Na era da imunoterapia e do perfil genômico de célula única, a biologia do câncer requer novas ferramentas in vitro e computacionais para investigar a interface tumor-imune em um contexto espaço-temporal adequado. Descrevemos protocolos para explorar co-culturas microfluídicas imunes a tumores em cenários 2D e 3D, compatíveis com monitoramento dinâmico e multiparamétrico de funções celulares.
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Artigo de método
Modelos de Co-Cultura Microfluídica para Dissecar a Resposta Imune em Microambientes Tumorais in vitro
Neste artigo
Resumo
Resumo
Modelos complexos de doenças exigem ferramentas de ponta capazes de fornecer insights fisiologicamente e patologicamente relevantes e acionáveis e desvendar processos invisíveis de outra forma. Ensaios avançados de células imitando de perto o cenário in vivo estão se estabelecendo como novas maneiras de visualizar e medir a interação bidirecional tumor-hospedeiro que influencia a progressão do câncer. Descrevemos aqui dois protocolos versáteis para recriar co-culturas 2D e 3D altamente controláveis em microdispositivos, mimetizando a complexidade do microambiente tumoral (TME), sob imunovigilância natural e induzida por terapia. Na seção 1, um cenário experimental é fornecido para monitorar o crosstalk entre células tumorais aderentes e populações imunes flutuantes, por microscopia de lapso de tempo de campo brilhante. Como cenário aplicativo, analisamos os efeitos de tratamentos antineoplásicos, como os chamados indutores imunogênicos de morte de células cancerígenas, sobre o recrutamento e ativação de células imunes. Na seção 2, microambientes 3D imunes a tumores são montados em um layout competitivo. A infiltração imune diferencial é monitorada por instantâneos de fluorescência até 72 h, para avaliar estratégias terapêuticas combinadas. Em ambos os cenários, as etapas de processamento de imagem são ilustradas para extrair uma infinidade de parâmetros de células imunes (por exemplo, migração e interação de células imunes, resposta a agentes terapêuticos). Esses métodos simples e poderosos podem ser adaptados para simular a complexidade da EMT, abrangendo a heterogeneidade e plasticidade dos subtipos de câncer, estroma e células imunes, bem como suas interações recíprocas como impulsionadores da evolução do câncer. A conformidade dessas tecnologias em rápida evolução com imagens de alto conteúdo de células vivas pode levar à geração de grandes conjuntos de dados informativos, trazendo novos desafios. De fato, o triângulo "co-culturas/microscopia/análise avançada de dados" estabelece o caminho para uma parametrização precisa do problema que pode auxiliar protocolos terapêuticos feitos sob medida. Esperamos que a integração futura do on-a-chip imune ao câncer com a inteligência artificial para processamento de alto rendimento sinergia um grande passo à frente na alavancagem dos recursos como ferramentas preditivas e pré-clínicas para oncologia de precisão e personalizada.
Introdução
A evolução de diferentes ramos da medicina como disciplinas experimentais tem dependido da capacidade de manipular a população celular e as funções dos órgãos sob condições controladas1. Tal habilidade tem suas raízes na disponibilidade de modelos mensuráveis capazes de recapitular processos que acontecem em nosso corpo.
Na era da imunoterapia e do perfil genômico de célula única2, a biologia do câncer precisa aproveitar modelos emergentes in vitro e computacionais para investigar a interface tumor-imune em um contexto espaço-temporal adequado2,3.
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Protocolo
1. Projeto de chips para co-culturas 2D de células aderentes e flutuantes
NOTA: O layout da co-cultura 2D (Figura 1A-C) é caracterizado por três câmaras (100 μm de altura) interligadas por dois conjuntos de matrizes de microcanais (500 x 12 x 10 μm3, L×W×H). A câmara intermediária forma dois compartimentos fechados sem saída que bloqueiam o transbordamento de células imunes flutuantes para o local do tumor durante a etapa de carregamento 2.5. Esse tipo de dispositivo é útil para medidas bidimensionais em tempo real da motilid....
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Resultados
A infiltração imune tumoral é um parâmetro da resposta antitumoral do hospedeiro. Os tumores são heterogêneos na composição, densidade, localização e estado funcional dos leucócitos infiltrantes, cujas interações com células cancerosas podem fundamentar informações clinicamente relevantes para prever o curso da doença e a resposta à terapia. Nesse sentido, tecnologias microfluídicas poderiam ser utilizadas como ferramentas complementares e privilegiadas in vitro para explorar o contexto imunológico de tumores, bem como m.......
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Discussão
Os métodos descritos tentam desenhar uma abordagem geral para recapitular, com grau de complexidade modulável, dois aspectos significativos no campo da oncoimunologia, que podem se beneficiar da adoção de modelos in vitro mais relevantes. O primeiro envolve o lado da população de células tumorais, onde o tratamento de características de células únicas pode levar a uma melhor descrição da heterogeneidade e significado biológico e clínico correlacionado, incluindo resistência à terapia, propensão à metástase, células-tronc.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar. A AS é apoiada pela Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 #18418) e pelo Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273). GS e FM são apoiados pela Associação Italiana para Pesquisa do Câncer (AIRC) no. 21366 para G.S.).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Materiais de cultura de células Tubos de | |||
| 50 mL | Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO | CLS430828 | tubos de centrífuga |
| 5-aza-2'-desoxicitidina DAC | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | A3656 | Agente hipometilante de DNA |
| Placas de 6 poços | Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO Placas de | cultura | de CLS3506 |
| 75 cm2 frasco | tratado com cultura de célulasCorning, Nova York, NY | 430641U | frascos |
| de cultura A365M | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | CVCL_B222 | linha celular de melanoma humano |
| Cloridrato de doxorrubicina | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | D1515 | antibiótico antraciclina |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM | EuroClone Spa, Milão, Itália | ECM0728L | Meio de cultura para células SK-MEL-28 |
| Tampão fosfato salino de Dulbecco sem cálcio sem magnésio | EuroClone Spa, Milão, Itália | ECB4004L | solução tampão salina |
| Soro bovino fetal | EuroClone Spa, Milão, Itália | ECS0180L | auxiliar para cultura celular |
| Ficoll | GE-Heathcare | 17-1440-02 | separação de células mononucleares do sangue humano. |
| hemocitômetro | Neubauer | ||
| Frascos heparinizados | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | Frascos para coleta de sangue venoso | |
| interferon alfa-2b | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | SRP4595 | citocina humana recombinante |
| L-Glutamina 100X | EuroClone Spa, Milão, Itália | ECB3000D | auxiliar para cultura |
| de célulasNitrogênio | |||
| Meio de separação de células linfólitas | Cedarlane Labs, Burlington, Canadá | Separação de linfócitos por centrifugação por gradiente de densidade | |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS, Oslo, Noruega | ||
| Matrigel | Corning, Nova York, NY | 354230 | fator de crescimento reduzido matriz de membrana basal |
| MDA-MB-231 | Coleção de Cultura de Tipo Americano (ATCC), Manassas, VA | Linha celular de | câncer de mama humano |
| Penicilina/ Estreptomicina 100X | EuroClone Spa, Milão, Itália | ECB3001D | auxiliar para cultura de células |
| Auxiliar de pipeta | Drummond Scientific Co., Broomall, PA | 4-000-201 | Manuseio de líquidos |
| PKH26 Ligante de células fluorescentes vermelho | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | PKH26GL | corante de células fluorescentes vermelhas |
| PKH67 Ligante de células fluorescentes verde | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | Corante | de células fluorescentes verde PKH67GL |
| RPMI-1640 | EuroClone Spa, Milão, Itália | ECM2001L | de células MDA-MB-231 |
| (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) | Corning-Millipore-Sigma; St. Louis, MO | CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490 | Manuseio de |
| líquidos pontas estéreis (1-10 μ L, 10-20 μ L, 20-200 μ L, 1000 μ L) | EuroClone Spa, Milão, Itália | ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 | dicas para micropipeta |
| Temporizador | |||
| Solução Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | 15250061 | coloração celular para avaliar a viabilidade celular |
| Tripsina | EuroClone Spa, Milão, Itália | ECM0920D | reagente de dissociação para células |
| Equipamento de cultura celular | |||
| EVOS-FL | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | Microscópio fluorescente para células vivas | |
| Incubadora de cultura de células humificadas | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | 311 Forma de Aquecimento Direto COIncubator; TC 230 | Incubação de culturas de células a 37 &graus; C, 5% CO2 |
| Juli Microscópio | Nanoentek | ||
| Refrigerador de laboratório (4 ° C) | |||
| (Classe II) | Steril VBH 72 MP | Capa de fluxo laminar | |
| Microscópio óptico | Zeiss | ||
| Centrífuga refrigerável | Beckman Coulter | ||
| Banho | |||
| < forte> materiais de microfabricação | |||
| 3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes) | Sigma Aldrich | A3648 | agente de silanização para ligação de PDMS a lamínula de plástico |
| Máscaras de quartzo de cromo / 4"x4", HRC / No AZ | MB W & A, Máscaras ópticas da Alemanha | para fotolitografia | |
| Lamínula de vidro, D 263 M Vidro Schott, (170 ± 5 µ m) | Ibidi, Alemanha | 10812 | |
| Solução de peróxido de hidrogênio 30% | Reagentes Carlo Erba | 412081 | reagentes para solução de piranha |
| Metil isobutilcetona | Reagentes Carlo Erba | 461945 | PMMA e-beam resist developer |
| Lâminas de vidro para microscópio (Pacote de 50 lâminas) 76,2 mm x 25,4 mm | Substratos da marca Sail | 7101 | para colagem de chips |
| Miltex Biopsy Punch com êmbolo, ID 1.0mm | Tedpella | dermal biopsy punches para reservatórios de chip | |
| PMMA 950 kDa | Allresist, Alemanha | AR-P. 679.04 | Positivo eletrônico resiste para padronização de máscaras |
| ópticas Polímero não tratado lamínulas | Ibidi, Alemanha | 10813 | substratos para colagem de chips |
| Prime CZ-Si Wafer, 4", (100), Boro Dopado | Gambetti Xenologia Srl, Itália | 30255 | |
| Propan-2-ol | Carlo Erba Reagents | 415238 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Sigma Aldrich | 484431-4L | SU-8 resiste desenvolvedor SU-8 |
| 3005 | Micro resist technology,Alemanha | C1.02.003-0001 | Negativo Fotorresiste |
| SU-8 3050 | Micro resiste tecnologia, Alemanha | C1.02.003-0005 | Fotorresistes |
| negativos Conjunto de Biopunch, ID 4,0 mm, 6,0 mm, 8,0 mm | Tedpella | 15111-40, 15111-60, 15111-80 | punções de biópsia dérmica para reservatórios de cavacos |
| Ácido sulfúrico 96% | Carlo Erba Reagentes | 410381 | reagentes para solução de piranha |
| SYLGARD 184 Kit de elastômero de silicone | Dowsil, Dow Corning | 11-3184-01 | Elastômero de silicone (PDMS) |
| Trimetilclorossilano (TMCS) | Sigma Aldrich | 92360-100ML | agente de silanização para mestres |
| < forte > equipamento de microfabricação< / forte > | |||
| 100 kV e-beam litografia | Raith-Vistec EBPG 5HR | ||
| placa de aquecimento | |||
| Sistema de litografia óptica | EV-420 alinhador | ||
| de gravação de íons reativos | Oxford plasmalab 80 plus sistema | ||
| Dessecador |
Referências
- Abbas, A. K., L, A. H., P, S. Cellular and Molecular Immunology, Ninth Edition. , (2018).
- Eisenstein, M. Cellular censuses to guide cancer care. Nature. , (2019).
- Cancer Cell. Models for Immu....
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Reimpressões e permissões
