדה חישה מרחוק). A) תמונה בצבע כוזב של תאים המבטאים את הביו-סנסור FRET שנרכש ב- 405 ננומטר עירור (עירור תורמים). B) ספקטרום המתאים לאות FRET: 4 אזורים שונים של עניין (ROIs) צוירו בתמונה A המוצגת על ידי מלבנים אדומים, צהובים, כחולים וירוקים. העוצמה הממוצעת בכל אורך גל עבור כל ROI שנבחר יצאה. העוצמה הממוצעת מ-4 ההנפקים האלה הייתה משורטטת בכל אורך גל פליטה. שיאי הפליטה של הספקטרום תואמים הן את התורם (טורקיז) והן את הפלואורופורים המקובלים (ונוס). ג) תמונה בצבע כוזב של תאים המבטאים את הביו-סנסור FRET שנרכש ב- 488 ננומטר עירור (עירור מקובל). ד) הספקטרום הממוצע הוערך כפי שהוסבר ב- B ממספר ROIs ב- C (אותם אזורים כמו ב- A) עם שיא פליטה רק בשל הקבלה. E) תמונה בצבע כוזב של תאים המבטאים את הביו-סנסור FRET שנרכש ב-405 ננומטר עירור לאחר השמדת תמונות של הפלואורופור המקבל על ידי הקרנה של 514 ננומטר. ו) הספקטרום הממוצע הוערך כפי שהוסבר ב- B ממספר ROIs ב- E (אותם אזורים כמו A) עם שיא פליטה רק בגלל התורם. שים לב כי עוצמת התורם גדלה ב- F בהשוואה לאות FRET המקורי, מה שמצביע על כך שלאחר ההלבנה של המקבל, עירור התורם מוביל לפליטת תורמים ישירה. ז) ספקטרום הקבלה כצפוי אם הושג באמצעות עירור 405 ננומטר. זה הוערך על ידי ניצול העובדות כי לייזרי עירור 405 ננומטר ו 488 ננומטר יש תגובה ליניארית אשר ניתן לאפיין באמצעות ספקטרומטר וכדור משולב (איור משלים 1) ואת מקדם ההכחדה תלוי אורך הגל של ונוס. לפיכך, ספקטרום ונוס המתקבל ב 488 ננומטר עירור ניתן להמיר לספקטרום ונוס כי היה צפוי אם הושג ב 405 ננומטר עירור H) תמונה בצבע כוזב של תאים המסומנים עם התווית הגרעינית, DRAQ5. I) הספקטרום הממוצע מכמה אזורים של עניין ב- H. J) הספרייה הספקטרלית המתקבלת המכילה את הספקטרום הטהור מנורמל של התורם ו- DRAQ5 ואת הספקטרום המתוקן אורך הגל של המקבל. שימו לב שספקטרום טורקיז ונוגה נוטרל לערך המרבי של נתונים ספקטרליים משולבים של טורקיז + ונוס, בעוד ש-DRAQ5 פשוט נרמל לאחדות בערך אורך הגל של פליטת השיא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: חתימות ספקטרליות ברקע זוהו ונכללו בספרייה הספקטרלית כדי להסביר אותות פלואורסצנטיות ברקע במהלך תהליך ביטול המיקסים. A, B) שתי חתימות ספקטרליות פלואורסצנטיות ברקע נצפו בעת אפיון דגימה ריקה (כיסוי ללא תווית). חתימות ספקטרליות אלה נקראו על סמך אורכי הגל השיא שלהם - אחד ב 424 ננומטר (מפלורסצנטיות כיסוי) והשני ב 504 ננומטר (ככל הנראה מחזיר או פיזור גב). ג) חתימה ספקטרלית רקע שלישי נצפתה עם אורך גל פליטה שיא של 574 ננומטר כאשר תאים שאינם מסומנים נותחו, פוטנציאל מ autofluorescence הסלולר או פלואורסצנטיות של המטריצה הבסיסית. D) ספקטרום רקע שחולץ מתמונות A, B ו- C. שלוש ספקטרום רקע אלה נוספו לספרייה הקיימת בת 3 הרכיבים(איור 3J)כדי לפתח ספריה ספקטרלית בת 6 רכיבים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ביטול ספקטרלי ליניארי באמצעות ספריה ספקטרלית בת 6 רכיבים המהווה אותות רקע. A) נתוני תמונה ספקטרליים גולמיים שנרכשו כערימת z צירית. B) ספריה ספקטרלית בת 6 רכיבים המשמשת לנתונים ספקטרליים גולמיים לא-מיקס. C, D ו- E) תמונות לא מעורבות בקנה מידה אפור של DRAQ5, טורקיז ונוגה, בהתאמה, נבעו מאי-רמיקס ספקטרלי ליניארי. F, G ו- H) תמונות לא מעורבות בצבעים מזויפים של DRAQ5, טורקיז ונוגה בהתאמה. כמו כן חושבו תמונות לא מעורבות של אותות רקע (נתונים שאינם מוצגים כאן מכיוון שרק תוויות הפלואורסצנטיות מעניינות מתודולוגיה זו – עיין באיור 4 באנמדבולה ואח' לדוגמאות של אותות רקע לא מעורבים25). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תרשים זרימה המתאר את השלבים הכרוכים בחישוב רמות FRET ו- cAMP מנתוני תמונה ספקטרליים לא מעורבים. א) ייצוג תמונה לא מעורבת של תורם, טורקיז. ב) תמונה לא מעורבת של מקבל, ונוס. ג) תמונה לא מעורבת מייצגת של גרעינים, DRAQ5. D) מסיכת תא בינארי נוצרת על-ידי הוספת סף לתמונה מסוכמת של תורם+מקבל לא מעורב. ה) סף מוחל על התמונה הגרעינית כדי ליצור מסכה בינארית של הגרעין. ו) יעילות FRET החכמה של הפיקסל חושבה מתמונות תורמות ומקבלות לא מעורבות. ז) מסכה בינארית מורכבת נוצרה מגבול התא ומסכות גרעיניות. H) תמונת יעילות FRET עם מסיכה: מסיכת תא משולב הוחלה על תמונת יעילות FRET כדי לא לכלול אותות FRET לא ספציפיים מחוץ לתא ובתוך הגרעין. I) מפת צבעים הוחלה על תמונת היעילות FRET במסכה כדי לדמיין טוב יותר שינויים מרחביים ב- FRET. J) תמונת רמות המחנה שהוערכה מתמונת היעילות FRET. K) מפת צבעים הוחלה כדי לדמיין טוב יותר שינויים מרחביים ב- cAMP. סרגלי הצבע המוצגים בצד ימין שימשו להדמיה של יעילות FRET (החלונית העליונה) ורמות המחנה (החלונית התחתונה). התמונות המוצגות באיור זה מייצגות פרוסת z צירית אחת, אך פעולת הניתוח המתוארת באיור זה מבוצעת על ערימת z צירית כולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: יעילות FRET הנגרמת על-ידי Forskolin ומעברי צבע מרחביים מחוכמים המומחזים ב-PMVECs. תמונות מישור XY נוצרו על-ידי שחזור נתוני FRET ותמונה מחוחזרת תלת-ממדית בכיוון צירי (Z) מהאפיקלי לצד הבזלי של התא. חמש פרוסות XY רציפות מוצגות. עמודות 1 ו-3 מייצגות את יעילות FRET בקו הבסיס ו-10 דקות לאחר הטיפול ב-50 μM forskolin, בהתאמה. עמודות 2 ו-4 מציינות את הרמות בקו הבסיס ו-10 דקות לאחר טיפול פורסקולין. סרגלי הצבע שימשו ליחס שינויים במפת הצבעים ליעילות FRET (למעלה) ורמות המחנה (למטה). קווים לבנים המוצגים בתמונות בעמודה 2 ובעמודה 4 משמשים ליצירת פרופיל העוצמה (פרופיל סריקת קו) של אותות המחנה לאורך קו נבחר זה. התוויית פרופיל עוצמה המתקבלת מהחלק האמצעי של התא בקו הבסיס (פרופיל כחול) ולאחר טיפול פורסקולין (פרופיל ירוק) מדגימה את ההתפלגות המרחבית של אותות המחנה לאורך סריקת הקו. סרגל קנה המידה מציין 20 מיקרומטר. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: יעילות FRET הנגרמת על-ידי Forskolin ומעברי צבע מרחביים מחוכמים המודגמים בכיוון צירי. תמונות מישור YZ נוצרו על-ידי שחזור נתוני FRET ותמונה מחוחזרת תלת-ממדית בכיוון לרוחב (X) (משמאל לצד ימין של התא). עמודות 1 ו-3 מייצגות את יעילות FRET בקו הבסיס וב-10 דקות לאחר טיפול פורסקולין 50 מיקרומטר, בהתאמה. עמודות 2 ו-4 מייצגות את רמות המחנה בקו הבסיס וב-10 דקות לאחר טיפול פורסקולין. סרגלי הצבעים מימין שימשו ליחס שינויים במפת הצבעים ליעילות FRET (למעלה) ולרמת המחנה (למטה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: השוואה של האפקטיביות של שימוש בספריה ספקטרלית בעלת שלושה רכיבים או 6 רכיבים לחישוב תמונות רמות FRET ו- cAMP. אותות רקע לא-מדעיים נצפו בתמונות שחושבו באמצעות ספריה בת שלושה רכיבים, שלא היוו בחשבון חתימות ספקטרליות ברקע. זה היה נכון במיוחד עבור תמונות ליד הצד הבזל של התא בעקבות טיפול 50 μM forskolin (עמודה 2). לעומת זאת, ממצאי אותות רקע הוסרו ביעילות בעת שימוש בספרייה בת 6 רכיבים שכללה חתימות ספקטרליות ברקע, ושיפרו את היכולת לפלח את התא ולנתח אותות FRET ו- cAMP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 10
איור 10: ניתן להציג ממצאי ניתוח תמונה אם לא נבחר ערך סף מתאים כדי לתוות את התא ואת הגבולות הגרעיניים. תמונות תורמים ומקבלים לא מעורבות שימשו ליצירת מסיכה עם שלושה ערכי סף שונים: 0.35 (עמודות 1 כ-2), 0.65 (עמודות 3 ו- 4) ו- 0.9 (עמודות 5 ו- 6). עמודות 1, 3 ו- 5 מציגות את יעילות FRET בקו הבסיס. עמודות 2, 4 ו- 6 מציגות את יעילות FRET ב- 10 דקות לאחר טיפול פורסקולין 50 מיקרומטר. בחירת סף נמוך מדי הביאה לכך שחלקים מהרקע, או האזור החוץ-תאי, נכללו בתא לניתוח, תוך בחירת סף גבוה מדי הביאה לאובדן חלק מהתא (ראה הפרוסה האפאית בעמודות 4-5 בהשוואה לעמודות 3-4). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 11
איור 11: ממצאי אותות הרקע עדיין עשויים להימשך גם לאחר ביטול הרקע ובחירת סף מתאים במהלך יצירת מסיכה בינארית. עמודה 1 מציגה פרוסות apical, אמצע ובזל מייצגות בקו הבסיס ועמודה 2 מציגה את אותו הדבר ב- 10 דקות לאחר טיפול 50 μM forskolin. למרות שימוש בספרייה בת 6 רכיבים עבור ביטול המימוש שהיוותה אותות רקע וניצול סף גבוה יותר של 0.85 ליצירת מסכה בינארית, אזורי רקע עדיין זוהו כחלק מהתא, במיוחד לאחר טיפול ב- forskolin. במקרה כזה, הסבר אפשרי עשוי להיות שתא עם ביטוי חלש של כתב FRET נבחר להדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 1 משלים: מדידות של עוצמת קו הלייזר כפונקציה של הגדרת לייזר בתוכנה. ספקטרומטר מצמיד סיבים וספירה משולבת כוילו למנורה הניתנת למעקב NIST כדי למדוד את עוצמת הלייזר הן עבור קו הלייזר 405 ננומטר והן עבור קו הלייזר 488 ננומטר. A) המספר הכולל של פוטונים הנמדדים בשלב המיקרוסקופ המתאימים לעוצמות לייזר שונות של לייזר 405 ננומטר. B) המספר הכולל של פוטונים הנמדדים בשלב המיקרוסקופ המתאימים לעוצמות לייזר שונות של לייזר 488 ננומטר. תגובה ליניארית בעוצמת הלייזר נצפתה עבור שני הלייזרים כפי שנמדדו בשלב המיקרוסקופ. קו מגמה ליניארי התאים ומשוואת קו המגמה עבור כל קו לייזר שימשה לחישוב ספקטרום הקבלה שהיה צפוי אם יתרגש מקו הלייזר 405nm (עירור תורם). אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור 2 משלים: יעילות FRET הנגרמת על-ידי Forskolin ומעברי צבע מרחביים של המחנה, המומחזים בכיוון צירי. תמונות מישור XZ נוצרו על-ידי שחזור נתוני FRET ותמונה מחוחזרת תלת-ממדית בכיוון לרוחב (Y) (מלפנים לחלק האחורי של התא). עמודות 1 ו-3 מייצגות את יעילות FRET בקו הבסיס וב-10 דקות לאחר טיפול פורסקולין 50 מיקרומטר, בהתאמה. עמודות 2 ו-4 מייצגות את רמות המחנה בקו הבסיס וב-10 דקות לאחר טיפול פורסקולין. סרגלי הצבעים מימין שימשו ליחס שינויים במפת הצבעים ליעילות FRET (למעלה) ורמות המחנה (למטה). בדומה לתוצאות המוצגות עבור מישורי YZ (איור 8), שיפועים מרחביים אפיים עד בסיסיים ביעילות FRET ורמות המחנה עשויים להיות מוצגים כשינויים בצבע מלמעלה למטה של פרוסת YZ אחת, הן בתנאי הבסיס (כל פרוסה נתונה בעמודות 1-2) והן לאחר טיפול פורסקולין 50 מיקרומטרי (עמודות 3-4). אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

קבצים משלימים. נא לחץ כאן כדי להוריד קבצים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפיתוח של BIOSENSors FRET אפשר מדידה והדמיה של אותות נוקלאוטיד מחזורי בתאים בודדים, ויש הבטחה גדולה לדמיין אירועי איתות תת תאיים13,22,37,38. עם זאת, השימוש בביו-סנסורים FRET מציג מספר מגבלות, כולל מאפייני אות לרעש נמוכים של כתבי FRET מבוססי חלבון פלואורסצנטיים רבים ויעילות ההדבקה החלשה או הביטוי של כתבי FRET (זה עשוי להיות מאתגר במיוחד בשורות תאים מסוימים, כגון PMVECs)23,24. הדמיה של חלבונים פלואורסצנטיים בעלי השפעה חלשה, בשילוב עם חישובי FRET רצטריים, גורמת לעתים קרובות במידה גבוהה של אי ודאות או תנודה ביעילות FRET המחושבת. במאמץ לשפר את האמינות של מדידות FRET, אנחנו ואחרים הדגמנו בעבר את השימוש בהדמיה וניתוח היפרספקטרליים כדי למדוד אותות FRET ולהפחית אותות צולבים או לדמם באמצעות אותות פלואורסצנטיים בין תוויות פלואורסצנטיות ואפקטים של פלואורסצנטיות26,31,32,39. בשל מגבלות בעוצמת האות, מחקרי FRET ספקטרליים אלה הוגבלו לשני ממדים מרחביים (X ו- Y) עד לאחרונה. לפיכך, הם סיפקו תצוגה של פרוסה אחת של שינויי FRET בתוך תא.

במחקרים שנערכו לאחרונה, ציינו כי FRET (ורמות המחנה המקבילות) נראה מופץ מרחבי לא רק במישור XY, אלא גם על פני מטוסי XZ ו- YZ25. גישת הדמיית FRET היפרספקטרלית המתוארת כאן מרחיבה את היכולת שלנו לדמיין ולמדוד FRET ונוקלאוטיד מחזורי (cAMP) משתנה לשלושה ממדים מרחביים, ופותחת אפשרויות חדשות להערכת מידור אותות. גישה זו של הדמיה וניתוח היפרספקטרלית 4-ממדית (X, Y, Z ו- λ) מאפשרת מדידה והדמיה של מעברי צבע של המחנה בשלושה ממדים מרחביים תוך התחשבות באותות רקע לא אחידים. כאן, הדגמנו כיצד ליישם גישה זו באמצעות הדוגמה של שיפועים מרחביים של מפמפ הנגרמים על ידי forskolin. בנתוני התמונה שלאחר הטיפול ניתן לראות מעברי צבע מרחביים של המחנה מהצד האפאלי ועד לצד הבזלי של התא (איור 7 ואיור 8). נראה כי המחנה שהופק עם הטיפול ב-forskolin לא הגיע לצמתים של תאיים(איור 7 ואיור 8).

בניצול המתודולוגיה המתוארת כאן, היה חשוב לקחת בחשבון מקורות שונים של אותות רקע ו autofluorescence כדי לאפשר הערכה מדויקת של יעילות FRET. פירוק ליניארי מספק שדרה פוטנציאלית לחשבון ספקטרום רקע ייחודי, אם החתימות שלהם שונות מהבדיונים הפלואורסצנטיים של עניין. בפרט, פירוק ליניארי מתאים יותר להפרדת אותות רקע ופלואורסצנטיות אוטומטית מאשר חיסור רקע סטנדרטי. 40,41,42 בדוגמה המוצגת כאן, שלוש חתימות ספקטרליות שונות נמדדו והוקצה שם המבוסס על אורך הגל של פליטת השיא של החתימה: ספקטרום הרקע של 424 ננומטר (אולי מהפלואורסצנטיות של כיסויי השער), ספקטרום הרקע של 504 ננומטר (ככל הנראה בשל אור משתקף או מפוזר לאחור), וספקטרום הרקע של 574 ננומטר (אולי בגלל פלואורסצנטיות אוטומטית של תאים או מטריקס סלולריים). כדי להמחיש את ההשפעות של אי-התחשבות בחתימות אלה, נוצרו שתי ספריות ספקטרליות ותמונות לא מעורבות בהשוואה. ראשית, ספרייה ספקטרלית המכילה רק את התוויות הפלואורסצנטיות במדגם, טורקיז, ונוס ו- DRAQ5, נוצרה ותיוגה בספרייה בעלת 3 הרכיבים. שנית, ספריה ספקטרלית שהכילה בנוסף את שלוש החתימות הספקטרליות ברקע נוצרה ותיוגה בספרייה בת 6 הרכיבים. כפי שמוצג לעיל, ביטול ממשק בספרייה בת 6 הרכיבים (ביטול רקע) אפשר הסרה של אותות רקע, בעוד שההתנתקות מהספרייה בת 3 הרכיבים לא(איור 9). בעבודה הקודמת, הראינו כי הממוצע השורש שגיאה בריבוע (RMSE) הקשורה unmixing ליניארי הוא מופחת בעת שימוש בספריה ספקטרלית המהווה חשבון הן תוויות פלואורסצנטי וחתימות רקע. יש לציין כי ההתפלגות צירית של פלואורסצנטיות רקע היא לעתים קרובות לא אחידה ולכן, חיסור רקע פשוט לא יפעל כדי לתקן את נתוני התמונה. לכן, הגישה ספקטרלית unmixing נדרש כדי לספק הסרת רקע מדויקת ומדידות FRET אמין.

חשוב למטב את פרמטרי המערכת כדי לבחור את הגדרות המערכת והמצלמה הטובות ביותר האפשריות בעת רכישת תמונות ספקטרליות. המטרה הכוללת צריכה להיות למטב את SNR תוך מזעור זמן הרכישה ומניעת הלבנת תמונות. 43 לכן, בעת אופטימיזציה של מערכת הדמיה, יש צורך לעתים קרובות בפשרה בין רזולוציות מרחביות, זמניות וספקטרליות. במחקרים אלה נבחרו ערכים אופטימליים עבור הגדרות המערכת והמצלמה, כולל גודל חור הסיכה, עוצמת הלייזר, מהירות הסריקה, גודל הסריקה וממוצע המסגרת כמתואר בסעיף הפרוטוקול. תוך שימוש בהגדרות אלה, הדגימה המרחבית של 80 ננומטר/פיקסל, דגימה זמנית של ~ 3 דקות לכל מחסנית z ספקטרלית (~ 10 שניות / תמונת XY) ודגימה ספקטרלית של מרווח זמן של 10 ננומטר מושגת עם הקרנת תמונות זניחה או מינימלית.

כדי להבטיח הערכות מדויקות של יעילות FRET, יש צורך למדוד ספקטרום התורם והמקבל כפי שהם צפויים עם 1:1 סטוכיומטריה ואורכי גל עירור זהים(איור 3). הספקטרום הטורקיז ונוגה נרמלו ביחס לאורך הגל של פליטת הטורקיז. יעילות FRET שהוערכה באמצעות ספריה ספקטרלית זו הפיקה ערכים דומים לאלה שדווחו בספרות12,22. בדרך כלל, ספקטרום סוף-חברים בספריה מנורמל לאחדות. עם זאת, כדי לחשב במדויק את יעילות FRET, יש לרכוש את ספקטרום הקבלה ביחס לספקטרום התורמים (כלומר, בריכוז שווימולרי או 1:1 סטויצ'יומטריה ולהתייחס לאותו אורך גל עירור). בנוסף לשימוש בספרייה שנבנתה כראוי, מספר שלבים מעורבים בהערכה מתאימה של יעילות FRET והימנעות מממצאי ניתוח. אלה כוללים בחירת תא ביטוי עם עוצמת אות נאותה (איור 11),החלקה של תמונות לא מעורבות לפני הערכת יעילות FRET (טשטוש גאוסי הוחל בדוגמה זו), שימוש בערך סף מתאים ליצירת המסכה (איור 10) והערכה של גורם תיקון באמצעות מקדמי הכחדה של תורם ומקבל (ספריית File_Spectral משלימה). כאשר שלבים אלה מתבצעים, ניתן לדמיין במדויק הפצות תלת-ממדיות של יעילות FRET ורמות המחנה הבסיסיות בתאים בודדים.

אותות המחנה המותאמים לשפות מקומיות הוערכו בממדים מרחביים באמצעות ביו-סנסורים ממוקדים FRET13,37. עם זאת, מיקוד בדיקות FRET לתאים תת-תאיים ספציפיים (לדוגמה, קרום פלזמה או רפסודות שומנים) בדרך כלל גורם לריכוז מקומי מוגבר של בדיקה. זה עלול לגרום לממצאי מדידה שהוצגו עקב FRET בין-מולקולרי או דו-מולקולרי. בנוסף, התוצאות המוצגות כאן ובאנמדוולה et.al., 2018, Cytometry A25 ממחישות את החשיבות של מדידות תלת ממדיות של FRET מגשושיות מסיסות או ממוקדות.

למרות החשיבות של מדידת אותות המחנה בשלושה ממדים מרחביים, יש גם מגבלות לגישה זו. המגבלה המגבילה ביותר היא זמני הרכישה הארוכים הנדרשים – כ-3 דקות לכל ערימת z ספקטרלית. קצב רכישה זה מונע שימוש בגישה זו לאיתור כל דבר אחר מאשר מעין - התפלגות מחנה מצב יציב בתאים. עם זאת, התוצאות שהוצגו ממחישות את החשיבות של הכללת מעין - מדידות 3-ממדיות יציבות (x, Y, z) כמשלים קריטי למדידות דו-ממדיות סטנדרטיות (x, y). בעתיד יהיה מעניין לשלב חלבונים מסומנים ומבנים תאיים בעיצוב הניסיוני. בחירה זהירה של פלואורופורים המשמשים לסימון חלבונים (ו/או מבנים) תאפשר הערכה של ההפצות התלת-ממדיות של החלבונים המסומנים ו- FRET ללא אובדן נוסף של מהירות הרכישה. זה בתורו יאפשר מדידה של אותות המחנה המקומי אותות המחנה ליד החלבונים המסומנים בשלושה ממדים מרחביים, ובכך מציע השלמה ניסיונית חשובה לבדיקות מחנה ממוקדות ומרחיב עוד יותר את התועלת של מדידות hyperspectral של הפצות חותם תלת מימדי בתאים חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ד"ר לייסלי וריץ' חושפים עניין פיננסי בחברת סטארט-אפ, SpectraCyte, LLC, שהוקמה כדי למסחר טכנולוגיות הדמיה ספקטרליות. עם זאת, כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה נערכו באמצעות מוצרים זמינים מסחרית שאינם משויכים ל- SpectraCyte, LLC.

Acknowledgments

המחברים רוצים להכיר ד"ר קס Jalink (המכון לסרטן הולנד ומרכז ואן Leeuwenhoek למיקרוסקופיה מתקדמת, אמסטרדם, הולנד) על כך שסיפק לנו את H188 cAMP FRET biosensor וקני טרינה (המכללה להנדסה, אוניברסיטת דרום אלבמה) על עזרה טכנית בהפחתת הזמן שנדרש כדי להפעיל את תסריטי התכנות המפותחים בהתאמה אישית שלנו.

המחברים רוצים להכיר במקורות המימון: איגוד הלב האמריקאי (16PRE27130004), הקרן הלאומית למדע; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attofluor Cell Chamber Invitrogen A7816 Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100 Solvent used to prepare stock solution forskolin.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution Thermo Scientific 62252 Nuclear label
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F6178 Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM
Forskolin Sigma F3917 Adenyly cyclase activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensor Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink Gift Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.
Image J image.net Free download Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).
Laminin Mouse Protein, Natural Invitrogen 23017-015 Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit Invitrogen L3000-015 Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor
MATLAB Mathworks R2019a Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment
Nikon A1R confocal microscope Nikon Instruments Nikon A1R Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Software dongle used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
PBS pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 coomonly used buffer suring cell culture
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama Isolated from Rat pulmonary microvasculature PMVECs form inner lining of a blood vessel.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122 antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides Clay Adams 3010 Microscope slides used for cell fixation
ProLong Diamond Antifade Mounting Media Invitrogen P36961 If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral response of the light source (?)
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056 Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.
Tyrodes Buffer Made in-house Made in-house Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.
6 Well Cell Culture Plate Corning 3506 Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.
25 mm Round Microscope Cover Slips Fisher Scientific 12545102 Cells were grown on round glass coverslips
60X Ojective Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 water immersion and commonly used objective for cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
  2. Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
  3. Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
  4. Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
  5. Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
  6. Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
  7. Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
  8. Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
  9. Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
  10. Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
  11. Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
  12. Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
  13. Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031 (2017).
  14. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
  15. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science's STKE. 2006, (2006).
  16. Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
  17. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
  18. Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).
  19. Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
  20. Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
  21. Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
  22. Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).
  23. Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
  24. Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
  25. Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  26. Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
  27. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
  28. Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
  29. Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
  30. Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
  31. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
  32. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
  33. Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586 (2017).
  34. Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).
  35. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
  36. Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
  37. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).
  38. Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
  39. Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
  40. Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).
  41. Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
  42. West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453 (2017).
  43. Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, Basel. 9267-9293 (2013).

Tags

ביולוגיה גיליון 164 AMP מחזורי מרחבי FRET היפרספקטרלי מיקרוסקופיה FRET ספקטרלי
מדידה של הפצות לחות תלת-ממדיות בתאים חיים באמצעות הדמיה וניתוח FRET היפרספקטרליים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, … More

Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, H., Griswold, J. R., Britain, A. L., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and λ) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis. J. Vis. Exp. (164), e61720, doi:10.3791/61720 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter