Imaging a fluorescenza risolta nel tempo e analisi dell'invasione delle cellule tumorali nel modello sferoide 3D

Louisiane Perrin; Theodore Tucker; Bojana Gligorijevic

doi:10.3791/61902

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Articolo metodologico

Imaging a fluorescenza risolta nel tempo e analisi dell'invasione delle cellule tumorali nel modello sferoide 3D

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DOI:

10.3791/61902

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30 gennaio 2021

Louisiane Perrin¹ , Theodore Tucker¹ , Bojana Gligorijevic¹^,²

¹Bioengineering Department, Temple University, ²Cancer Biology Program, Fox Chase Cancer Center

In questo articolo

Sommario

Presentato qui è un protocollo per la fabbricazione di un dispositivo di imaging sferoide. Questo dispositivo consente l'imaging a fluorescenza dinamica o longitudinale degli sferoidi delle cellule tumorali. Il protocollo offre anche una semplice procedura di elaborazione delle immagini per l'analisi dell'invasione delle cellule tumorali.

Abstract

L'invasione delle cellule tumorali dal tumore primario nei tessuti sani adiacenti è un primo passo nella metastasi. Le cellule tumorali invasive rappresentano una sfida clinica importante perché non esiste un metodo efficiente per la loro eliminazione una volta avviata la loro diffusione. Una migliore comprensione dei meccanismi che regolano l'invasione delle cellule tumorali può portare allo sviluppo di nuove terapie potenti. A causa della loro fisiologica somiglianza con i tumori, gli sferoidi incorporati nel collagene sono stati ampiamente utilizzati dai ricercatori per studiare i meccanismi che regolano l'invasione delle cellule tumorali nella matrice extracellulare (ECM). Tuttavia, questo saggio è limitato da (1) una mancanza di controllo sull'incorporamento degli sferoidi nell'ECM; (2) costo elevato del collagene I e delle stoviglie di fondo in vetro, (3) etichettatura immunofluorescente inaffidabile, a causa dell'inefficiente penetrazione di anticorpi e coloranti fluorescenti e (4) elaborazione delle immagini dispendiosa in termini di tempo e quantificazione dei dati. Per affrontare queste sfide, abbiamo ottimizzato il protocollo sferoide tridimensionale (3D) per immaginire cellule tumorali etichettate fluorescentmente incorporate nel collagene I, utilizzando video time-lapse o imaging longitudinale, e analizzare l'invasione delle cellule tumorali. In primo luogo, descriviamo la fabbricazione di un dispositivo di imaging sferoide (SID) per incorporare sferoidi in modo affidabile e in un volume minimo di collagene I, riducendo il costo del saggio. Successivamente, delimitiamo i passaggi per l'etichettatura a fluorescenza robusta di sferoidi vivi e fissi. Infine, offriamo una macro Fiji facile da usare per l'elaborazione delle immagini e la quantificazione dei dati. Complessivamente, questa semplice metodologia fornisce una piattaforma affidabile e conveniente per monitorare l'invasione delle cellule tumorali nel collagene I. Inoltre, questo protocollo può essere facilmente modificato per soddisfare le esigenze degli utenti.

Introduzione

Durante la progressione del cancro, le cellule tumorali possono acquisire un fenotipo mobile e invasivo, consentendo loro di sfuggire alla massa tumorale e invadere nei tessuti^{circostanti 1}. Alla fine, queste cellule tumorali invasive possono raggiungere e crescere all'interno degli organi secondari, un processo chiamato metastasi^{tumorale 1}. La metastasi causa più del 90% dei decessi correlati al cancro². Una ragione di ciò è che, mentre i tumori localizzati sono clinicamente gestibili, non esistono metodi efficienti per l'eliminazione delle cellule tumorali invasive una volta che si è verificata ....