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Immunology and Infection

एक पूरे शरीर साँस लेना प्रणाली का उपयोग कर चूहों में सिगरेट धुआं जोखिम

Published: October 22, 2020 doi: 10.3791/61793
Automatic Translation
1,2, 3,7, 1,3, 4, 1,5, 6, 6, 2, 4,8, 3,8
1Program in Immunology, Baylor College of Medicine, 2Department of Pediatrics, Section of Infectious Diseases, Baylor College of Medicine, 3Department of Medicine - Immunology Allergy and Rheumatology, Baylor College of Medicine, 4Department of Medicine, Pulmonary, Critical Care, Sleep Medicine, Baylor College of Medicine, 5Department of Pathology and Immunology, Baylor College of Medicine, 6Department of Pediatrics, Research and Department of Epigenetics and Molecular Carcinogenesis, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 7Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 8Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey VA Medical Center

Summary

यह प्रोटोकॉल सिगरेट के धुएं (सीएस) के रोगविज्ञानी प्रभावों के अध्ययन को दर्शाता है जिसमें पूरे शरीर में साँस लेना (डब्ल्यूबीआई) एक्सपोजर सिस्टम (डब्ल्यूबीआई) इन-हाउस बनाया गया है। यह प्रणाली फेफड़ों के एम्फिसिमा और हेमेटोपोसिस पर सीएस-मध्यस्थता प्रभावों के अनुसंधान के लिए नियंत्रित दोहराने योग्य परिस्थितियों में सीएस के लिए जानवरों को बेनकाब कर सकती है।

Abstract

संयुक्त राज्य अमेरिका में वयस्कों के करीब 2018 में सिगरेट पीने की सूचना मिली थी। फेफड़ों और हृदय रोगों पर सिगरेट के धुएं (सीएस) के प्रभाव का व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है, हालांकि, अन्य ऊतकों और रक्त और अस्थि मज्जा जैसे अंगों में सीएस का प्रभाव अधूरा परिभाषित रहता है। कृंतक में सीएस के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त प्रणाली ढूंढना निषेधात्मक रूप से महंगा हो सकता है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणालियों की खरीद की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, हम चूहों में सीएस के रोगजनक प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक सस्ती, विश्वसनीय और बहुमुखी प्रणाली बनाने के लिए तैयार हैं। यह पूरे शरीर साँस लेना जोखिम प्रणाली (WBIS) सेट अप सीएस और स्वच्छ हवा के लिए जोखिम बारी से सिगरेट की सांस लेने और puffing नकल करता है । यहां हम बताते हैं कि यह अपने आप (DIY) प्रणाली सिगरेट के धुएं के जोखिम के 4 महीने के बाद चूहों में वायुमार्ग सूजन और फेफड़ों के एम्फिसिमा लाती है । इस उपकरण का उपयोग कर बोन मैरो में हेमेटोपोइटिक स्टेम और जनक कोशिकाओं (एचएसपीसी) पर सीएस के पूरे शरीर साँस लेने (डब्ल्यूबीआई) के प्रभाव भी दिखाए जाते हैं।

Introduction

सिगरेट पीने के पिछले 50-60 साल1में सिगरेट पीने वाले वयस्कों की संख्या में लगातार गिरावट के बावजूद अमेरिका में रोके जा सकते हैं रोगों का एक प्रमुख कारण बना हुआ है । यह व्यापक रूप से ज्ञात है कि धूम्रपान फेफड़ों और रक्त के कई रोगों से जुड़ा हुआ है जिसमें क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी), रोगों का एक समूह है जिसमें एम्फिसिमा और क्रोनिक ब्रोंकाइटिस2,3,4शामिल हैं। रोग नियंत्रण के लिए केंद्र (सीडीसी) के अनुसार, २०१४ में, सीओपीडी संयुक्त राज्य अमेरिका में मौत का तीसरा प्रमुख कारण था जिसमें १५,०,० से अधिक अमेरिकी इस बीमारी से पीड़ितथे 5।

सीएस भी हाल ही में क्लोनल हेमेटोपॉयसिस (CH)6,7,एक शर्त है जिसमें एक भी हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल अनुपातिक रूप से एक व्यक्ति के परिधीय रक्त का एक बड़ा प्रतिशत पैदा करने के विकास के एक उच्च जोखिम के साथ जुड़ा हुआ है । यह खोज धूम्रपान और अस्थि मज्जा समारोह के बीच एक संभावित संबंध इंगित करता है। सीएस के व्यापक और अत्यधिक महत्वपूर्ण स्वास्थ्य निहितार्थों को देखते हुए और यह देखते हुए कि रोगों के मुरीन मॉडल जैव चिकित्सा अनुसंधान में प्रगति का आधार हैं, चूहों में सीएस मॉडल के लिए कुशल और किफायती प्रणालियों को विकसित करना उपयोगी है।

यहां, हम फेफड़ों के एम्फिसिमा और बोन मैरो होमोस्टेसिस पर सीएस के वीवो प्रभावों के इलाज और अध्ययन के लिए एक किफायती प्रणाली के निर्माण के लिए एक कदम-दर-कदम गाइड प्रदान करते हैं। इस उपकरण की असेंबली में उपयोगकर्ता को विशेष ज्ञान की आवश्यकता नहीं होती है और इस प्रकार DIY असेंबली के लिए अनुमति देता है।

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Protocol

प्रयोगों और इस तकनीक के विकास में शामिल सभी जानवरों हमारे पशु उपयोग संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत किया गया है और बायलोर कॉलेज ऑफ मेडिसिन और एमडी एंडरसन संस्थानों के तहत है कि मूल्यांकन और प्रयोगशाला पशु देखभाल (AAALAC) के प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन द्वारा मांयता प्राप्त कर रहे हैं ।

1. उपकरण का निर्माण

  1. वाल्व प्रणाली के साथ हवा कंप्रेसर कोडांतरण।
    1. 1/8 इंच थ्रेडेड पुरुष एडाप्टर निपल फिटिंग का उपयोग करके लघु दबाव नियामक से फ्लोमीटर (वाई बार और 2 पावर टेकऑफ के साथ दो 15 एल/मिनट) कनेक्ट करें। सभी पिरोया सिरों में धागा सील टेप का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें।
    2. निम्नलिखित का उपयोग कर चिकित्सा हवा कंप्रेसर साधन के लिए प्रवाहमीटर के साथ इकट्ठे दबाव नियामक कनेक्ट: कंप्रेसर एयर आउटलेट पर एक 1/8 इंच हेक्स निप्पल, एक 1/8 इंच लड़ी पिरोया युग्मन फिटिंग, और एक 1/8 इंच पिरोया पुरुष एडाप्टर निप्पल फिटिंग है कि दबाव नियामक से जोड़ता है ।
    3. प्रत्येक (4) प्रवाह मीटर पर ऑक्सीजन कुंडा कंटीले कनेक्टर स्थापित करें।
    4. एयर कंप्रेसर के शीर्ष एयर आउटलेट पर एक पुरुष एडाप्टर स्थापित करें (मेडिकल एयर कंप्रेसर उपकरण के साथ शामिल हिस्सा)।
  2. एक्सपोज़र कक्षों को इकट्ठा करना (4 इकाइयां बनाएं)
    1. 3/4 इंच क्लोरीनेटेड पॉलीविनाइल क्लोराइड (सीपीवीसी) पाइप को आठ 4 इंच सेगमेंट में काट लें ।
    2. प्रत्येक खंड को एक 3/4 इंच कोहनी सीपीवीसी फिटिंग में डालें और कोहनी के फिटिंग साइड को 3/4 इंच व्यास सीपीवीसी पुरुष एडाप्टर में संलग्न करें। आठ सीपीवीसी सेगमेंट होने चाहिए, प्रत्येक सीपीवीसी कोहनी फिटिंग और एक सीपीवीसी पुरुष एडाप्टर से जुड़ा होना चाहिए।
    3. एक ढक्कन के साथ एक 8.5 एल एयरटाइट कंटेनर (11.25 x 7.75 x 6 इंच) के एक दूसरे से सबसे दूर विपरीत पक्षों पर दो छेद (1 1/4 इंच व्यास) ड्रिल करें (चित्रा 1 एक्सपोजर चैंबर देखें)। छेद की स्थिति को ऊपर से नीचे केंद्रित किया जाना है और बाएं से दाएं तक केंद्रित होना है।
    4. कंटेनरों में प्रत्येक छेद में पहले इकट्ठे CPVC पुरुष एडाप्टर के पिरोया पक्षों डालें।
    5. कंटेनर के अंदर से, दूसरी तरफ 3/4 इंच CPVC टोपी (चैंबर धुआं इनपुट) और एक तरफ 3/4 इंच CPVC ड्रिप सिंचाई महिला एडाप्टर (चैंबर धुआं उत्पादन) देते हैं ।
    6. एक क्विंकुनक्स (शॉवर हेड) पैटर्न में चैंबर स्मोक आउटपुट के सीपीवीसी कैप के शीर्ष पर पांच 3 मिमी छेद ड्रिल करें। यह सिगरेट के धुएं को उच्च वेग के साथ कक्ष में प्रवेश करने की अनुमति देगा और यह सुनिश्चित करता है कि यह सभी दिशाओं में कक्ष के अंदर समान रूप से फैलता है।
  3. सिगरेट कक्षों कोडांतरण (4 मुरीन एक्सपोजर इकाइयों को बनाता है)
    1. एक छेद रबर डाट (निर्माता आकार 8.5) लें और व्यापक पक्ष पर एक 1/4 इंच कंटीले वाई कनेक्टर डालें और संकरा पक्ष पर एक सीधे कंटीले फिटिंग (8 मिमी उद्घाटन) डालें। सिगरेट को यहां स्मोकिंग प्रोसीजर (सिगरेट पेडस्टल) के दौरान रखा जाएगा।
    2. रबर डाट से जुड़े वाई कनेक्टर पर कंटीले कनेक्टर में से एक के लिए एक 12 इंच लंबे मेडिकल ग्रेड विनाइल पाइप के एक छोर कनेक्ट और एक 1/4 इंच फिटिंग के लिए दूसरे छोर और एक छेद रबर डाट (निर्माता आकार 1) पर इस फिटिंग के विपरीत पक्ष डालें ।
    3. एक अन्य रबर डाट (निर्माता आकार 8.5) पर, डाट के व्यापक पक्ष पर एक 1/4 इंच सीधे ट्यूबिंग कनेक्टर डालें और फिटिंग के बाहरी छोर को 7 फीट मेडिकल ग्रेड विनाइल पाइप से कनेक्ट करें।
    4. प्रयोगशाला ग्लास ड्रेन ट्यूब से 8 इंच x 1.75 इंच ग्लास सिलेंडर के लिए चरण 1.3.1-1.3.3 में पहले इकट्ठे हुए दो रबर डाट संरचनाओं को कनेक्ट करें।
  4. वाल्व नियंत्रण प्रणाली
    1. सिस्टम को एक लयबद्ध उद्घाटन और सोनालिका वाल्व के समापन द्वारा नियंत्रित किया जाता है जो सिगरेट के धुएं और स्वच्छ हवा के साँस लेना (पफिंग) का अनुकरण करता है। सोनालिका वाल्व को नियंत्रित करने वाली प्रणाली को व्यावसायिक रूप से डिजाइन किया गया था (सामग्री की तालिकादेखें)।
  5. सभी घटकों को एक साथ कोडांतरण (चित्रा 1देखें)
    1. 1 इंच फास्टनर का उपयोग कर वाल्व नियंत्रण प्रणाली के किनारों के लिए चार सोनालिका वाल्व माउंट।
    2. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए सॉल्वन कंट्रोल सिस्टम से सोनालिका वाल्व कनेक्ट करें।
    3. सोनालिका वाल्व पर निकास ("EXH") कनेक्शन के लिए एक 10-32 (एम) पिरोया सीधे कनेक्टर और "IN" और एक ही सोनालिका वाल्व के "बाहर" कनेक्शन पर एक लड़ी पिरोया बंदरगाह एडाप्टर संलग्न करें ।
    4. 7 फीट मेडिकल ग्रेड विनाइल ट्यूबिंग का उपयोग करके "आउट" कनेक्शन के माध्यम से कंप्रेसर से जुड़े फ्लोमीटर को "आउट" कनेक्शन के माध्यम से कनेक्ट करें।
    5. चरण 1.3.3 में रबर डाट के साथ इकट्ठे 7 फुट विनाइल ट्यूब कनेक्ट करें। सोनालिका वाल्व पर "इन" कनेक्टर पर।
    6. चैंबर धुआं इनपुट पर सिगरेट चैंबर के छोटे रबर डाट डालें।
    7. कदम 1.3.1 में इकट्ठे सिगरेट आसन पर कंटीले वाई कनेक्टर के दूसरे कनेक्शन के लिए सोनालिका वाल्व कनेक्ट करें।

Figure 1
चित्रा 1: सीएस के संपर्क के लिए हमारे WBIS के कनेक्शन की योजनाबद्ध। यह आंकड़ा दर्शाता है कि कैसे सभी घटकों को एक काम उपकरण बनाने के लिए इकट्ठे हुए हैं । आंकड़ा चार के केवल एक इकट्ठे धूम्रपान कक्ष से पता चलता है कि मशीन के संचालन में सक्षम है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

2. सिगरेट के धुएं का एक्सपोजर

सावधानी: सिगरेट के धुएं के लिए दूसरे और तीसरे हाथ के संपर्क से बचें। सिगरेट और एक्सपोजर कक्षों का उपयोग कक्षा 2 प्रकार B2 Laminar प्रवाह जैविक सुरक्षा अलमारियाँ के भीतर किया जाना चाहिए। धूम्रपान एक्सपोजर प्रयोगों (यानी मास्क, दस्ताने, हेयरनेट, गाउन) का संचालन करते समय उचित पीपीई पहना जाना चाहिए।

  1. दबाव और एयरफ्लो सेट करना
    1. एक बार जब सभी घटकों को चित्र 1में दिखाया गया है, तो एयर कंप्रेसर चालू करें और सुरक्षा अलार्म को अपने आप बंद करने की प्रतीक्षा करें।
    2. एयर कंप्रेसर के दबाव को प्रेशर रेगुलेटर पर घुंडी मोड़कर 40-50 साई में एडजस्ट करें।
    3. फ्लोमीटर का उपयोग करके एयर कंप्रेशर से 5 एल तक एयरफ्लो को समायोजित करें।
    4. वाल्व नियंत्रक चालू करें।
    5. वाल्व कंट्रोलर पर डिजिटल टाइमर को पल्स-सी (डिस्प्ले में "पीयू-सी" के रूप में दिखाया गया) टाइमर के पहले डिजिट में यूपी चाबी को नीचे रखते हुए सेट/लॉक चाबी दबाकर ऑपरेटिंग मोड को एडजस्ट करें । इसके बाद पीयू-सी मोड तक पहुंचने तक यूपी की चाबी दबाएं। प्रदर्शित ऑपरेटिंग मोड (यानी, पीयू-सी) को वर्किंग मोड के रूप में सेट करने के लिए रीसेट कुंजी को दबाएं।
    6. टाइमर 1 बदलने के लिए सेट/लॉक दबाएं (प्रदर्शन में "T1" के रूप में दिखाया गया है)।
    7. टी 1 से 20 एस सेट करने के लिए अप या डाउन चाबियां दबाें।
    8. टाइमर 2 बदलने के लिए सेट/लॉक दबाएं (प्रदर्शन में "टी-2" के रूप में दिखाया गया है) ।
    9. टी2 से 3 एस सेट करने के लिए अप या डाउन की चाबियां दबाें ।
      नोट: चरण 2.1.5 से 2.1.9 विशिष्ट टाइमर (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ उपयोग किए जाने के अनुरूप हैं। इस उत्पाद के लिए अन्य उपयोगों पर आगे के निर्देशों के लिए, इसके संबंधित उपयोगकर्ता मैनुअल देखें।
  2. सिगरेट के धुएं का इलाज
    नोट: यह प्रणाली एक ही समय में 1-4 मुरीन एक्सपोजर कक्षों के उपयोग के लिए अनुमति देती है।
    1. एयर कंप्रेसर चालू करें और सुरक्षा अलार्म को अपने आप बंद करने की प्रतीक्षा करें।
    2. वाल्व नियंत्रक चालू करें।
    3. 8.5 एल की मात्रा के साथ एयरटाइट हटाने योग्य ढक्कन के साथ चार एक्सपोजर कक्षों में से प्रत्येक में 5 चूहों को स्थानांतरित करें।
    4. लैमिनार प्रवाह जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर, एक सिगरेट को हल्का करें और सिगरेट कक्ष के अंदर सिगरेट डालें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिगरेट का उपयोग करें जिसमें 15 मिलीग्राम/सिग टार और १.१ मिलीग्राम/सिग निकोटीन8 केंटकी 3RF4 शोध सिगरेट (९.५ मिलीग्राम/सिग टार और ०.७३ मिलीग्राम/सिग निकोटीन) की तुलना में9।
    5. वाल्व नियंत्रक पर वाल्व पर स्विच करें जो वर्तमान में उपयोग में आने वाले कक्षों के अनुरूप हैं। एक्सपोजर 2 चरणों में विभाजित है: (T1) स्वच्छ हवा 20 एस के लिए जोखिम कक्ष में पंप है और (टी 2) एयरफ्लो सिगरेट को जलाने के लिए और सिगरेट चैंबर से धुआं 3 एस के लिए जोखिम कक्ष में पंप है का कारण बनता है । सिगरेट को पूरी तरह से जलाने की अनुमति दें जब तक कि यह फिल्टर तक न पहुंच जाए।
      1. एक ~ 4 मिनट की अवधि में ~ 10 पफ/सिगरेट के एक औसत प्रदर्शन करने के लिए टाइमर सेटिंग्स समायोजित करें । ध्यान दें कि टाइमर और सिस्टम जांचकर्ताओं की शोध जरूरतों के अनुसार सीएस डोजिंग आहार को बढ़ाने या कम करने के लिए आसानी से अनुकूलन योग्य हैं।
    6. सिगरेट फिल्टर निकालें और लौ को बुझाने और गंध को गीला करने के लिए पानी के साथ एक गिलास बीकर में सिगरेट के बट रखकर इसे निपटाएं।
    7. सुनिश्चित करें कि सिगरेट चैंबर फिर से और सिगरेट के बिना बंद कर दिया गया है। मशीन पंप 10 मिनट के लिए हवा साफ करते हैं। सीएस के संपर्क में आने वाले कशेरुकी जानवरों की लगातार निगरानी बनाए रखना अत्यंत महत्वपूर्ण है । यह उजागर आहार प्रति एक्सपोजर कक्ष 9 सप्ताह पुराने 5 महिला चूहों के लिए अनुकूलित है।
    8. एक दिन में प्रति कक्ष कुल 4 सिगरेट के लिए 2.3.7 तीन बार चरण 2.3.4 दोहराएं। इस प्रक्रिया को सप्ताह में 5 दिन तब तक दोहराया जाता है जब तक शोधकर्ता को अपने प्रयोगों के लिए आवश्यकता होती है।
    9. एक्सपोजर कक्षों से चूहों को वापस उनके इसी पिंजरों में निकालें।
    10. वाल्व नियंत्रक और एयर कंप्रेसर बंद कर दें।
    11. एक्सपोजर और सिगरेट कक्षों को हटा दें और तारकोल के किसी भी अवशेष को हटाने के लिए पानी और साबुन से धोएं।
    12. कक्षों को फिर से उपयोग करने से पहले पूरी तरह सूखने दें।

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Representative Results

सीएस एक्सपोजर की मुख्य पहचान में से एक एम्फिसिमा है जो फेफड़ों में वायु थैली (अल्वियोली) के नुकसान और विनाश की विशेषता है। इस प्रकार, प्रारंभिक प्रयोगों DIY प्रणाली के लिए सीएस के लिए दोहराया पूरे शरीर के जोखिम पर महिला चूहों के फेफड़ों में एम्फिसमेटस परिवर्तन भड़काने की क्षमता पर ध्यान केंद्रित किया । सीएस डॉसिंग रेजिमेन का चयन हमारे पूर्व प्रकाशनों के आधार पर किया गया था जिसमें हमने चूहों को सीएस के साथ इलाज करने और एम्फिसिमा 10 , 11 ,12,14,15, 16केआणविक रोगविज्ञान का अध्ययन करने के लिए यहां वर्णित DIY प्रणाली का उपयोग किया था । विशेष रूप से, चूहों को दैनिक फिल्टर के साथ चार वाणिज्यिक सिगरेट के धुएं से पूरे शरीर को उजागर किया गया था, जिसमें प्रत्येक सिगरेट के बीच में 10 मिनट के धुएं से मुक्त अंतराल, सप्ताह में पांच दिन 4 महीने10, 11,12,13,14,15,16की अवधि के लिए थे।

हेमेटॉक्सीलिन और ियोसिन (एचएंडई) -दाग वाले फेफड़ों के हिस्टोलॉजी ने वायु उपचारित चूहों(चित्रा 2 ए)की तुलना में सीएस के संपर्क में आने वाले चूहों में एल्विओली का विनाश दिखाया। समझौते में, एक अंधे फैशन में फेफड़ों के वर्गों के हिस्टोमॉर्मोमेट्रिक विश्लेषण से पता चला है कि वायु नियंत्रण(चित्रा 2B)की तुलना में सीएस के संपर्क में चूहों में मतलब रैखिक अवरोधन (एमएलआई) काफी अधिक था। जैसा कि उम्मीद थी, सीएस के लिए WBIS शरीर के वजन में एक बूंदभड़काती (चित्रा 2C)। उपरोक्त टिप्पणियों के अनुरूप सीएस-उजागर चूहों ने प्रतिरक्षा कोशिकाओं की बढ़ी हुई वायुमार्ग घुसपैठ के साथ-साथ मैट्रिक्स मेटललोप्रोटीज 9 और 12(एमएमपी9 और एमएमपी12)जीन अभिव्यक्ति को शामिल किया, जो ऊतक क्षति(चित्र 2डी, ई)17के लिए जिम्मेदार हैं। निकोटीन का मेटाबोलाइट और सीएस एक्सपोजर के लिए बायोमार्कर, को सीएस के 4 महीनों के संपर्क में आने वाले चूहों के सीरम में काफी ऊंचा होने का पता चला था लेकिन हवा में उजागर चूहों(चित्रा 2F)में अज्ञेय था।

शरीर की कोशिकाओं और ऊतकों पर सीएस एक्सपोजर के बहुआयामी प्रभाव की सराहना बढ़ रही है। एक पूर्व अध्ययन से पता चला है कि 6 घंटे के एक आहार के साथ सीएस के लिए चूहों के WBI जोखिम/ इसलिए , हमने अपने पूर्व स्थापित सीएस डोजिंग रेजिमेन 10 , 11 ,12 , 13 , 14 , 15,16का उपयोग करते हुए बोन मैरो होरोस्टेसिस को बदलने के लिए इस DIY प्रणाली की क्षमता का परीक्षण किया। एक्सपोजर के बाद, हमने फ्लो साइटोमेट्री(चित्रा 3 ए)का उपयोग करके बीएम आबादी का विश्लेषण किया। उम्मीदों के अनुसार, इस DIY प्रणाली पर सीएस के साथ चूहों के उपचार के परिणामस्वरूप बोन मैरो (बीएम) आबादी में परिवर्तन हुआ। विशेष रूप से, प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण ने एयर कंट्रोल(चित्रा 3बी)की तुलना में सीएस एक्सपोजर के 4 महीने के बाद हेमेटोपोइटिक स्टेम एंड प्रोजेनिटर (एचएसपीसी) आबादी में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई। इन टिप्पणियों का विस्तार, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणाली का उपयोग चूहों के सीएस के लिए पूरे शरीर जोखिम (सामग्री की मेजदेखें) भी एचएसपीसी आबादी में एक परिवर्तनदिखाया (चित्रा 3C)। वाणिज्यिक प्रणाली में उपयोग किए जाने वाले सीएस एक्सपोजर की डोजिंग रेजिमेन और अवधि और सीएस और हेमेटोपोसिस18 पर पूर्व प्रकाशन इस DIY प्रणाली से काफी अलग थे, जिसमें यह सुझाव दिया गया था कि बोन मैरो होरोस्टेसिस सीएस डोजिंग और उपचार आहार(चित्रा 3 सी)की एक विस्तृत श्रृंखला के प्रति अति संवेदनशील है। कुल मिलाकर, इस डेटा पर प्रकाश डाला गया है कि इस DIY प्रणाली एक किफायती विकल्प है कि नियंत्रित परिस्थितियों में सीएस के लिए चूहों को बेनकाब करने के लिए मज़बूती से कोशिकाओं और ऊतकों की एक श्रृंखला में इसके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 2
चित्रा 2: वायुमार्ग सूजन और चूहों के फेफड़ों के एम्फिसिमातस परिवर्तनों के सीएस-मध्यस्थता प्रेरण। (A)WT C57BL/6 चूहों से एचएंडई दाग फेफड़ों के वर्गों को 4 महीने के लिए एयर या सीएस के संपर्क में रखा गया है । 4x आवर्धन; इनसेट 20x आवर्धन। स्केल बार 200 माइक्रोन। (ख)इंटरल्वोलर वॉल डिस्टेंस के उपाय के रूप में मीन लीनियर इंटरसेप्ट (एमएलआई) को वायु या सीएस द्वारा इलाज किए गए चूहों से निष्पक्ष हिस्टोमॉर्मोमेट्री का उपयोग करके मापा गया था ।(सी)चूहों वजन हवा या सीएस जोखिम के 4 महीने के बाद । (घ)कुल और अंतर कोशिका ब्रोंकोसोलार लावेज (बाल) द्रव नियंत्रण (वायु) बनाम सीएस इलाज चूहों से मायने रखता है । टोटल ल्यूकोसाइट्स (टोटल), मैक्रोफेज (मैक), न्यूट्रोफिल्स (Neu), और लिम्फोसाइट्स (Lym) । वायु या सीएस के बाल तरल पदार्थ से वास्तविक समय पीसीआर द्वारा मात्रा निर्धारित(ई) Mmp9 और(एफ) Mmp12 mRNA की सापेक्ष अभिव्यक्ति चूहों को उजागर किया और Gapdh अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत । द = 4-5 चूहों/समूह । (जी)हवा या सीएस के संपर्क में चूहों में cotinine के सीरम का स्तर पिछले सीएस उपचार के बाद एलिसा 24 घंटे द्वारा मापा गया; द = 7-8 चूहों/समूह। सांख्यिकीय तुलना(बी, सी, डी, ई)अकर्च टी-टेस्टऔर(एफ)वेल्च के टी-टेस्टका उपयोग करके की गई थी । एसईएम ± मतलब दिखाया गया डेटा * * पी < ०.०१, ***p < ०.००१, ****p < ०.०००१ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: उम्मीदों के अनुरूप इस DIY प्रणाली का उपयोग चूहों के अस्थि मज्जा में सीएस-मध्यस्थता प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। (ए)फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एचएसपीसी और एचएसएससी की पहचान करने के लिए गेटिंग रणनीतियां। वंश मार्कर में शामिल हैं: Gr1, Mac1, B220, CD4, CD8, और Ter119। (ख)एचएससी और एचएससी का प्रतिशत सीएस एक्सपोजर के बाद पूरे बोन मैरो में इसी 4 महीने के रेजिमेन के साथ इस DIY सिस्टम का उपयोग कर रहा है । (ग)सीएस एक्सपोजर के बाद पूरे बोन मैरो में एचएसपीसी और एचएससी का प्रतिशत निम्नलिखित एक्सपोजर प्रक्रिया के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणाली का उपयोग करते हुए: 24 3RF4 अनुसंधान सिगरेट दैनिक, 12 पफ/सिगरेट, 5 दिन एक सप्ताह के लिए ४.५ सप्ताह की अवधि के लिए । (बी-सी) मान-व्हिटनी परीक्षण; द = 5 चूहों/समूह । 0.05 < मीन ± एसईएम के रूप में दिखाए गए डेटा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां हम चूहों के डब्ल्यूबीआई के लिए एक उपकरण के निर्माण के लिए आवश्यक जानकारी सीएस को प्रदान करते हैं। सिस्टम की स्थापना के बाद, यह गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है कि जांचकर्ता जानवरों में निकोटीन या कोटिनिन की वितरित खुराक के आधार पर प्रणाली को कैलिब्रेट करें। उपकरण में एक टाइमर और दबाव गेज होता है जिसका उपयोग सिगरेट पफ वॉल्यूम, पफ फ्रीक्वेंसी, संयुक्त धूम्रपान एक्सपोजर अवधि और प्रत्येक सिगरेट के बीच जानवरों को प्राप्त होने वाले बाकी अंतरालों को समायोजित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, दैनिक प्रशासित सिगरेट की वास्तविक संख्या टार और निकोटीन सामग्री के आधार पर भिन्न हो सकती है। अंत में, यह जरूरी है कि सिगरेट के धुएं के संपर्क में आने वाले किसी भी घटक को नियमित आधार पर साफ किया जाए ताकि उचित धुआं परिसंचरण और जानवरों के लगातार धुएं के संपर्क को सुनिश्चित किया जा सके ।

सीएस और एयर टॉक्सिकंट्स के साथ चूहों के इलाज के लिए कम से कम आधा दर्जन वाणिज्यिक प्रणालियां और प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं। हालांकि, इस उद्देश्य के लिए उपयोग किए जाने वाले अधिकांश उपकरणों के लिए वाणिज्यिक विक्रेताओं या विधानसभा के लिए इलेक्ट्रॉनिक्स और/या इलेक्ट्रिकल इंजीनियरिंग के गहन ज्ञान की आवश्यकता होती है । उन प्रणालियों में से कुछ WBI आहार को रोजगार देते हैं जबकि अन्य नाक-केवल उपचारों को शामिल करते हैं, लेकिन इन प्रणालियों की लागत $ 100,000 तक हो सकती है जिससे उन्हें अधिकांश प्रयोगशालाओं के लिए निषेधात्मक रूप से महंगा बना दिया जा सकता है।

इस DIY प्रणाली का लाभ निर्माण, कम लागत (~ $ 6,000), और बहुमुखी प्रतिभा में अंतर्निहित सादगी है। इसके अलावा, इस DIY उपकरण के निर्माण के लिए आवश्यक घटक वाणिज्यिक खुदरा विक्रेताओं और आपूर्ति श्रृंखला से आसानी से उपलब्ध हैं। हम एक्सपोजर प्रोटोकॉल और उपकरणों की एक सीमा को स्वीकार करते हैं सिगरेट के धुएं माउस जोखिम कक्षों में दिया घटकों को मापने के लिए dosimetry उपकरणों की कमी है। हालांकि, इस प्रणाली का डिजाइन एक नियंत्रित फैशन में काम करता है और हमने दिखाया कि इस चुने हुए धूम्रपान आहार में सीरम कॉटिनिन का स्तर सीएस-प्रेरित एम्फिसिमा20, 21के अन्य मुरीन मॉडलों के बराबर है। इसके अलावा, इस विधि को फेफड़ों और बीएम में सीएस के प्रभाव की निगरानी से परे अनुप्रयोगों के लिए दिखाया गया है । हमारे समूह ने इस प्रणाली का उपयोग इस बात का अध्ययन करने के लिए किया कि सिगरेट का धुआं आंतों के ऊतकों को कैसे प्रभावित करता है15. हमने हाल ही में इस प्रणाली को भी अनुकूलित किया है ताकि22फेफड़ों पर इलेक्ट्रॉनिक सिगरेट के संपर्क में आने के हानिकारक प्रभावों का अध्ययन किया जा सके ।

संक्षेप में, यह उपकरण सिगरेट पीने के हानिकारक प्रभावों की विशाल सरणी का अध्ययन करने के लिए एक सस्ती और आसानी से निर्माण एक्सपोजर प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

एआर, एक्सएच और पीई को एनआईएच ग्रांट R01HL140398 और एक गिलसन लॉन्गेनबॉग फाउंडेशन ग्रांट द्वारा समर्थित किया गया था। डीईएमएम और केके को एनआईएच ग्रांट R01HL136333 और R01HL134880 (KYK) द्वारा समर्थित किया गया था, और हेलिस मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन से अनुदान दिया गया था। डीईएमएम को हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट (एचएचएमआई) गिलम फैलोशिप फॉर एडवांस्ड स्टडी द्वारा भी समर्थित किया गया है। पीई भी सटीक पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान NIEHS T32 ES027801 फैलोशिप कार्यक्रम में प्रशिक्षण द्वारा समर्थित है । जेसी और एमएफ को एपिजेनेटिक्स और मॉलिक्यूलर कार्सिनोजेनेसिस विभाग से तंबाकू अनुसंधान कोष और एमडी एंडरसन में एपिजेनेटिक्स (स्कॉलर अवार्ड टू एमएफ) के लिए केंद्र द्वारा समर्थित किया जाता है। एफके और वाईजेड को एनआईएच ग्रांट R01 ES029442-01 और R01 AI135803-01 के साथ-साथ वीए मेरिट ग्रांट CX000104 द्वारा समर्थित किया जाता है । इस परियोजना को CPRIT कोर सुविधा सहायता पुरस्कार (CPRIT-RP180672), एनआईएच (CA125123 और RR024574) से वित्तपोषण के साथ बायलोर कॉलेज ऑफ मेडिसिन में साइटोमेट्री और सेल सॉर्टिंग कोर द्वारा समर्थित किया गया था, और जोएल एम सेडरस्ट्रॉम की सहायता।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 in fastener Lowes 756990
1/4 in Barbed Y connector VWR 89093-282
1/4 in straight tubing connector VWR 62866-378
1/8 hex nipple Lowes 877221
1/8 in threaded coupling fitting Lowes 877208
1/8 in threaded male adapter nipple fitting Lowes 877243
10/32 (M) threaded straight connector Bimba EB60
3/4 in 90-degree elbow CPVC fitting Lowes 22643
3/4 in chlorinated polyvinyl chloride (CPVC) pipe Lowes 23814
3/4 in CPVC cap Lowes 23773
3/4 in CPVC Drip irrigation female adapter Lowes 194629
3/4 in diameter CPVC male adapter Lowes 23766
8.5 L airtight container with lid (11.25in x 7.75in x 6 in) Komax N/A Listed as "Komax Biokips Large Bread Box | (280-oz) Large Storage Container"
Glass drain tube (1.75 in diameter x 8 in length) KIMAX 6500
Isonic Solenoid Valves Bimba V2A02-AW1
Marlboro Red 100's Marlboro N/A
Oxygen swivel barbed connector Global Medical Solutions RES002
Panasonic Timer LT4H-W Panasonic LT4HW Item was built-in the valve controller by Shepherd Controls & Associates
Pressure regulator Allied Electronics and Automation 70600552 Also listed as "Norgren R07-100-RGKA"
Rubber stopper # 1 (one hole) VWR 59581-163
Rubber stopper # 8.5 (one hole) VWR 59581-389
Scireq inExpose system Scireq and Emka Technologies N/A Commercial system used for comparison with our DIY WBIS
Straight barbed fitting (8mm opening) VWR 10028-872
Thread Sealant tape Lowes 1184243
Threaded port adaptor Bimba P1SA1
Timeter Aridyne 2000 Medical Air Compressor MFI Medical AHC-TE20
Timeter flowmeter Allied Healthcare Products 15006-03YP2 Also listed as "Puritan Air Meter"
Valve Control system Shepherd Controls and Associates N/A Company custom designed the valve control system for this model.
Vinyl pipes Vitality Medical RES3007

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References

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  22. Madison, M. C., et al. Electronic cigarettes disrupt lung lipid homeostasis and innate immunity independent of nicotine. Journal of Clinical Investigation. 129, 4290-4304 (2019).

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 164 सिगरेट का धुआं हेमेटोपोइसिस एम्फिसिमा हेमेटोपोइटिक स्टेम और जनक कोशिकाएं बोन मैरो सीओपीडी
एक पूरे शरीर साँस लेना प्रणाली का उपयोग कर चूहों में सिगरेट धुआं जोखिम
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Morales-Mantilla, D. E., Huang, X.,… More

Morales-Mantilla, D. E., Huang, X., Erice, P., Porter, P., Zhang, Y., Figueroa, M., Chandra, J., King, K. Y., Kheradmand, F., Rodríguez, A. Cigarette Smoke Exposure in Mice using a Whole-Body Inhalation System. J. Vis. Exp. (164), e61793, doi:10.3791/61793 (2020).

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