Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kapillärelektrofores masspektrometri metoder för karakterisering av protein och metabolit korona förvärvas av nanomaterial

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61760
Automatic Translation
*1, *2, *3, 4, 1, 2, 3
1School of Geography Earth and Environmental Sciences, University of Birmingham, 2Biomedical Microscale Analytics, Leiden University, 3Institute of Medical Biochemistry, Medical University of Innsbruck, 4AB Sciex UK Ltd
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att karakterisera den kompletta biomolekylära koronan, proteiner och metaboliter, förvärvade av nanomaterial från biofluider med hjälp av en kapillärelektrofores - masspektrometrimetod.

Abstract

Adsorptionen av biomolekyler från omgivande biologiska matriser till ytan av nanomaterial (NMs) för att bilda corona har varit av intresse under det senaste decenniet. Intresset för bionanogränssnittet beror på att den biomolekylära koronan ger NMs en biologisk identitet och därmed får kroppen att identifiera dem som "jag". Tidigare studier har till exempel visat att proteinerna i koronan kan interagera med membranreceptorer för att påverka cellulärt upptag och konstaterat att koronan är ansvarig för cellulär handel med NMs och deras eventuella toxicitet. Hittills har de flesta forskning fokuserat på proteinet corona och förbisett de möjliga effekterna av de metaboliter som ingår i koronan eller synergistiska effekter mellan komponenter i den kompletta biomolekylära koronan. Som sådan visar detta arbete metoder för att karakterisera både protein- och metabolitkomponenterna i den biomolekylära koronan med hjälp av bottom-up proteomik och metabolomik närmar sig parallellt. Detta inkluderar en partikelsammanfattning av proteinet corona med ett tensid som används för att öka proteinåtervinningen och en passiv karakterisering av metaboliten koronan genom att analysera metabolitmatriser före och efter NM-exponeringar. Detta arbete introducerar kapillärelektrofores – masspektrometri (CESI-MS) som en ny teknik för NM-koronarkarakterisering. De protokoll som beskrivs här visar hur CESI-MS kan användas för tillförlitlig karakterisering av både proteinet och metaboliten corona som förvärvats av NMs. Flytten till CESI-MS minskar kraftigt den mängd prov som krävs (jämfört med traditionell vätskekromatografi – masspektrometri (LC-MS) med flera injektioner möjliga från så lite som 5 μL prov, vilket gör det idealiskt för volymbegränsade prover. Dessutom minskas analysernas miljökonsekvenser med avseende på LC-MS på grund av de låga flödeshastigheterna (<20 nL/min) i CESI-MS och användningen av vattenhaltiga elektrolyter som eliminerar behovet av organiska lösningsmedel.

Introduction

Bionanointeraktioner, i gränslandet mellan nanomaterial (NM) ytor och biologiska matriser från vilka biomolekyler adsorberar till NM, är ett intensivt forskningsområde som ligger till grund för nanosäkerhet och nanomedicin1. Detta lager av adsorberade biomolekyler ger NMs en biologisk identitet, vilket innebär att celler identifierar dem som "jag", vilket senare påverkar cellulärt upptag, distribution och biologiska slutpunkter2,3,4. De allra flesta bionanostudier har fokuserat på proteinerna i koronan och har visat att proteinerna varierar kvantitativt och kvalitativt mellan NMs av olikasammansättningar 5. Denna variation är beroende av både nm:s egenskaper, såsom storlek, funktionalisering och material utöver egenskaperna hos den biologiska matrisen inklusive komposition och saltinnehåll5. Ett växande intresseområde för bionanogränssnittet är de metaboliter som adsorberas till NMs6. Flera studier har visat att NM-egenskaper, som med proteinerna, är en nyckelfaktor för att bestämma sammansättningen av metaboliterna i koronan och att de kan påverka biologiska resultat avNM-exponering 6,7,8.

I studier av den biomolekylära koronan finns det fyra distinkta faser till dess karakterisering, koronabildning, isoleringen av biomolekylerna i koronan, deras upptäckt via kvalitativ eller kvantitativ masspektrometri och identifiering9. Hittills har en rad tekniker antagits för att isolera proteinet corona inklusive kokning i SDS-PAGE löpande buffert, lösningsmedel och saltextraktion eller direkt matsmältning av proteiner på plats på ytan av NMs. När det gäller metaboliterna i koronan är isoleringen mer komplex med olika metoder med lösningsmedel eller till och med upplösningen av de NMs som föreslås somlösningar 8,10,11. Men till skillnad från proteinet corona är det osannolikt att en "en storlek passar alla" -metoden kommer att tillämpas på isolering av metaboliter från NMs, på grund av det breda kemiska utrymmet som upptas av metabolomen och mångfalden av möjliga NMs. Ett alternativt tillvägagångssätt är att karakterisera den biologiska matrisen före och efter NM-exponeringen med skillnaden i metabolitkoncentrationer som tillskrivs adsorptionen av metaboliter till NMs.

Detta alternativa tillvägagångssätt skulle vara tillämpligt på alla biofluider och NMs och även om det kräver dubbelt så mycket analys, erbjuder det följaktligen ett mycket mer exakt mått på metaboliten korona och har ingen risk för att låga metaboliter återhämtar sig från NM-ytan misstas för låg bindning av den specifika metaboliten.

Det andra steget i den biomolekylära coronaanalysen är upptäckten av biomolekylerna. Traditionellt för proteinerna i koronan har detta varit ett ansvarsområde för nano-LC-MS, proteomikens arbetshäst; Andra tillvägagångssätt som NMR13,1D och 2D SDS-PAGE har också tillämpats. När det gäller metaboliten koronar LC-MS7,GC-MS8 och direkt infusion massa spektrometri har använts14. Ett nytt tillvägagångssätt har dock nyligen börjat få dragkraft, nämligen kapillärelektrometri-masspektrometri (CE-MS)11,15 och har funnits i NM-laboratorier som en fristående teknik för att karakterisera olika fysiska och kemiska egenskaper hos NMs16. CE-MS är en orthogonal separationsteknik till nanoLC-MS och GC-MS och kan möjliggöra detektering av högpolära och laddade metaboliter17,18. Dessutom är CE-MS väl lämpad för analys av proteiner och deras posttranslational modifieringar såsom fosforylering och glykosylering19,20,21,22. Det sista steget, identifiering och dataanalys kan utföras på flera sätt beroende på om en kvantitativ / kvalitativ eller riktad / obelaget metod används, detta faller dock utanför detta protokolls ansvarsområde.

CESI-MS, en kombination av CE och ett nanoESI-gränssnitt, är ett nytt framsteg inom CE-teknik som använder ett mantningslöst gränssnitt. Detta möjliggör direktanslutning av ultralågflödes-CE (<20 nL/min) till en högupplöst masspektrometer utan utspädning, vilket resulterar i avsevärt förbättrad detektionskänslighet23,24,25. CESI-MS gör det möjligt att analysera volymbegränsade prover (< 10 μL) samtidigt som en mycket känslig analys26 bibehålls. CESI-MS jämför också positivt med traditionella nanoLC-MS-metoder med lågt flöde som används inom proteomik och metabolomik när det gäller reproducerbarhet27,28,genomströmning och överföring vilket gör det till en spännande utsikt för den kompletta biomolekylära coronakarakteriseringen.

För att belysa CESI-MS:s potential för analyser av bionanointeraktioner beskriver detta arbete det provpreparat som krävs för att isolera NM biomolekylär korona från ett enda humant plasmaprov på ett sådant sätt att data maximeras från både protein- och metabolitaspekterna av den fullständiga biomolekylära NM-koronan. Medan vi rapporterar om användningen av human plasma, detta protokoll skulle vara lika lämpligt för andra biofluider såsom blodserum, komplett cellkultur medium, cell lysat, ryggmärgsvätska eller urin. Analyserna av dessa två komponenter (proteiner och metaboliter) kommer sedan att beskrivas med neutralbelagda CESI-kapillärer för proteinet korona och kala smälta kiseldioxid kapillärer för både katjoniska och anjoniska metaboliter.

Protocol

Användning av human biofluid godkändes enligt IRB-protokollriktlinjerna från University of Leiden och Innsbruck Medical University. När biofluider från människor eller djur undersöks krävs etiskt godkännande från forskningsinstitutionen och har erhållits om resultaten framgår av detta protokoll. Dessutom bör lämplig rapportering också utföras för att säkerställa insyn och återanvändbarhet av uppgifter i framtida arbete9,29,30.

1. Beredning av bakgrundselektrolyter (BGE)

OBS: Alla lösningsmedel ska beredas i en lämplig rökhuva och lämplig personlig skyddsutrustning måste användas för alla steg (labcoat, handskar och skyddsglasögon). I varje steg krävs lågbindande plastflaskor för att minimera antåförlust och kontaminering av prov med salter som utlakats från glas.

  1. Förbered 10% ättiksyra BGE (v/v), pH 2.2 dagligen för metabolomik.
    1. Tillsätt 1 ml ättiksyra i en 10 ml mätkolv, följt av tillsats av avjoniserat (DI) vatten till den markerade linjen och noggrann blandning.
  2. Förbered 100 mM ättiksyra, pH 2,9 dagligen för proteomik.
    1. Tillsätt 57 μL ättiksyra i en volymetrisk kolv på 10 ml, följt av tillsats av DI-vatten till den markerade linjen och noggrann blandning.

2. NM-förberedelse

  1. Sprid NMs kraftigt i vatten med hjälp av publicerade riktlinjer31,32,33.
    OBS: I utvecklingen av detta protokoll användes 7 NMs enligt följande: 100 och 1,000 nm karboxylerad polystyren användes för protein och metabolit corona, respektive. 100 nm omodifierade polystyren NMs, 13 nm anatas TiO2 NMs som var oförändrade eller belagda med antingen polyakrylat eller PVP polymerer och 22 nm omodifierade SiO2 NMs användes för både protein och metabolit koronor. Metoden utvecklades och demonstrerades med hjälp av dessa NMs, men det bör noteras att detta tillvägagångssätt skulle tillämpas för ett brett spektrum av NM-kompositioner, storlekar, former och morfologier.
  2. Karakterisera partikelstorleken med antingen dynamiskt ljusspridning34,35, en partikel induktivt kopplade plasmamasspektrometri36, nanopartikelspårningsanalys37, eller transmissionselektronmikroskopi och ytladdning som zetapotential med hjälp av en zeta sizer34.

3. Biomolekylär coronabildning

  1. Dela 2 ml human plasma (eller biofluidval) i 1 ml alikvoter, en för metabolit- och proteinnatron och den andra för plasmametabolomkarakterisering.
  2. Inkubera 1 mg/ml NMs i humanplasma i 1 timme vid 37 °C samtidigt som du försiktigt blandar vid 500 varv/min i en termomixer. Efter inkubation centrifug provet vid 4 000 x g i 15 min vid 4 °C för att pelleta NMs.
  3. Samla plasma supernatant för metabolit corona analys. Behåll NM-protein coronakomplexet för protein corona karakterisering.

4. Protein corona isolering

  1. Återanvänd NM-proteinkomplexet (pelleten) i 1 ml 10x PBS-buffert och virvel kraftigt i 2 minuter för att avlägsna obundna proteiner. Centrifugera PBS-lösningen vid 4 000 x g i 15 min vid 4 °C för att pelleta NMs och ta försiktigt bort supernaten utan att störa pelleten.
  2. Återanvänd pelleten i 1 ml ammoniumbikarbonatbuffert (ABC) (100 mM, pH 8,0) och virvel kraftigt i 2 minuter för att avlägsna obundna proteiner och oönskade salter. Centrifugera vid 4 000 x g i 15 min vid 4 °C för att pelleta NMs. ta bort och kassera supernaten. Upprepa det här steget.
  3. Minska proteindisulfidbindningarna genom att lösa upp NM-proteinpelleten i 20 μL ABC-buffert (100 mM pH 8) som innehåller 10 mM dithiotheritol. Inkubera reduktionslösningen i 30 min vid 56 °C.
  4. För att smälta proteiner, tillsätt 2 μg sekvenseringsgrad Trypsin till 20 μL ABC som innehåller 0,1% tensid. Inkubera smältlösningen i 16 timmar vid 37 °C.
  5. Alkylera provet genom tillsats av 20 μL jodacetamid vid 55 mM i 100 mM ABC och inkubera vid rumstemperatur i 20 min.
  6. Tillsätt 20 μL 0,1 M HCl för att klyva tensiden och låt den vara i 10 minuter vid rumstemperatur.
  7. Berika och desaltpeptider med en C18-packad avsaltningspipettspets.
    1. Blöt spetsen med 80 μL 0,1% myrsyra 50% acetonitril 5 gånger, rengör med 80 μL 0,1% myrsyra 5 gånger, dra upp och eluera prov 10 gånger, desaltprov genom att spola 80 μL 0,1 % myrsyra 5 gånger och eluera provet 2 gånger med 80 μL 0,1% myrsyra 70% acetonitril till ett rent lågbindande PCR-rör.
  8. Lyofilisera proverna och förvara vid -20 °C tills analysen.

5. Metabolit coronaisolering

  1. Ta kontrollplasman och supernatanten från NM plasmainkubation från steg 3.3 och håll på is under provberedningen.
  2. Ta 50 μL från var och en till separata injektionsflaskar och späd 1 av 10 med DI-vatten. Ta 50 μL av varje utspädd prov och flytta till nya injektionsflaskar för steg 5.3.
  3. Tillsätt 200 μL kloroform, 250 μL metanol och 350 μL DI-vatten och virvelblandning kraftigt i 2 minuter. Centrifugera i 10 min vid 20 800 x g vid 4 °C.
  4. Ta 500 μL supernatant och filtrera genom ett 3 kDa centrifugalfilter i 2 timmar vid 10 000 x g vid 4 °C. Ta 430 μL ultrafiltrat och torka i en hastighetsvacka. Proverna kan nu frysas före analys.

6. Utarbetande av CESI-MS-system38

OBS: Innan kapillärerna installeras, kontrollera att kapillärens inlopps- och utloppsslut är intakta och att det inte finns några synliga brott i kapillären.

  1. Installation av neutralbelagd kapillär för protein coronaanalys39.
    1. Placera en ny neutralbelagd kapillär (90 cm lång med 30 μm innerdiameter) i CESI-instrumentet enligt tillverkarens riktlinjer.
  2. Förberedelse av CESI kapillärer för proteomisk analys.
    1. Spola separationskapilleriet i framåtriktad riktning med 100 mM HCl i 5 min vid 100 psi och kontrollera om droppformationen finns vid kapillärens utlopp. Spola separationskapilleriet med BGE vid 100 psi i 10 min och sedan DI-vatten vid 100 psi i 30 min (detta krävs endast för nya kapillärer).
    2. Spola både separationskapilleriet och den ledande kapillären med BGE vid 90 psi i 5 min och se till att droppar bildas vid utloppsslutet på båda kapillärerna.
    3. Spola separationskapilleriet med DI-vatten vid 90 psi i 10 min, sedan 50 psi i 10 min med 0,1 M HCl, följt av 90 psi i 10 min med DI-vatten och slutligen BGE vid 90 psi i 10 min. Koppla CESI till MS med hjälp av en nanospraykälla och adapter enligt tidigare beskrivet38.
  3. Installation av bar smält kiseldioxid kapillär för metabolit koronar karakterisering38.
    1. Placera en ny kal smält kiseldioxidkapär (90 cm lång med en innerdiameter på 30 μm) i CESI-instrumentet enligt tillverkarens riktlinjer.
  4. Beredning av CESI kapillärer för metabolomik analys.
    1. Spola separationskapilleriet i framåtriktad riktning med 100% MeOH vid 50 psi i 15 min och kontrollera om droppformationen vid kapillärens utlopp. Spola både separationskapilleriet och den ledande kapillären med BGE vid 90 psi i 5 minuter och se till att droppar bildas vid utloppet av båda kapillärerna.
    2. Spola separationskapilleriet med DI-vatten vid 90 psi i 10 min, sedan 50 psi i 10 min med 0,1 M NaOH, följt igen med 90 psi i 10 min med DI-vatten och slutligen BGE vid 90 psi i 10 min. Koppla CESI till ESI-MS med hjälp av en nanospraykälla och adapter som tidigare beskrivits. 38 (38)

7. CE-MS för protein coronaanalys

  1. Återanvända prover från steg 4,8 i 20 μL på 50 mM ammoniumacetat pH 4,0.
  2. Utför 5 psi 10 s hydrodynamisk injektion av provet. Separera med en 30 kV separationsspänning med följande tryckgradient: 0-10 min vid 1 psi, 10-35 min vid 1,5 psi och 35-45 min vid 5 psi med 100 mM, pH 2,9 ättiksyra som BGE.
  3. Samla in masspektra mellan 250-2000 m/z med topp-10 databeroende fragmenteringsförvärv.
  4. Skölj kapillären med 0,1 M HCl i 3 min vid 100 psi och 10 min 100 psi BGE för separationskapilleri och i 3 min vid 100 psi för den ledande flytande kapillären.

8. CESI-MS för metabolit coronaanalys

OBS: Alla prover måste analyseras två gånger, en gång i positivt läge för detektion av cations och en gång i negativt läge för detektion av anjoner. Kontrollplasmaproverna måste analyseras minst 5 gånger.

  1. Återanvända NM-exponerade och oexponerade plasmaprover från steg 5,4 i 430 μL DI-vatten och kraftigt virvel i 2 minuter. Filtrera genom ett 0,1 μm membranfilter.
  2. Ta 95 μL filtrat och tillsätt 5 μL interna standarder vid 200 μM för cations (L-metioninsulfon) och 400 μM för anjoner (2,2,4,4-D4-citronsyra) och virvel kraftigt. Centrifugera vid 4 000 x g vid 4 °C i 10 minuter före CESI-MS-analys.
  3. Injicera provet hydrodynamiskt i 30 s (cations) och 40 s (anjoner) vid 2 psi.
  4. Separera metaboliter i 10% ättiksyra med en separationsspänning på 30 kV framåt (cations) och omvänd (anjon) läge. Omvänd separationsläge assisteras med 0,5 psi framåttryck på separations kapillären.
  5. Ställ in masspektrometern för att samla in data i positivt (cations) eller negativt (anjon) läge över massområdet 65-1000 m/z. Skölj kapillären med 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, DI-vatten och BGE i 50 psi i 2 minuter mellan proverna.

Representative Results

Den beskrivna metoden är den första som karakteriserar både proteiner och metaboliter i NM biomolekylär korona med samma mänskliga plasmaprov. Denna metod kan upptäcka >200-proteiner och >150-metaboliter, vilket gör det möjligt att bestämma den mest omfattande översikten över den fullständiga biomolekylära koronan, vilket möjliggör ökad förståelse för NMs cellulära fastsättning, upptag och stötar.

Användningen av CESI-MS för både proteomik(figur 1)och metabolomik(figur 2)separation och detektion visar bra separationsfönster på båda kapillärerna för varje inflygning.

Denna metod kan skilja mellan proteinerna i koronan över ett brett spektrum av NMs-kompositioner, vilket visar metodernas tillämplighet på NMs över ett brett spektrum av fysiska och kemiska egenskaper (tabell 1).

De unika fingeravtrycken från metaboliten koronan kan också särskiljas med hjälp av den metabolomiska grenen av denna metod (figur 3). Även om detta tillvägagångssätt använder ett passivt tillvägagångssätt för att karakterisera NM-metaboliten corona kan det fortfarande avslöja intressanta insikter om metaboliternas roll i den biomolekylära koronan som differential adsorption av isomerer (Figur 4).

Figure 1
Figur 1: Exempel på elektrosfärogram av en SiO2-protein coronaseparation med CESI-MS efter en partikelsammanfattning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Exempel på extraherade jonelektrosfärogram erhållna från endogena föreningar i plasma från CE-MS. De numrerade föreningarna är följande: 1. Ornitin; 2. Lysin; 3. Arginin; 4. Histidin; 5. Kreatin; 6. Glycin; 7. Alanine; 8. Valine, 9. Isoleucin; 10. Leucin; 11. Serine, 12. Treonin; 13. Sparris. 14. Metionin; 15. Glutamin; 16. Glutaminsyra; 17. Fenyl-D5-alanin; 18. Fenylalanin; 19. Tyrosin; 20. Proline; 21. Metioninsulfon (intern standard). Publicerad under en open access Creative Commons CC BY-licens och reproducerad från Zhang et al17. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Tabell 1: Analys av protein koronan över en rad 6 NMs. Värmekarta över proteinklasser som identifierats på kiseldioxid (SiO2),titania (TiO2),PVP-kapsejsad titania (TiO2-PVP), dispex-täckta titania (TiO2-Dispex), polystyren och karboxylerade polystyren-NMs. Procentsatser avser proteinets överflöd i förhållande till den totala proteinhalten baserat på topp 3-peptider överflöd för varje protein. Med tanke på de skillnader som observerats i de relativa överflöden av proteiner i de olika NM-koronanerna är det uppenbart att detta föreslagna protokoll är tillräckligt känsligt för att skilja mellan protein corona hos olika NMs. Figur reproducerad från en CESI-MS-analys av proteinet corona, publicerad under en open access Creative Commons CC BY-licens11. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Figure 3
Figur 3: Riktad analys av katjonmetaboliterna i NM-koronan. Adsorption av cations till SiO2 och TiO2 NMs. Röd avser den ursprungliga koncentrationen av metaboliter medan blått avser koncentrationen av metaboliter efter en 1 h inkubation med NMs vid 37 °C. Minskningen av metabolitkoncentrationen i lösningen är ett resultat av metabolit adsorption till NM-ytan. Ingen signifikant adsorption av metaboliter observerades för polystyren NMs. Box-diagram representerar minimi- och maximivärden, median- och interkvartilintervall. Figur reproducerad från en CESI-MS riktad analys av metaboliten corona publicerad under en open access Creative Commons CC BY-licens15. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Riktad analys av de anjoniska metaboliterna i NM-koronan med fokus på isomer-adsorption. Adsorption av anjoner till en rad olika titania-NMs visar tydliga skillnader mellan olika isomerer som sockerfosfater. Rött avser den ursprungliga koncentrationen av metaboliter medan blått avser koncentrationen av metaboliter efter en inkubation på 1 timme med NM vid 37 °C. Minskningen av metabolitkoncentrationen i lösningen är ett resultat av metabolit adsorption till NM-ytan. Ingen signifikant adsorption av metaboliter observerades för SiO2 och polystyren-NMs. Box-diagram representerar minimi- och maximivärden, median- och interkvartilintervall. Figur reproducerad från en CESI-MS riktad analys av metaboliten corona publicerad under en open access Creative Common CC BY-licens15. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Analyte (analyte) Genomsnittligt RSD-toppområde Genomsnittlig RSD-migreringstid
Peptider intradag 1928 (n=3) 15% 0.30%
27 cations intra-day (n=16) 5.80% 2.20%
27 katjoner inter-day (n=36) 8.60% 1.80%

Tabell 2: Reproducerbarhet av CESI-MS tekniska replikat för peptider och katjonmetaboliter. RSD: relativ standardavvikelse, som ett mått på reproducerbarhet. Cesi-MS reproducerbarhet när det gäller toppområden och migrationstider är mycket bra, med alla analyter som har en genomsnittlig RSD-<15% och migrationstider <2,2%. Dessa resultat visar den höga grad av förtroende som kan hänföras till de data som samlas in med hjälp av denna teknik och bekräftar att upptäckta variationer beror på verkliga skillnader i provsammansättning (anrikning på NMs) snarare än analytisk variation. Tabell 2 genereras från resultat som tidigarepresenterats 11,15.

Discussion

Detta är den första metoden som föreslås för att karakterisera den fullständiga biomolekylära koronan som innehåller proteiner och metaboliter, från samma prov, med CESI-MS. Förmågan att karakterisera både proteiner och metaboliter från samma prov kommer att avsevärt öka mängden data som samlas in från en enda experimentell exponering som möjliggör nya insikter om processen för koronanbildning och dess effekter för NMs toxicitet och effekt som nanomediciner. Dessutom är CESI-MS en idealisk plattform för att karakterisera båda klasserna av biomolekyler med bara en förändring av kapillären som krävs. Framöver kommer nya metoder som utvecklats för icke-vattenhaltiga CE att göra det möjligt att utföra lipidomics med CE-MS40, vilket innebär att det nu är möjligt att analysera proteiner, metaboliter och lipider med hjälp av en enda plattform. De nuvarande konventionella metoderna skulle kräva två dedikerade LC-MS-plattformar, en för proteinet koronan och en för metaboliten corona. Således kan detta tillvägagångssätt samla in dubbelt så mycket data med hjälp av en enda analysplattform.

Det finns vissa varningar till detta tillvägagångssätt, särskilt med metaboliten corona eftersom detta protokoll föreslår en indirekt mätning av corona. Som sådan kan problem uppstå när metabolitnivåerna finns vid höga koncentrationer i förhållande till NMs och den efterföljande minskningen av metabolitkoncentrationen i matrisen är liten. Men till skillnad från proteinet corona är det osannolikt att en "en storlek passar alla" -metoden för att isolera metaboliten koronan kommer att utvecklas på grund av att varje NM har unika ytkemier. Framöver är det mer troligt att NM-specifika metoder för att isolera metaboliten corona kommer att utvecklas och valideras. Detta kommer endast att gälla för det specifika NM. Trots detta kommer CESI-MS fortfarande att vara en mycket lämplig plattform för karakterisering av de polära laddade metaboliterna oavsett hur de isoleras. Det är också anmärkningsvärt att om en pellet inte bildas under centrifuugeringsstegen som är utformade för att pelleta NMs, kan en högre centrifugalkraft krävas. Detta är mest sannolikt att inträffa med mindre täta NMs. Det är också viktigt att alla filtreringssteg följs inom protokollet på grund av kapillärens smala borrhål, dessa kan lätt blockeras om något partiklar inte har eliminerats tillräckligt från provet.

Medan protein corona har varit ett intensivt forskningsområde under ett antal år förmågan att kombinera det med metaboliten corona är ett nytt intresseområde för forskare som undersöker bionanogränssnittet6,14. Hittills har majoriteten av dessa studier fokuserat på den icke-polära, lipidfraktionen av metaboliten corona9,28. Denna nuvarande metod möjliggör karakterisering av de mycket polära och laddade metaboliterna i koronan som inkluderar viktiga metaboliter involverade i energimetabolism, glykolys och DNA-syntes. Som ett resultat, i kombination med proteomics arbetsflöde, är en mer holistisk karakterisering av biomolekylär corona möjligt. Detta möjliggör en mer djupgående analys av bionanointeraktioner framöver. Denna metod möjliggör förbättrade mekanistiska insikter i receptormedierad endocytos via protein- och metabolitinteraktioner med membranreceptorer. Dessutom kan interaktioner mellan och intra corona mellan proteiner och små molekyler utforskas. till exempel har det nyligen visat sig att proteinerna i corona spelar en nyckelroll i rekryteringen av metaboliter15. Det är värt att notera att de representativa resultaten i figur 3 och figur 4 är absolut kvantifiering av metaboliter, men ett oföränderligt tillvägagångssätt med hjälp av multivariat dataanalys för att jämföra alla CE-MS-funktioner i kontroller jämfört med exponerad plasma skulle också klargöra metabolitbindning. Det finns således ett betydande utrymme för att undersöka hur, och vilka, metaboliter och proteiner påverkar deras respektive rekrytering till NM-koronor. Dessa ytterligare studier kan hjälpa till att utforma koronor för att optimera leveransen av nanomediciner eller avslöja ytterligare hinder för deras utveckling, såsom undertryckande av farmaceutisk verkan på grund av biomolekylär coronablockering eller maskering av inriktningsfunktioner.

CESI-MS med sina nanovågsflöden på cirka 20 nL/min och minimal användning av organiska lösningsmedel ger en förbättring av gröna och ekonomiska referenser jämfört med standard LC-MS och nanoLC-MS när det gäller lösningsmedelsanvändning, de största utmaningarna för metabolomik respektive proteomikstudier. CESI-MS erbjuder mycket reproducerbara resultat för både migreringstid och toppområde som kan jämföras med LC-MS-baserademetoder 11,15. Jämfört med nanoLC-MS är överföring inte heller ett problem i CESI-MS. Därför krävs inte omfattande systemrensning mellan provanalyser, vilket avsevärt förbättrar provgenomströmningen11.

Sammanfattningsvis är det föreslagna arbetsflödet det första som beskriver ett tillvägagångssätt för att karakterisera både protein- och metabolitkomponenterna i den fullständiga biomolekylära koronan hos NMs. Detta låser upp en ny aspekt av bionanointeraktioner, metaboliten koronan, vilket möjliggör insamling av dubbelt så mycket data från samma prov, vilket möjliggör en mer fullständig förståelse av interaktioner vid bionanogränssnittet.

Disclosures

J.A.T är anställd på AB Sciex UK Ltd som deltar som branschpartner i ACEnano-projektet, J.A.T och alla andra författare har ingen intressekonflikt i detta arbete.

Acknowledgments

A.J.C, J.A.T och I.L bekräftar finansiering från Europeiska kommissionen via Horizon 2020-projektet ACEnano (Bidrag nr. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z erkänner doktorsfinansiering från China Scholarship Council (CSC, nr 201507060011). R.R erkänner det ekonomiska stödet från Vidis bidragssystem från Den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO Vidi 723.0160330).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dithiothreitol Sigma 10197777001
2,2,4,4-D4-citric Simga 485438-1G Internal standard anion
Ammonium Acetate >98% Sigma A1542
Ammonium Bicarbonate >99.5% Sigma 09830
Capillary cartridge coolant Sciex 359976
CESI 8000 instrument Sciex A98089
CESI Cap Sciex B24699
CESI Vials Sciex B11648
Chloroform Sigma 650498 Toxic, use in a fume hood
Glacial Acetic acid Sigma A6283
Hydrochloric acid 1mol/L Sigma 43617
Iosoacetamide Sigma I1149
L-methionine sulfone Sigma M0876-1G Internal standard cation
Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve) Sigma 14262 Use in a fume hood
Microvials Sciex 144709
nanoVials Sciex 5043467
Neutral Surface Cartridge 30 µM ID x 90 cm total length Sciex B07368
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source Sciex B07363 B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers
OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 µm ID x 90 cm total length Sciex B07367
Phospahte buffered saline 10x Sigma P7059
Pierce C18 Tips, 100 µL bed Thermo Fisher Scientific 87784
Polystyrene 100 nm Polysciences Inc 876
Polystyrene carboxylated 100 nm Polysciences Inc 16688
Polystyrene carboxylated 1000 nm Polysciences Inc 08226
Rapigest SF (surfactant) Waters 186001860
Sequencing Grade modified Trypsin Promega V5111
SiO2 Ludox TM-40 Sigma 420786
Sodium Hydroxide solution Simga 72079
TiO2 Dispex coated Promethion particles Bespoke particles
TiO2 PVP coated Promethion particles Bespoke particles
TiO2 uncoated Promethion particles Bespoke particles

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ke, P. C., Lin, S., Parak, W. J., Davis, T. P., Caruso, F. A Decade of the Protein Corona. ACS Nano. 11 (12), 11773-11776 (2017).
  2. Sasidharan, A., Riviere, J. E., Monteiro-Riviere, N. A. Gold and silver nanoparticle interactions with human proteins: impact and implications in biocorona formation. Journal of Materials Chemistry B. 3 (10), 2075-2082 (2015).
  3. Albanese, A., et al. Secreted biomolecules alter the biological identity and cellular interactions of nanoparticles. ACS Nano. 8 (6), 5515-5526 (2014).
  4. Lynch, I., Dawson, K. A. Protein-nanoparticle interactions. Nano Today. 3 (1-2), 40-47 (2008).
  5. Tenzer, S., et al. Rapid formation of plasma protein corona critically affects nanoparticle pathophysiology. Nature Nanotechnology. 8 (10), 772-781 (2013).
  6. Chetwynd, A. J., Lynch, I. The rise of the nanomaterial metabolite corona, and emergence of the complete corona. Environmental Science: Nano. 7 (4), 1041-1060 (2020).
  7. Lee, J. Y., et al. Analysis of lipid adsorption on nanoparticles by nanoflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 1-10 (2018).
  8. Pink, M., Verma, N., Kersch, C., Schmitz-Spanke, S. Identification and characterization of small organic compounds within the corona formed around engineered nanoparticles. Environmental Science: Nano. 5 (6), 1420-1427 (2018).
  9. Chetwynd, A. J., Wheeler, K. E., Lynch, I. Best practice in reporting corona studies: Minimum information about Nanomaterial Biocorona Experiments (MINBE). Nano Today. 28, 100758 (2019).
  10. Zhang, H., et al. Quantitative proteomics analysis of adsorbed plasma proteins classifies nanoparticles with different surface properties and size. Proteomics. 11 (23), 4569-4577 (2011).
  11. Faserl, K., Chetwynd, A. J., Lynch, I., Thorn, J. A., Lindner, H. H. Corona isolation method matters: Capillary electrophoresis mass spectrometry based comparison of protein corona compositions following on-particle versus in-solution or in-gel digestion. Nanomaterials. 9 (6), 898 (2019).
  12. Nasser, F., Lynch, I. Secreted protein eco-corona mediates uptake and impacts of polystyrene nanoparticles on Daphnia magna. Journal of Proteomics. 137, 45-51 (2016).
  13. Hellstrand, E., et al. Complete high-density lipoproteins in nanoparticle corona. FEBS Journal. 276 (12), 3372-3381 (2009).
  14. Grintzalis, K., Lawson, T. N., Nasser, F., Lynch, I., Viant, M. R. Metabolomic method to detect a metabolite corona on amino functionalised polystyrene nanoparticles. Nanotoxicology. , 1-12 (2019).
  15. Chetwynd, A. J., Zhang, W., Thorn, J. A., Lynch, I., Ramautar, R. The nanomaterial metabolite corona determined using a quantitative metabolomics approach: A pilot study. Small. , (2020).
  16. Chetwynd, A. J., Guggenheim, E. J., Briffa, S. M., Thorn, J. A., Lynch, I., Valsami-Jones, E. Current application of capillary electrophoresis in nanomaterial characterisation and its potential to characterise the protein and small molecule corona. Nanomaterials. 8 (2), 99 (2018).
  17. Zhang, W., et al. Assessing the suitability of capillary electrophoresis-mass spectrometry for biomarker discovery in plasma-based metabolomics. Electrophoresis. , 00126 (2019).
  18. Ramautar, R., Somsen, G. W., de Jong, G. J. CE-MS for metabolomics: Developments and applications in the period 2016-2018. Electrophoresis. 40 (1), 165-179 (2019).
  19. Sarg, B., Faserl, K., Lindner, H. H. Identification of novel site-specific alterations in the modification level of myelin basic protein isolated from mouse brain at different ages using capillary electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 17 (19), 1700269 (2017).
  20. Faserl, K., Sarg, B., Maurer, V., Lindner, H. H. Exploiting charge differences for the analysis of challenging post-translational modifications by capillary electrophoresis-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1498, 215-223 (2017).
  21. Zhang, Z., Qu, Y., Dovichi, N. J. Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry for bottom-up proteomics. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 108, 23-37 (2018).
  22. Shen, X., et al. Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry for top-down proteomics. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 120, 115644 (2019).
  23. Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (2), 885-892 (2012).
  24. Faserl, K., Kremser, L., Müller, M., Teis, D., Lindner, H. H. Quantitative proteomics using ultralow flow capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 87 (9), 4633-4640 (2015).
  25. Faserl, K., Sarg, B., Kremser, L., Lindner, H. Optimization and evaluation of a sheathless capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry platform for peptide analysis: comparison to liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (19), 7297-7305 (2011).
  26. Segers, K., et al. CE-MS metabolic profiling of volume-restricted plasma samples from an acute mouse model for epileptic seizures to discover potentially involved metabolomic features. Talanta. 217, 121107 (2020).
  27. Chetwynd, A. J., David, A. A review of nanoscale LC-ESI for metabolomics and its potential to enhance the metabolome coverage. Talanta. 182, 380-390 (2018).
  28. Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-Mass spectrometry at trial by metabo-ring: Effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
  29. Faria, M., et al. Minimum information reporting in bio-nano experimental literature. Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).
  30. Leong, H. S., et al. On the issue of transparency and reproducibility in nanomedicine. Nature Nanotechnology. 14 (7), 629-635 (2019).
  31. Kaur, I., et al. Dispersion of nanomaterials in aqueous media: Towards protocol optimization. Journal of Visualized Experiments. (130), e56074 (2017).
  32. Bihari, P., et al. Optimized dispersion of nanoparticles for biological in vitro and in vivo studies. Particle and Fibre Toxicology. 5 (1), 1-14 (2008).
  33. Taurozzi, J. S., Hackley, V. A., Wiesner, M. R. Ultrasonic dispersion of nanoparticles for environmental, health and safety assessment - and recommendations. Nanotoxicology. 5 (4), 711-729 (2011).
  34. Lu, P. J., et al. Methodology for sample preparation and size measurement of commercial ZnO nanoparticles. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (2), 628-636 (2018).
  35. Langevin, D., et al. Inter-laboratory comparison of nanoparticle size measurements using dynamic light scattering and differential centrifugal sedimentation. NanoImpact. 10, 97-107 (2018).
  36. Lee, S., Bi, X., Reed, R. B., Ranville, J. F., Herckes, P., Westerhoff, P. Nanoparticle size detection limits by single particle ICP-MS for 40 elements. Environmental Science and Technology. 48 (17), 10291-10300 (2014).
  37. Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).
  38. Zhang, W., Gulersonmez, M. C., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples. Journal of Visualized Experiments. , e54535 (2016).
  39. Faserl, K., Sarg, B., Lindner, H. H. Application of CE-MS for the analysis of histones and histone modifications. Methods. , (2020).
  40. Azab, S., Ly, R., Britz-Mckibbin, P. Robust method for high-throughput screening of fatty acids by multisegment injection-nonaqueous capillary electrophoresis-mass spectrometry with Sstringent quality control. Analytical Chemistry. 91 (3), 2329-2336 (2019).
  41. Zhang, X., Pandiakumar, A. K., Hamers, R. J., Murphy, C. J. Quantification of lipid corona formation on colloidal nanoparticles from lipid vesicles. Analytical Chemistry. 19 (24), 14387-14394 (2018).

Tags

Kemi utgåva 164 förvärvad biomolekylsk korona nanomaterial metabolomik proteomik CE-MS nanomedicin kapillärelektrofores CESI-MS
Kapillärelektrofores masspektrometri metoder för karakterisering av protein och metabolit korona förvärvas av nanomaterial
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chetwynd, A. J., Zhang, W., Faserl,… More

Chetwynd, A. J., Zhang, W., Faserl, K., Thorn, J. A., Lynch, I., Ramautar, R., Lindner, H. H. Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials. J. Vis. Exp. (164), e61760, doi:10.3791/61760 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter