Summary
Presentato qui è un protocollo per la fabbricazione di un dispositivo di imaging sferoide. Questo dispositivo consente l'imaging a fluorescenza dinamica o longitudinale degli sferoidi delle cellule tumorali. Il protocollo offre anche una semplice procedura di elaborazione delle immagini per l'analisi dell'invasione delle cellule tumorali.
Abstract
L'invasione delle cellule tumorali dal tumore primario nei tessuti sani adiacenti è un primo passo nella metastasi. Le cellule tumorali invasive rappresentano una sfida clinica importante perché non esiste un metodo efficiente per la loro eliminazione una volta avviata la loro diffusione. Una migliore comprensione dei meccanismi che regolano l'invasione delle cellule tumorali può portare allo sviluppo di nuove terapie potenti. A causa della loro fisiologica somiglianza con i tumori, gli sferoidi incorporati nel collagene sono stati ampiamente utilizzati dai ricercatori per studiare i meccanismi che regolano l'invasione delle cellule tumorali nella matrice extracellulare (ECM). Tuttavia, questo saggio è limitato da (1) una mancanza di controllo sull'incorporamento degli sferoidi nell'ECM; (2) costo elevato del collagene I e delle stoviglie di fondo in vetro, (3) etichettatura immunofluorescente inaffidabile, a causa dell'inefficiente penetrazione di anticorpi e coloranti fluorescenti e (4) elaborazione delle immagini dispendiosa in termini di tempo e quantificazione dei dati. Per affrontare queste sfide, abbiamo ottimizzato il protocollo sferoide tridimensionale (3D) per immaginire cellule tumorali etichettate fluorescentmente incorporate nel collagene I, utilizzando video time-lapse o imaging longitudinale, e analizzare l'invasione delle cellule tumorali. In primo luogo, descriviamo la fabbricazione di un dispositivo di imaging sferoide (SID) per incorporare sferoidi in modo affidabile e in un volume minimo di collagene I, riducendo il costo del saggio. Successivamente, delimitiamo i passaggi per l'etichettatura a fluorescenza robusta di sferoidi vivi e fissi. Infine, offriamo una macro Fiji facile da usare per l'elaborazione delle immagini e la quantificazione dei dati. Complessivamente, questa semplice metodologia fornisce una piattaforma affidabile e conveniente per monitorare l'invasione delle cellule tumorali nel collagene I. Inoltre, questo protocollo può essere facilmente modificato per soddisfare le esigenze degli utenti.
Introduction
Durante la progressione del cancro, le cellule tumorali possono acquisire un fenotipo mobile e invasivo, consentendo loro di sfuggire alla massa tumorale e invadere nei tessuticircostanti 1. Alla fine, queste cellule tumorali invasive possono raggiungere e crescere all'interno degli organi secondari, un processo chiamato metastasitumorale 1. La metastasi causa più del 90% dei decessi correlati al cancro2. Una ragione di ciò è che, mentre i tumori localizzati sono clinicamente gestibili, non esistono metodi efficienti per l'eliminazione delle cellule tumorali invasive una volta che si è verificata la diffusione metastatica. Pertanto, l'emergere di cellule tumorali invasive e il passaggio da una malattia localizzata a una malattia invasiva sta ponendo una grande sfida clinica. Determinare come le cellule tumorali avviano e sostengono un comportamento invasivo può portare allo sviluppo di nuove terapie potenti.
Il modello sferoide 3D è una piattaforma ideale per indagare il comportamento mobile delle cellule tumorali in condizioni controllate, ma fisiologicamente rilevanti3. Infatti, in questo saggio, gli sferoidi delle cellule tumorali sono incorporati all'interno della matrice extracellulare (ECM), ad esempio collagene I, che imita un tumore semplificato. Quindi, l'imaging viene utilizzato per visualizzare l'invasione delle cellule tumorali dallo sferoide nella matrice di collagene. Tuttavia, più sfide limitano questa procedura.
La prima sfida si verifica nella fase di incorporamento, dove la matrice di collagene liquido può diffondersi sulla superficie del piatto, facendo toccare lo sferoide sul fondo del piatto. Di conseguenza, le cellule dello sferoide si diffondono sulla superficie bidimensionale (2D), rompendo la morfologia tridimensionale (3D) dello sferoide. Aumentare il volume del collagene è una soluzione efficiente, ma costosa. Per evitare che le cellule si diffondano sulla superficie 2D, pur mantenendo un volume minimo di collagene, abbiamo sviluppato un dispositivo di imaging sferoide (SID) delimitando un inserto in polidimetilossano a 3 fori (PDMS) spesso 1 mm su un piatto inferiore di vetro.
La seconda sfida del saggio sferoide è l'etichettatura delle cellule tumorali negli sferoidi, che è limitata dalla scarsa penetrazione di anticorpi e coloranti fluorescenti, un effetto che aumenta con le dimensioni dello sferoide. Mentre la soluzione ideale per etichettare le cellule è la creazione di linee cellulari che esprimono stabilmente proteine fluorescenti, questa opzione è per lo più limitata alle linee cellulari immortalate ed è limitata dalla disponibilità di chimere proteiche fluorescenti. Qui descriviamo un protocollo ottimizzato per la colorazione immunofluorescenza di sferoidi fissi, nonché l'uso efficiente di un colorante citoplasmatico per etichettare le cellule immediatamente prima di incorporare lo sferoide.
La terza sfida del saggio sferoide è la mancanza di semplici macro delle Fiji per la quantificazione semi-automatizzata dell'invasione cellulare nel tempo. Per affrontare questa sfida, descriviamo una semplice metodologia per analizzare l'area dello sferoide nel tempo. Illustriamo i vantaggi di questo protocollo utilizzando le linee cellulari 4T1 e 67NR come esempi.
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Protocol
1. Fabbricazione di un dispositivo di imaging sferoide (SID) per ottimizzare l'incorporamento di sferoidi (durata 1 giorno)
- Creare il distanziale utilizzando una stampante 3D (Figura 1A, B e File supplementare 1).
- Pesare un rapporto 10:1 (wt/wt) di polimero di base:crosslinker in una tazza di plastica [ad esempio, 20 g di polimero di base etilbenzene e 2 g di crosslinker in resina siliconica per creare polidimetilsiloxano (PDMS)].
- Mescolare accuratamente la soluzione PDMS nella tazza di plastica utilizzando una pipetta monouso.
- Posizionare la tazza di plastica in una camera a vuoto per rimuovere le bolle d'aria dalla miscela. Rilasciare rapidamente la pressione del vuoto per rimuovere la piccola quantità di aria intrappolata sulla superficie della miscela e dissipare le bolle d'aria rimanenti.
- Incubare il distanziale stampato in 3D a 100 °C per 5 minuti per aumentarne la flessibilità.
- Pulire accuratamente le due lastre di vetro che verranno utilizzate per costruire accuratamente lo stampo PDMS pulendole con isopropanolo al 100%. Se le lastre di vetro sono state precedentemente utilizzate per lanciare PDMS, assicurarsi di rimuovere qualsiasi vecchio PDMS rimanente raschiando delicatamente le lastre di vetro con una lama di rasoio e pulendole con isopropanolo al 100%.
- Costruire lo stampo posizionando il distanziale stampato in 3D a filo tra le due lastre di vetro pulito.
- Sigillare lo stampo utilizzando grandi clip leganti sui bordi esterni delle piastre di vetro. Posizionare due clip del raccoglitore sul bordo inferiore e una sull'angolo superiore.
- Ispezionare la parte superiore dello stampo per assicurarsi che il distanziale sia a filo con le piastre di vetro. Ciò garantisce che non saranno presenti deformazioni e che verrà creato un foglio uniforme di PDMS.
NOTA: se il foglio risultante non ha uno spessore uniforme, le clip devono essere leggermente regolate. - Tagliare la punta di una pipetta usa e getta (~ 2 cm dalla punta) e aggiungere la miscela PDMS a una velocità lenta e costante all'angolo in alto a sinistra dello stampo. Versare lentamente il composto per evitare la creazione di grandi sacche d'aria.
- Posizionare lo stampo in una camera a vuoto per rimuovere le bolle d'aria che si sono formate durante il versamento.
- Curare il PDMS incubando lo stampo a 100 °C per 1 h.
- Recuperate lo stampo dall'incubatore e lasciatelo raffreddare al tatto.
- Rimuovere le clip del legante e le lastre di vetro dal distanziale contenente il PDMS polimerificato.
- Utilizzare una lama di rasoio per tagliare la guarnizione creata su tutti e quattro i lati dello stampo tra il distanziale e la piastra di vetro. Con tutti e quattro i lati tagliati, inizia a smontare lo stampo per rivelare il foglio PDMS nel distanziale.
- Rimuovere con cura il nuovo foglio PDMS dal distanziale utilizzando una pinzetta.
- Su un tappetino da taglio, perforare dischi PDMS di 17,5 mm di diametro dal foglio, quindi perforare tre fori di diametro 5,5 mm distribuiti uniformemente, utilizzando punzoni di biopsia di diverse dimensioni. Qui questi dischi PDMS a 3 fori sono indicati come "inserti" (Figura 1C).
NOTA: I tagli nonuniformi effettuati nel PDMS, o un legame difettoso tramite trattamento al plasma, possono causare perdite future. - Pulire ogni inserto rimuovendo delicatamente eventuali particelle di polvere utilizzando il nastro adesivo.
- Attaccare gli inserti su un pezzo di nastro doppio lato e avvolgere il nastro attorno al coperchio di una piastra di Petri di 10 cm.
- Posizionare il coperchio della piastra di Petri nella macchina al plasma, insieme alle stoviglie aperte in vetro da 35 mm.
- Attivare la superficie degli inserti e del vetro tramite trattamento al plasma per 1 min a 300 mTorr. È possibile utilizzare una bacchetta al plasma detenuta..
- Utilizzando le pinzette, attaccare rapidamente il lato positivo, cioè trattato, di un inserto (Figura 1D) alla parte di vetro di un piatto inferiore di vetro (Figura 1E). Ripetere per tutti i piatti.
- Utilizzare il dito e il pollice del puntatore per applicare una pressione uniforme mentre si ruota il piatto inferiore in vetro. Ciò garantirà una protezione stabile dell'inserto sul piatto inferiore in vetro.
- Incubare i SID(Figura 1F)a 60 °C per 20 min per rafforzare l'adesione tra vetro e PDMS.
- Eseguire un secondo ciclo di trattamento al plasma sui SID, utilizzando le stesse impostazioni del passaggio 1.21 o con la bacchetta strettae.a. Ciò renderà la superficie PDMS libera aderire alla poli-L-lisina nella soluzione di rivestimento (vedere 1.26).
- Preparare al momento le seguenti soluzioni.
- Soluzione di rivestimento: 1x PBS contenente 0,01% (vol/vol) poli-L-lisina [ad esempio, aggiungere 10 μL di 0,1% (vol/vol) poli-L-lisina a 90 μL di 1x PBS].
- Soluzione reticolare: Acqua distillata contenente 1x (vol/vol) glutaraldeide [ad esempio, aggiungere 10 μL di glutaraldeide 10x a 90 μL di acqua distillata].
- Soluzione di stoccaggio: 1x PBS contenente 10x (vol/vol) Penicillina-Streptomicina [ad esempio, aggiungere 1 mL di 100x Penicillina-Streptomicina a 9 mL di 1x PBS].
- Aggiungere 35 μL di soluzione di rivestimento per ogni foro e incubare per 1 h a temperatura ambiente.
- Aspirare la poli-L-lisina e sciacquare l'intero SID 3 volte con acqua distillata.
- Aggiungere 35 μL di soluzione di reticolazione per ogni foro incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare la soluzione di crosslinking e sciacquare l'intero SID 3 volte con acqua distillata.
- Aggiungere il 70% di etanolo in ogni SID e posizionare sotto la luce ultravioletta (UV) per 30 minuti.
- Sotto il cofano, aspirare l'etanolo e risciacquare il SID 3 volte con acqua distillata.
- Aggiungere 2,5 mL di soluzione di archiviazione per ogni SID.
NOTA: In questa fase, i SID possono essere conservati a 4 °C per una settimana. È stato osservato che la resistenza di legame tra PDMS e vetro diminuisce nel tempo. Oltre una settimana, si consiglia agli utenti di testare i SID per potenziali perdite prima dell'uso. Per fare ciò, aspirare la soluzione di stoccaggio e aggiungere 35 μL di 1x PBS in ogni foro. Dopo l'uso, gli inserti PDMS possono essere staccati dai piatti inferiori in vetro. Per ottenere una pulizia ottimale delle stoviglie di fondo in vetro, è necessario utilizzare diversi lavaggi con isopropanolo e acido cloridrico per rimuovere i residui di PDMS.
2. Formazione e incorporazione di sferoidi nel collagene (durata 4 giorni)
NOTA: Per l'imaging dal vivo di sferoidi, longitudinalmente o in video time-lapse, utilizzare una linea cellulare che esprime una proteina fluorescente citoplasmatica e/o nucleare. Se tale riga di cella è disponibile, attenersi alla procedura descritta in questa sezione. In alternativa, nella sezione 3, viene proposto un protocollo per etichettare le cellule tumorali negli sferoidi usando un colorante citoplasmatico.
- Formare sferoidi di cellule 4T1 e/o 67NR utilizzando la tecnica della goccia appesa, come descritto in precedenza4,5,6,7, con goccioline da 3.000 cellule/40 μL e un tempo di incubazione di 3 giorni. Aggiungere la soluzione di atelocollageno I bovino per ultima e mantenere tutte le soluzioni sul ghiaccio, in ogni momento.
- Identificare gli sferoidi formati correttamente utilizzando un microscopio a campo luminoso.
- Riempire un tubo conico da 15 ml con 8 ml di mezzo completo prerifuoco.
- Raccogliere gli sferoidi con una pipetta P1000 e trasferirli sul tubo conico da 15 ml. Bagnare la punta della pipetta pipetta pipettando un mezzo completo dentro e fuori per evitare che gli sferoidi si attacchino alle pareti interne della punta della pipetta e limitare la perdita di sferoide.
- Lasciare che gli sferoidi affondino sul fondo del tubo e lavare accuratamente gli sferoidi scambiando il mezzo. Ripeti due volte.
- Preparare una soluzione di collagene I da 5 mg/mL secondo le raccomandazioni del produttore (procedura di gelazione alternativa, vedi calcolo esemplare di seguito). Sostituire l'acqua distillata con mezzo completo. Nel calcolare il volume del mezzo da utilizzare, tenere conto del fatto che gli sferoidi saranno aggiunti in 20 μL di mezzo completo [ad esempio, per un SID, 3 x 30 + (3 x 30) x 20 % = 108 μL di 5 mg/mL collagene I è necessario (preparare il 20 % in più per tenere conto della perdita di pipettazione durante la manipolazione di fluidi viscosi); 22 μL di mezzo completo + 10,8 μL di 10x PBS + 1,2 μL di 1 M NaOH + 54 μL di 10 mg/mL di collagene I stock].
- Raccogliere tutti gli sferoidi in 20 μL di mezzo, utilizzando una pipetta P200, e aggiungerli alla soluzione collagene I preparata nel passaggio 2.6.
- Mescolare lentamente la soluzione pipettando su e giù per evitare l'eterogeneità nella concentrazione di collagene I, limitando la formazione di bolle. Tieni la soluzione sul ghiaccio.
- Rimuovere la soluzione di archiviazione dai SID e lavare 3 volte con 3 mL di 1x PBS. Dopo il lavaggio finale, lasciare i SID asciutti in modo da non diluire la soluzione di collagene I.
- Avviare un timer e erogare 30 μL della soluzione collagene I contenente uno sferoide in uno dei tre fori del SID. Assicurarsi visivamente che un singolo sferoide sia contenuto nei 30 μL.
- Ripetere il passaggio 2.10 altre due volte per riempire tutti e 3 i fori di un SID.
- Utilizzare una punta della pipetta da 10 μL per centrare di nuovo lo sferoide se si trova vicino al bordo PDMS. Se due o tre sferoidi finiscono erogati in uno dei fori, la stessa punta della pipetta può essere utilizzata per separare gli sferoidi l'uno dall'altro. Arrestare il timer.
NOTA: Spesso l'inversione del SID capovolta e capovolta, durante tutto il periodo della polimerizzazione e solidificazione del collagene I, assicura che lo sferoide sia posizionato al centro verticale dello strato ECM e previene l'invasione delle cellule in 2D. La frequenza di inversione (capovolgimento) deve essere massimizzata. Poiché la frequenza di capovolgimento è controllata dal "tempo di erogazione" dello sferoide misurato in 2.10-2.12, il tempo di erogazione dovrebbe essere ridotto al minimo. Nel nostro laboratorio, il tempo di erogazione è in media di 2 minuti. - Per centrare verticalmente lo sferoide nello strato di collagene, capovolgere il SID e incubare a 37 °C per il tempo di erogazione.
- Capovolgere il SID e incubare a 37 °C per il tempo di erogazione.
NOTA: Il tempo che gli sferoidi trascorrono nell'orientamento capovolto dovrebbe essere uguale al tempo trascorso nell'orientamento capovolto. - Ripetere i passaggi 2.13 e 2.14 per 30 min, fino a quando il collagene I polimerizza.
- Aggiungere 2,5 mL di medio/SID completo e, se necessario, acquisire un'immagine degli sferoidi per il punto di tempo iniziale.
- Ripetere i passaggi da 2.10 a 2.16 se vengono utilizzati più SID.
3. Etichettatura a fluorescenza degli sferoidi
- Imaging dal vivo (durata 6-7 giorni)
NOTA: Se è disponibile una linea cellulare che esprime una proteina fluorescente citoplasmatica e/o nucleare, seguire i passaggi descritti nella sezione 2. In alternativa, per l'etichettatura citoplasmatica, viene proposto il seguente protocollo.- Seguire i passaggi da 2.1 a 2.5 del protocollo descritto nella sezione 2.
- Diluire il colorante citoplasmatico a 25 μM in 200 μL di mezzo privo di siero.
NOTA: Mentre in questo esperimento viene utilizzato un colorante citoplasmatico rosso, qualsiasi altro colore disponibile dovrebbe essere adatto. Le cellule tumorali sono state etichettate all'interno di sferoidi utilizzando coloranti nucleari diluiti a 20 μM in 200 μL di mezzo privo di siero (vedi Tabella dei materiali). - Dopo il lavaggio finale, resopend sferoidi nella soluzione di colorante citoplasmatico o nucleare e incubare a temperatura ambiente per 20 min, protetti dalla luce.
NOTA: Con questo approccio, l'etichettatura delle cellule nel centro dello sferoide non sarà efficiente. Per ottenere l'etichettatura di tutte le cellule, l'incubazione può essere estesa durante la notte, posizionando il piatto su un rocker. Le alternative sono descritte nella discussione. - Lavare gli sferoidi 3 volte in mezzo completo.
- Procedere ai passaggi da 2.6 a 2.17 del protocollo descritto nella sezione 2.
- Sferoidi dell'immagine tramite imaging time-lapse ogni 10 minuti per 24-72 h (Figura 2), o tramite imaging longitudinale, ogni giorno, per un massimo di 7 giorni(Figura 3). Utilizzare un microscopio confocale a scansione laser, un obiettivo d'aria 10x (apertura numerica 0,4 e distanza di lavoro di 3,1 mm), 1024 x 1024 pixel, tempo di esposizione 8 μs /pixel, foro stenopeica 90 μm, 6 x 15 μm z-steps e 3 campi di visualizzazione ciascuno contenente uno sferoide.
NOTA: Per l'imaging time-lapse, utilizzare una potenza laser minima e dotare il microscopio di una camera ambientale con temperatura, umidità e controllo del gas. Coltura degli sferoidi incorporati a 37 °C per > 8 ore o durante la notte prima dell'imaging per ridurre al minimo il tempo al microscopio.
- Colorazione ad immunofluorescenza degli sferoidi (Durata 2 giorni)
NOTA: La procedura qui descritta è adattata e ottimizzata dai protocolli precedentementepubblicati 8,9. Questo metodo può essere utilizzato dopo il protocollo descritto nelle sezioni 2 e 3.1.- Preparare al momento le seguenti soluzioni.
- Soluzione di fissaggio: 1x PBS contenente 4% PFA (vol/vol) [ad esempio, aggiungere 5 mL di 16% (vol/vol) PFA a 15 mL di 1x PBS].
- Soluzione di fissaggio e permeabilizzazione: 1x PBS contenente il 4% di PFA (vol/vol) e lo 0,5% di Tritone X-100 (vol/vol) [ad esempio, aggiungere da 50 μL di Tritone X-100 a 10 mL di soluzione di fissaggio].
- Soluzione di blocco: 1x PBS contenente 1% FBS (vol/vol) e 1% BSA (wt/vol) [ad esempio, sciogliere 100 mg di BSA in 10 mL di 1x PBS, quindi aggiungere 100 μL di FBS].
- Soluzione di lavaggio: 1x PBS contenente lo 0,05% di Tween 20 (vol/vol) [ad esempio, aggiungere 25 μL di Tween 20 a 50 mL di 1x PBS].
- Rimuovere il supporto di coltura dai SID e lavare una volta con PBS 1x caldo.
- Aggiungere 2 mL di soluzione di fissaggio e permeabilizzazione per SID e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Rimuovere la soluzione di fissaggio e permeabilizzazione e aggiungere 2 mL di soluzione di fissaggio per SID e incubare a temperatura ambiente per 20 min.
- Lavare 3 volte con la soluzione di lavaggio.
- Aggiungere 2 mL di soluzione di blocco per SID e incubare a 4 °C per 24 ore con lievi scosse.
NOTA: In questa fase, i campioni possono essere incubati a 4 °C, durante il fine settimana. Si prega di notare che un tempo di blocco più lungo potrebbe interferire con la procedura di etichettatura dell'immunofluorescenza. - Diluire gli anticorpi primari nella soluzione di blocco.
- Aggiungere 150 μL di soluzione di blocco con anticorpi primari/pozzo in una piastra da 48 po' .
- Usando una pinzetta fine, staccare con cura la spina di collagene che contenga uno sferoide e trasferirlo in un pozzo. Ripetere se sono etichettati più sferoidi. Pulire qualsiasi liquido che potrebbe rimanere sulle pinzette quando si lavora con anticorpi diversi, per prevenire la contaminazione.
- Incubare durante la notte a 4 °C con lievi scosse.
- Aggiungere 300 μL di soluzione di lavaggio a pozzi vuoti e pieni.
- Trasferire con cura la spina di collagene che ho contenente uno sferoide in un pozzo di "lavaggio".
- Lavare 3 volte con soluzione di lavaggio per 2 ore, a temperatura ambiente e con lievi scosse.
NOTA: Trasferire le spine di collagene I contenenti uno sferoide, invece di aspirare le soluzioni, può aiutare a ridurre la perdita del campione e i danni al campione. - Diluire gli anticorpi secondari, 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e/o falloidina in soluzione di blocco.
- Aggiungere 150 μL di soluzione di blocco con anticorpi secondari, DAPI e/o falloidina per pozzo.
- Usando le pinzette, trasferire con cura il tappo di collagene contenente gli sferoidi nel pozzo. Ripetere se sono etichettati più sferoidi.
- Incubare a temperatura ambiente per 1 h con lievi scosse.
- Ripetere i passaggi 3.2.11 e 3.2.12.
- Lavare 3 volte con soluzione di lavaggio per 30 minuti, a temperatura ambiente con lievi scosse.
- Utilizzando una lama di rasoio, tagliare un inserto PDMS a 3 fori in tre parti in modo che ogni parte contenga un foro.
- Posizionare due pezzi di PDMS su uno scivolo al microscopio.
- Aggiungere una goccia di soluzione di montaggio utilizzando una punta P200 con l'estremità tagliata. Prevenire la formazione di bolle.
- Trasferire con cura un collagene che collego in ogni foro.
NOTA: Se lo sferoide è stato posizionato nella parte superiore del tappo di collagene, invertire il tappo di collagene in modo che lo sferoide finisca più vicino al coverslip di vetro. - Posizionare un coverslip sulla parte superiore e sigillare utilizzando il nastro adesivo.
- Lasciare asciugare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti, protetto dalla luce.
- Conservare i campioni a 4 °C, protetti dalla luce fino all'imaging.
- Preparare al momento le seguenti soluzioni.
4. Elaborazione delle immagini per analizzare l'invasione del cancro nel tempo
NOTA: il formato richiesto per questa macro è un'immagine x,y,t a canale singolo salvata come .tiff file.
- Se sono state acquisite più z slice ( ad esempio x,y,z,t image), aprirel'immagine nelle Fiji e selezionare Image | Stack | Progetto Z. Si consiglia di utilizzare l'opzione Intensità massima. In alternativa, è possibile utilizzare una singola sezione Z per eseguire la macro. Salvare l'immagine come .tiff file.
- Creare una cartella "Elaborazione" separata sul desktop.
- Selezionare File | Salva con nome | Sequenza di immagini. Utilizzare il formato TIFF, aggiornare il numero di cifre in base al numero di fotogrammi, selezionare la casella per utilizzare l'etichetta della sezione come nome file e selezionare OK. Selezionare la cartella "Elaborazione" creata nel passaggio 2.
- Aprire un'immagine dalla cartella "Elaborazione". Dovrebbe essere un'immagine x,y, corrispondente a un singolo punto di tempo.
- Selezionare Immagine | Regolare | Soglia automatica. Nel menu a discesa selezionare il metodo Prova tutto e selezionare la casella per gli oggetti bianchi su sfondo nero.
- Viene visualizzata un'immagine di montaggio che mostra il risultato per ogni metodo di soglia automatizzato.
- Identificare il metodo di soglia automatico migliore, ad esempio RenyIEntropy.
- Per confermare la scelta per il metodo di soglia automatica, aprire qualsiasi altra immagine dalla cartella "Elaborazione" e testare il metodo di soglia scelto utilizzando Image | Regolare | Soglia automatica.
- Chiudere tutte le immagini.
- Scaricare la macro SpheroidAreaTime (File aggiuntivo 2).
- Aprire la macro Fiji trascinando.
- Nella riga 58 aggiornare il metodo di soglia automatica in base alle esigenze.
- Nella riga 62 aggiornare l'intervallo di dimensioni in base alle dimensioni delle celle.
- Selezionare Esegui.
- Selezionare la cartella "Elaborazione" e digitare "Elaborazione" come cartella Padre, quindi selezionare OK.
- Una volta terminata la corsa, salvare la tabella "Riepilogo". La prima colonna indica il nome dell'immagine; la terza colonna indica l'area dello sferoide; la sesta, la settima e l'otto colonne specificano i parametri per un'ellisse montata sullo sferoide.
- La cartella "Elaborazione" ora contiene un'immagine elaborata per ogni punto di tempo, con l'estensione _SpheroidArea.
NOTA: se il centro dello sferoide è fioco, riempirlo di bianco usando gli strumenti di selezione, per tutti i punti di tempo, quindi procedere al passaggio 3. Allo stesso modo, lo spazio intorno allo sferoide può essere riempito di nero per "pulire" l'immagine. Se l'immagine è pulita, commentare la riga 61 per velocizzare l'esecuzione.
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Representative Results
Grazie alla sua biocompatibilità, PDMS è ampiamente utilizzato per la microfabbricazione di pozzi confinanti, francobolli e stampi, che ha rivoluzionato il micropatterning e i dispositivi microfluidici. Nel metodo qui descritto, viene utilizzato per creare SID, pozzi personalizzabili che ottimizzano l'incorporamento dello sferoide e la procedura di imaging. La figura 1 illustra i principali componenti utilizzati nella fabbricazione dei SID. Per lanciare lo stampo PDMS, viene stampato 3D un distanziale di 1 mm di spessore (Figura 1A,B), posizionato tra le due lastre di vetro, sigillato con clip di grandi dimensioni. Versare e cuocere PDMS nello spazio tra le piastre forma un foglio di PDMS dello spessore di 1 mm. Lo schema SID (Figura 1C) indica le dimensioni del dispositivo ottimale, tuttavia si verifica una leggera variazione nelle distanze dei fori, a causa della punzonatura manuale dei fori utilizzando punzoni di biopsia (Figura 1D). Figura 1D,F indica tagli circolari puliti con fori spaziati uniformemente all'interno dell'inserto PDMS.
L'uso dei SID facilita l'incorporamento efficiente, e quindi la registrazione dell'invasione delle cellule tumorali all'interno del collagene I utilizzando l'imaging time-lapse (Figura 2, Video 1) o longitudinale (Figura 3). Nonostante l'uso delle stesse frequenze di inversione per tutti i SID durante la polimerizzazione del collagene I, le posizioni dello sferoide all'interno della spina di collagene varieranno leggermente. Pertanto, è importante utilizzare un obiettivo con una lunga distanza di lavoro (>1 mm). Altrimenti, la messa a fuoco e l'imaging possono essere difficili per gli sferoidi posizionati vicino alla parte superiore della spina di collagene. Al contrario, gli sferoidi posizionati vicino al fondo del tappo di collagene, avranno cellule che si spostano sulla superficie del vetro e migrano sul vetro, invece di invadere la matrice di collagene I. I video di tali sferoidi devono essere scartati. Lo spessore del tappo di collagene, qui circa 800 μm, è controllato dal volume erogato in ogni foro del SID e regolato per le distanze di invasione che gli sferoidi esibisce in questo protocollo. Lo spessore del tappo di collagene può essere abbassato erogando un volume inferiore di collagene I in ogni foro del SID, quando si utilizzano sferoidi più piccoli o meno invasivi.
Per un'analisi corretta dell'invasione utilizzando la macro Figi, è fondamentale che le cellule tumorali siano correttamente etichettate nel corso della sessione di imaging. Come notato nel passaggio 4.17., il passaggio di elaborazione dell'immagine consente la correzione dell'immagine se l'etichettatura non è ottimale. Mentre illustriamo l'imaging longitudinale nel corso di 6 giorni (Figura 3), che richiede l'espressione stabile di proteine fluorescenti citoplasmatica e/o nucleare, un'imaging longitudinale simile potrebbe essere eseguita in un tempo più breve utilizzando l'etichettatura con coloranti.
Dopo l'imaging dal vivo, presentiamo alcuni risultati della procedura di immunoetichettatura per la caderina epiteliale (E-cadherina), cortactin e F-actin (Figura 4). In questi esempi, abbiamo usato le linee cellulari 4T1 e 67NR. La figura 5 mostra l'illustrazione passo-passo della procedura di elaborazione delle immagini utilizzando la macro Fiji per misurare l'area dello sferoide nel tempo.
Figura 1: Fabbricazione dei SID. (A) Rappresentazione schematica in alto del distanziale. (B) distanziale stampato in 3D. (C) Rappresentazione schematica in alto del SID. Un inserto PDMS a 3 fori (D) è legato a un piatto inferiore di vetro (E), creando il SID finale (F). Le dimensioni sono in millimetri. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Imaging dal vivo di sferoidi. Rappresentante 20 h e 40 h di punti di tempo dal Video 1, proiezione massima di uno sferoide 4T1. Le cellule 4T1 sono state etichettate usando un colorante citoplasmatico. Barra di scala, 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Imaging longitudinale degli sferoidi. Micrografie rappresentative (proiezione massima) di uno sferoide misto 4T1/67NR immaginato quotidianamente. Le cellule 4T1 e 67NR esprimono stabilmente rispettivamente il mScarlet citoplasmatico e la proteina fluorescente verde (GFP). Barra di scala, 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Imaging ad immunofluorescenza degli sferoidi. Sono state etichettate le micrografie rappresentative (proiezione massima) di uno sferoide 4T1 fissato 2 giorni dopo l'incorporamento nel collagene I. E-cadherin (ciano, A), cortactin (giallo, B) e F-actin (magenta, A e B). Barra di scala, 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi dell'elaborazione delle immagini. Illustrazione passo-passo della procedura di elaborazione delle immagini mediante la macro Fiji (A) per misurare l'area dello sferoide nel tempo (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: Il video rappresentativo di uno sferoide 4T1 immaginato ogni 10 minuti per 46 ore e 10 cellule 4T1 è stato etichettato utilizzando un colorante citoplasmatico. Barra di scala, 100 μm. Fare clic qui per scaricare questo video.
File supplementare 1: modello 3D del distanziale (file STL). Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 2: macro SpheroidAreaTime. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il distanziale stampato in 3D è stato progettato per creare fogli di PDMS spessi 1 mm che possono quindi essere utilizzati per creare facilmente varie forme di PDMS, come richiesto dalle applicazioni sperimentali. Grazie alla semplicità della sua fabbricazione e alla libertà di alterare il design, questo metodo di fusione PDMS è stato scelto per la progettazione iniziale del SID. Se è richiesto un elevato volume di SID, la produzione può essere resa più efficiente creando uno stampo stampato in 3D, che contiene già dischi PDMS con tre fori equamente distanziati e riducendo il processo a un unico passaggio. Ciò eliminerebbe la necessità di perforare ogni disco, insieme ai tre fori successivi, e ridurrebbe il tempo di preparazione complessivo.
Mentre il punzone a 3 fori è sviluppato per l'uso con piatti inferiori in vetro da 35 mm, sono disponibili altre dimensioni che consentono di ottenere più fori e quindi più sferoidi da immagini in parallelo. Inoltre, è disponibile in commercio anche vetro di copertura su misura che, in combinazione con supporti stampati in 3D, può consentire test sferoidi ad alta produttività. Con un tale approccio, il fattore limitante è la velocità di acquisizione dei dati, ad esempio, nella nostra imaging confocale time-lapse multicolore, l'acquisizione di stack 3D di un singolo sferoide richiede circa 2,5 minuti. Pertanto, l'acquisizione di pile 3D per 3 sferoidi nel SID richiede circa 8 minuti. Di conseguenza, per mantenere la nostra frequenza preferita di imaging a 10 minuti per stack, non possiamo aumentare il numero di fori nei SID.
Per registrare e quantificare l'invasione delle cellule tumorali viventi nel modello sferoide 3D, è possibile utilizzare l'imaging a campoluminoso 5. Tuttavia, la microscopia a fluorescenza è preferita, in quanto fornisce un maggiore contrasto e facilità e precisione nell'elaborazione delle immagini. Se la generazione di una linea cellulare che esprime una proteina fluorescente citoplasmatica e/o nucleare non è possibile, proponiamo l'uso dei coloranti citoplasmatici. Poiché il tempo di ritenzione dei coloranti citoplasmatici all'interno delle cellule è di tre giorni nelle nostre condizioni di imaging, le cellule devono essere etichettate dopo il periodo di 3 giorni in caduta sospesa e immediatamente prima dell'incorporamento. L'etichettatura delle cellule dopo l'incorporamento può etichettare in modo non specifico il collagene e ridurre l'etichettatura cellulare. L'imaging per più di 3 giorni dopo l'incorporamento richiede l'uso di un diverso protocollo di semina sferoide10 o linee cellulari che esprimono stabilmente proteine fluorescenti.
Abbiamo formato e immaginato con successo sferoidi contenenti da 60 a 5.000 celle/rilascio. I piccoli sferoidi sono ideali per registrare l'invasione in più giorni, poiché la loro intera area di invasione può facilmente adattarsi a un singolo campo visivo di obiettivi di ingrandimento più elevato (20x-30x). Inoltre, possono essere facilmente etichettati in tutto con coloranti citoplasmatici o nucleari. Infine, a causa della riduzione dello scattering, ogni cellula nello sferoide può essere visualizzato e segmentato. Tuttavia, i piccoli sferoidi sono appena visibili ad occhi nudi e possono richiedere un'etichettatura aggiuntiva con marcatori tissutali. Al contrario, gli sferoidi più grandi sono più facili da maneggiare, ma più suscettibili all'affondamento sul fondo del piatto, a causa del loro peso. Inoltre, le cellule nel centro dello sferoide non sono sempre etichettate quando si utilizzano coloranti o visibili utilizzando la microscopia confocale, che ha una profondità di penetrazione di circa 100 micrometri. Per visualizzare tutte le cellule tumorali in tutti i grandi sferoidi utilizzando l'imaging time-lapse, è possibile utilizzare la microscopia multifotonica, offrendo un ulteriore vantaggio della visualizzazione delle fibre di collagene per seconda generazione armonica (SHG) senza la necessità di etichettare. Inoltre, l'imaging può essere fatto con microscopia a fogli leggeri8,11,12, fornendo tempi di acquisizione delle immagini ridotti e quindi consentendo test sferoidi ad alta produttività, ma richiedendo anche una maggiore memorizzazione dei dati e un'elaborazione avanzata delle immagini. Se non sono necessari video time-lapse, la nostra procedura di etichettatura per sferoidi 3D fissi può essere ulteriormente combinata con la compensazioneottica 8,10. Inoltre, la criosezione degli sferoidi incorporati può eliminare i problemi con la penetrazione del colorante o dell'anticorpo durante l'etichettatura, così come la penetrazione della luce durante l'imaging. Nelle nostre mani, tuttavia, la criosezione di successo era limitata alle prime fasi di invasione e alle cellule non invasive, a causa delle sfide tecniche nella conservazione di filamenti invasivi lunghi e fragili.
Il nostro protocollo è anche compatibile con l'uso di coloranti nucleari, per etichettare le cellule tumorali all'interno degli sferoidi, consentendo il tracciamento a singola cellula dei dati time-lapse. Il plugin delle Fiji TrackMate13 può essere utilizzato per automatizzare il tracciamento cellulare ed estrarre i parametri di motilità delle singole celle, come velocità, velocità istantanea e persistenza.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare i membri di Temple Bioengineering per le preziose discussioni. Ringraziamo David Ambrose al flow cytometry core (Lewis Katz School of Medicine) per la sua assistenza allo smistamento cellulare e Tony Boehm dell'IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) per l'aiuto con la stampa 3D. Ringraziamo anche le nostre risorse di finanziamento: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 e R01 CA230777, tutto a BG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
References
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